TRAIL和EGFR配體寡肽與力達霉素輔基蛋白融合蛋白制備過程的優(yōu)化

朱大強，陳淑珍

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TRAIL和EGFR配體寡肽與力達霉素輔基蛋白融合蛋白制備過程的優(yōu)化

朱大強，陳淑珍

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室

對以包涵體形式表達的 TRAIL 和 EGFR 配體寡肽與力達霉素輔基蛋白融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 的制備過程進行優(yōu)化。

對大腸桿菌原核表達 Ec-LDP-TRAIL 目的蛋白的溫度、誘導物濃度、起始菌體密度及時間等條件進行優(yōu)化；在Ni2+親和層析純化蛋白過程中對樣品預處理以及純化緩沖液成分進行優(yōu)化；對純化后蛋白的分步透析復性過程進行一系列優(yōu)化，并通過基于 ELISA 的結(jié)合活性實驗分析 Ec-LDP-TRAIL 與腫瘤細胞的結(jié)合能力。

經(jīng)過工藝優(yōu)化后，純化后的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 純度達 95% 以上，復性后 LB 培養(yǎng)基活性蛋白收率約為 2.2 mg/L，與初始復性條件相比提高近 2 倍。復性后融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 顯示出能夠與人表皮癌 A431 和人大細胞肺癌 H460 細胞的結(jié)合活性。

融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 制備過程的優(yōu)化為后續(xù)研發(fā)和生產(chǎn)奠定了實驗基礎，同時也為其他以包涵體形式表達的基于 TRAIL 的抗腫瘤蛋白藥物的制備提供借鑒。

包涵體； 重組融合蛋白質(zhì)類； 蛋白質(zhì)復性； 腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是機體自身合成的一種細胞因子，主要通過細胞外凋亡途徑誘導細胞凋亡[1]，但在后期也有線粒體通路的參與。TRAIL 信號傳導通路是指以 TRAIL 為配體，通過與死亡受體 DR4/DR5 結(jié)合而啟動凋亡信號，最終誘導細胞凋亡[2-3]。由于 TRAIL 可選擇性誘導多種腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無毒性，是一種很有前景的抗癌藥物。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是具有酪氨酸激酶活性的細胞膜表面受體，EGFR 高表達與患者的預后不良、易復發(fā)及耐藥關系密切。目前，針對 EGFR 分子靶向治療已廣泛應用于各類腫瘤的治療，靶向EGFR 的抗體已經(jīng)成為有效的抗腫瘤藥物。已有研究表明，對 EGFR 通路的抑制能夠增強 TRAIL 的促細胞凋亡作用，也在一定程度上克服腫瘤細胞對于 TRAIL 的耐藥性[4-6]。因此，可采用 EGFR 配體寡肽（EC）的導向作用拮抗 EGFR 介導的信號傳導通路，從而增加腫瘤細胞對 TRAIL 的敏感性。TRAIL 和 EGFR 配體寡肽與力達霉素（lidamycin，LDM）輔基蛋白組成的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 是我室以 EGFR 和 DR4/DR5 為靶點，以對腫瘤細胞具有選擇性凋亡誘導作用的TRAIL 為活性“彈頭”，以烯二炔抗腫瘤抗生素力達霉素輔基蛋白 LDP 為輔運載體，通過 DNA 重組技術(shù)構(gòu)建并以包涵體形式表達的一種靶向性抗腫瘤融合蛋白?？稍隗w外與 LDM 的游離發(fā)色團 AE 重組，形成具有高效抗腫瘤活性的靶向性蛋白新藥 Ec-LDP- TRAIL-AE。Ec-LDP-TRAIL 和 Ec-LDP-TRAIL-AE 均已顯示出良好的體內(nèi)外抗腫瘤作用，具有一定的應用前景，因此，本文對此融合蛋白制備條件進行了優(yōu)化。

眾所周知，包涵體蛋白本身沒有活性，以包涵體形式表達的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL 需通過純化、復性等過程才能發(fā)揮對 EGFR 和 DR4/DR5 以及多種腫瘤細胞的生物學作用。當前，融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 制備存在問題主要表現(xiàn)為包涵體蛋白表達量低，包涵體溶解性差，在變性條件下提取的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 純度不高，復性效率低，復性后產(chǎn)物不均一等[7]。本研究針對實驗中存在的難點，優(yōu)化了融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 制備過程，為其后續(xù)研究與開發(fā)奠定了堅實基礎，也為其他以包涵體形式表達的基于 TRAIL 的靶向抗腫瘤藥物制備提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 改良型 DMEM、RPMI 1640 培養(yǎng)液為美國 Hyclone 公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；咪唑、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、還原型谷胱甘肽（GSH）為美國 Amresco 公司產(chǎn)品；HisTrap 預裝柱為美國 GE 公司產(chǎn)品；超濾離心管和 PVDF 膜為美國 Millipore 公司產(chǎn)品；脫脂奶粉為美國 BD 公司產(chǎn)品；Triton X-100、Tween-20 和精氨酸（L-Arg）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；anti-His-tag 小鼠單抗、HRP 標記羊抗小鼠 IgG 購自中杉金橋公司；0.45 μm 濾器購自北京北化黎明公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株 重組菌BL21(DE3)Star?/ pET30A 由本室構(gòu)建和保存。

1.1.3 細胞株 人表皮癌細胞 A431 和人大細胞肺癌細胞 H460，分別常規(guī)培養(yǎng)于含 10% FBS、100 μg/ml鏈霉素和 100 IU/ml 青霉素的改良型 DMEM 和 RPMI 1640 培養(yǎng)液中。

1.1.4 主要儀器 NBS Innova 43 落地式恒溫搖床、Centrifuge 5408R 臺式低溫離心機購自德國Eppendorf 公司；VC 750 超聲破碎儀購自美國Sonics 公司；MiniTrans 蛋白電泳儀購自美國 Bio-Rad 公司；ChemiImager 5500 凝膠成像系統(tǒng)購自美國 Alpha Innotech 公司；DU 800 核酸/蛋白分析儀購自美國Beckman Coulter 公司；Multiscan MK3 酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 表達條件的優(yōu)化

1.2.1.1 誘導溫度的優(yōu)化 接種含有表達載體 pET-的轉(zhuǎn)化菌，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至600= 1.0，每種培養(yǎng)物都分成四份，分別加入終濃度為 1.0 mmol/L 的 IPTG，將四份培養(yǎng)物分別置于 20、28、30 和 37 ℃條件下，搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 8 h 后進行 15% SDS-PAGE 分析。

1.2.1.2 誘導物濃度的優(yōu)化 接種含有表達載體 pET-的轉(zhuǎn)化菌，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至600= 1.0，以每管 2 ml 培養(yǎng)物分裝至7個試管中，加入 IPTG 至終濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 2.0 mmol/L，37 ℃搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 8 h 后進行 15% SDS-PAGE 分析。

1.2.1.3 誘導起始菌體密度的優(yōu)化 接種含有表達載體 pET-的轉(zhuǎn)化菌，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至600分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 和 2.5，加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，37 ℃搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 8 h 后進行15% SDS- PAGE 分析。

1.2.1.4 誘導時間的優(yōu)化 接種含有表達載體pET-的轉(zhuǎn)化菌，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至600= 1.0，以每管 2 ml 培養(yǎng)物分裝至 7 個試管中，每管均加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，37 ℃搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1、2、4、6、8、10 和12 h 后進行 15% SDS-PAGE 分析。

1.2.2 融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 包涵體預處理條件的優(yōu)化 離心收集Ec-LDP-TRAIL 表達菌，每克濕菌加 20 ml 裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L EDTA?2Na、0.1 mol/L NaCl、1% Triton-X 100，pH 8.0），4 ℃充分攪拌均勻；超聲波破碎儀破菌，8000 ×離心 15 min。沉淀用 100 ml 包涵體洗滌液 I（20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、2 mol/L 尿素，pH 8.0）洗滌 2 次，8000 ×離心 15 min。離心后沉淀用 100 ml 包涵體洗滌液II（20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、0.05% Triton X-100、5% 甘油，pH 8.0）洗滌 1 次，沉淀再用100 ml 包涵體洗滌液III（20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、2 mol/L 尿素，pH 8.0）洗滌 2 次，蒸餾水洗滌 1 次，均以 10 000 ×離心 15 min。最后所得沉淀用 20 ml 包涵體溶解緩沖液（20 mmol/L Tris-Hcl、8 mol/L 尿素、0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑）重懸，冰浴 1 h 完全溶解蛋白。16 000 ×離心 30 min，以除去不溶物質(zhì)，0.45 μm 濾膜過濾后用于親和柱層析純化。同時，SDS-PAGE 分析各步驟所收集樣品。

1.2.3 變性融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 純化條件篩選 采用固定化 Ni2+螯合層析法純化變性后 Ec-LDP-TRAIL。將 0.45 μm 濾器過濾后的包涵體上清經(jīng)用 1 × 結(jié)合緩沖液（8 mol/L尿素、20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl）平衡后的 HisTrap 預裝柱，依次加入 10 體積分別含 5、10、20、60 和 150 mmol/L 咪唑的 1 × 洗滌緩沖液（8 mol/L 尿素、20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl，pH 8.0），SDS-PAGE 分析各洗脫組分純度。

1.2.4 融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 復性條件優(yōu)化 采用分步透析法進行Ec-LDP-TRAIL 復性，初始條件為：純化后 Ec-LDP-TRAIL 用 1 × 結(jié)合緩沖液稀釋至 15 μmol/L，加入還原劑 β-巰基乙醇至終濃度 10 mmol/L，室溫靜置 20 min，用 50 倍體積透析復性液 I（20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、0.1 mol/L NaCl、6 mol/L 尿素，pH 8.0）透析過夜；再用尿素濃度遞減（順序依次為：3、1.5、1、0.5 和0 mol/L），其他組分與透析液I 相同的復性液透析過夜，并在尿素濃度為 1.5 mol/L 時加入 750 μmol/L GSSG 和 400 mmol/L L-Arg；最后得到的復性蛋白用 PBS（pH 7.4）透析 2 次，每次12 h，4 ℃、16 000 ×離心 30 min，收集上清進行還原和非還原 SDS-PAGE 分析。復性過程優(yōu)化以提高活性 Ec-LDP-TRAIL 含量為目標，在初始條件基礎上進行，所涉及因素包括在 1.5 mol/L 尿素透析階段時需添加的 GSSG、GSH 和 L-Arg 濃度。

1.2.5 采用 Western blot 法對融合蛋白 Ec-LDP- TRAIL 的鑒定 取 5 μg 經(jīng)過親和層析純化的融合蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉/Tris 鹽吐溫緩沖液（TBST，20 mmol/L Tris-HCl、137 mmol/L NaCl、0.1% Tween-20，pH 7.5）封閉過夜；用 1:1000 稀釋的抗 His-tag 小鼠單克隆抗體室溫孵育 2 h；TBST 洗 3 次，用1:1000 稀釋的 HRP 標記羊抗小鼠 IgG 室溫孵育 2 h；TBST 洗 3 次，按照 ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP 底物試劑盒說明書顯色，ChemiImager 5500 凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果。

1.2.6 融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 活性測定 采用基于 ELISA 結(jié)合實驗測定Ec-LDP-TRAIL 與腫瘤細胞的結(jié)合活性。人表皮癌細胞 A431 和人大細胞肺癌細胞 H460 分別以 1 × 104個/孔的密度接種于 96 孔板，37 ℃培養(yǎng) 24 h 后用 PBS 洗3 次，每次 3 min，加入 4 ℃預冷的 0.05% 戊二醛 50 μl/孔，于 4 ℃固定細胞 15 min；固定好的細胞用 PBS 洗 3 次后，用 1% BSA/PBS 溶液以 200 μl/孔于 4 ℃封閉過夜；用 PBST 緩沖液（含有 0.05% 的 Tween-20）洗 3次；將融合蛋白倍比稀釋加入到 96 孔板中，50 μl/孔，每個濃度設 3 個平行孔，37 ℃溫育 2 h；用 PBST 洗3 次后，加入抗 His-tag 單克隆抗體（1:2000 稀釋），50 μl/孔，37 ℃溫育 2 h；用 PBST 洗板 3 次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG 抗體（1:2500 稀釋），50 μl/孔，37 ℃溫育 2 h；用PBST 洗板 5 次，加入辣根過氧化物的底物反應液（鄰苯二胺: 0.1 mol/L檸檬酸:H2O2= 4 mg:10 ml:15 μl），100 μl/孔，室溫避光反應 10 min。以 2 mol/L 的硫酸 100 μl/孔終止反應，立即在酶標儀上測定492 nm 處的吸光值。根據(jù)酶標儀測定結(jié)果，扣除陰性對照值，然后以吸光值為縱坐標，以抗體濃度為橫坐標作劑量反應曲線。

2 結(jié)果

2.1 表達條件的優(yōu)化

如圖 1 所示，在 28、30和 37 ℃條件下誘導表達的目的蛋白量相當。由于大腸桿菌在較高溫度條件下生長速度更快，因此選擇誘導溫度為37 ℃，并且只檢測大腸桿菌包涵體中的目的蛋白。如圖 2 所示，在 0.4 mmol/L 的 IPTG 誘導條件下蛋白表達較多，因此選擇的誘導物為0.4 mmol/L 的 IPTG。從圖 3 可以看出，當600達到 0.6 時，Ec-LDP-TRAIL 蛋白的表達量較多，因此對于 Ec-LDP-TRAIL 蛋白選擇誘導起始菌體密度600= 0.6。當誘導超過2 h，大量表達包涵體蛋白且雜蛋白較少，因此選擇誘導時間為 2 h（圖 4）。綜上所述，Ec-LDP-TRAIL 蛋白的最優(yōu)誘導條件為誘導起始菌體密度600= 0.6，誘導物 IPTG 濃度為 0.4 mmol/L，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng) 2 h。

kD M 1 2 3 4 170130957255 43 34 26 17 包涵體Inclusion body

Figure 1 SDS-PAGE analysis of inclusion body expression at different temperature

kD M 1 2 3 4 5 6 7 8 170130957255433426 17 包涵體Inclusionbody

M：蛋白分子量標準品；1：未加 IPTG 誘導的大腸桿菌包涵體組分；

2 ~ 8：分別添加 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 2.0 mmol/L IPTG 誘導條件下的包涵體組分

M: Protein marker; 1: Inclusion body fraction ofcarrying the plasmid pET-before IPTG induction; 2 - 8: Inclusion body fraction ofcarrying the plasmid pET-after induction at 37 ℃ with 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 and 2.0 mmol/L IPTG, respectively

圖 2 以不同 IPTG 濃度誘導含有表達載體pET-的大腸桿菌包涵體組分的 SDS-PAGE 分析

Figure 2 SDS-PAGE analysis of inclusion body expression with different concentrations of IPTG

kD M 1 2 3 4 5 6 7 170130957255433426 包涵體Inclusionbody

Figure 3 SDS-PAGE analysis of inclusion body expression under different cell density

2.2 包涵體制備工藝與溶解緩沖液的確定

圖 5 表明，包涵體洗滌各步驟均能不同程度地去除一部分菌體雜蛋白，提示它們是包涵體制備工藝的重要組成部分。以往有報道用 6 mol/L 鹽酸胍作為包涵體溶解的變性劑，但考慮到鹽酸胍成本遠高于尿素，不利于科學研究和工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應用，因此選擇含有 8 mol/L 尿素的包涵體溶解液，融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 包涵體同樣能夠在較短時間內(nèi)溶解并達到較高純度。

2.3 變性融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 純化條件確定

圖 6 顯示，在 8 mol/L 尿素變性條件下，含5 和 10 mmol/L 咪唑的緩沖液并不能將目的蛋白 Ec-LDP-TRAIL 洗脫下來；含 20 mmol/L 咪唑的緩沖液洗脫下的組分除含有微量雜蛋白外，還含有少量 Ec-LDP-TRAIL，考慮到結(jié)合緩沖液中咪唑的含量應能夠最大限度洗脫下雜蛋白而最小限度洗脫目的蛋白的原則，因此在結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度為 20 mmol/L；含60 mmol/L 咪唑的1 × 洗滌緩沖液洗脫下的組分主要為 Ec-LDP-TRAIL，但所得 Ec-LDP-TRAIL 較少；含 150 mmol/L 咪唑的緩沖液洗脫下的組分為 Ec-LDP-TRAIL，無雜蛋白，因此，在 1 × 洗滌緩沖液中使用的咪唑濃度為 60 mmol/L，在 1 × 洗脫緩沖液中使用的咪唑濃度為 150 mmol/L。通過上述優(yōu)化后條件純化 Ec- LDP-TRAIL，可使其純度達 95% 以上。

kD M 1 2 3 4 5 6 7 170130957255433426 包涵體Inclusionbody

Figure 4 SDS-PAGE analysis of inclusion body expression at different induction time

kD M 1 2 3 4 5 6 7 8 170130957255433426

Figure 5 SDS-PAGE results of the preparation process of inclusion body

kD M 1 2 3 4 5 170130957255433426 17

Figure 6 SDS-PAGE results of the immobilized Ni2+affinity chromatography for the purification of fusion protein Ec-LDP- TRAIL

2.4 采用 Western blot 法對融合蛋白 Ec-LDP- TRAIL 的鑒定

圖 7 表明，復性 Ec-LDP-TRAIL 在非還原 SDS-PAGE 中分析時顯示為單一條帶，提示 Ec-LDP-TRAIL 為其單體形式；另外，本研究根據(jù) Ec-LDP-TRAIL 在 C-末端有 6 個組氨酸序列的特點，對其進行了 Western blot 驗證，結(jié)果表明其能夠與抗 His-tag 單抗起免疫反應，說明它們均具有完整 C-末端組氨酸結(jié)構(gòu)。

kD M 1 1 170130957255433426 17AB

Figure 7 Monomeric fusion protein Ec-LDP-TRAIL assayed by non-reduced SDS-PAGE (A) and Western blot (B)

2.5 融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 復性條件優(yōu)化

為提高復性后 Ec-LDP-TRAIL 含量，本研究對其透析復性條件進行了一系列優(yōu)化。表 1 結(jié)果顯示，當 GSH 濃度為 6 mmol/L、GSSG 濃度為 0.75 mmol/L、L-Arg 濃度為 0.4 mol/L 時，更有利于 Ec-LDP-TRAIL 復性，每升 LB 培養(yǎng)基可獲得 2.2 mg 復性后的活性蛋白，比對照組（0.7 mg/L）提高 2 倍；因此，優(yōu)化后的 Ec-LDP-TRAIL 分步透析復性條件為：在初始透析復性基礎上，GSH 濃度為 6 mmol/L，GSSG 濃度為 0.75 mmol/L，L-Arg 濃度為 0.4 mol/L。

表 1 復性液中添加GSH、GSSG 以及L-Arg 的正交設計優(yōu)化結(jié)果

OD4922.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 0.01 0.1 1 10 100 Ec-LDP-TRAIL (lg μmol/L)

Figure 8 The binding activity of fusion protein Ec-LDP- TRAIL to tumor cells A431 and H460 measured by ELISA assay

2.6 融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 對腫瘤細胞的結(jié)合活性

從圖 8 可知，隨著 Ec-LDP-TRAIL 濃度增加，人表皮癌細胞 A431 和人大細胞肺癌細胞H460 的值也逐漸增強，表明 Ec-LDP-TRAIL 對這兩種細胞均有結(jié)合活性。

3 討論

TRAIL 因其能夠選擇性誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而對正常細胞沒有毒性，從而成為當前抗腫瘤治療研究的熱點。目前國內(nèi)外眾多學者都在積極研究 TRAIL 重組蛋白在腫瘤治療領域中的應用，已有大量研究已經(jīng)表明，TRAIL 能誘導各種腫瘤細胞凋亡，如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、胸腺腫瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、骨肉瘤等，而系統(tǒng)毒性非常小[8]。與天然 TRAIL 相同，重組 TRAIL 可選擇性誘導多種腫瘤細胞凋亡，對正常細胞無毒性，是一種很有前景的抗癌藥物[9-10]。

本研究所構(gòu)建的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 利用 EGFR 配體寡肽的導向作用和 TRAIL 對腫瘤細胞的選擇性凋亡誘導作用，并以力達霉素輔基蛋白 LDP 為輔助運載體，經(jīng)基因重組技術(shù)構(gòu)建。此外，利用力達霉素可在體外進行發(fā)色團 AE 和輔基蛋白 LDP 拆分和組裝的特點，將游離發(fā)色團 AE 通過分子重建方法裝配進融合蛋白 Ec-LDP- TRAIL 中。因此，融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 通過靶向 EGFR 以及死亡受體 DR4/DR5發(fā)揮 TRAIL 的選擇性凋亡誘導作用和力達霉素高效抑瘤作用，從而提高腫瘤細胞對 TRAIL 敏感性以及降低力達霉素的副作用。這種雙重靶向和“彈頭”作用體現(xiàn)了腫瘤靶向治療的新策略。

重組蛋白在大腸桿菌中表達易形成包涵體是科研和生產(chǎn)中經(jīng)常遇到而且亟需解決的重點和難點問題。因此，為獲得高純度且有活性的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL，需要從包涵體表達、樣品處理、純化和復性四個方面對其制備過程進行優(yōu)化[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在包涵體蛋白表達過程中，表達條件——包括誘導溫度，誘導劑 IPTG 的濃度，初始菌體濃度以及表達時間，對外源蛋白表達量的高低都有一定的影響。因此對上述四種常見影響因素進行一系列優(yōu)化，最終確定 Ec-LDP-TRAIL 蛋白的最優(yōu)誘導條件為誘導起始菌體密度600= 0.6，誘導物 IPTG 濃度為 0.4 mmol/L，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)2 h，這為表達外源蛋白 Ec-LDP-TRAIL 提供了高效節(jié)能的發(fā)酵方案。另外，在包涵體制備過程中，用多種鹽溶液對包涵體分步洗滌，可有效去除包裹在包涵體周圍的大部分雜蛋白，而無菌水清洗不僅可溶解一部分雜蛋白，還能去除大量鹽離子和變性劑，為下一步變性包涵體蛋白的固定——Ni2+親和層析奠定基礎。確定了包涵體制備工藝后，本研究對固定化 Ni2+親和層析緩沖液中的咪唑濃度進行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在變性條件下，添加20 mmol/L 咪唑的結(jié)合緩沖液恰好可以將目的蛋白 Ec-LDP- TRAIL 洗脫下來的同時，還可以洗脫下大量的雜蛋白；添加60 mmol/L 咪唑于1 × 洗滌緩沖液中，能夠盡可能地將結(jié)合于層析介質(zhì)上的雜蛋白洗脫下來；而在1 × 洗脫緩沖液中加入150 mmol/L 咪唑，就足以洗脫下絕大部分的融合蛋白 Ec-LDP- TRAIL，提示咪唑濃度優(yōu)化也是變性包涵體蛋白純化不可忽略的一個重要步驟，尤其是在確定結(jié)合緩沖液中咪唑濃度時，不經(jīng)優(yōu)化就使用含咪唑濃度過高或者過低的緩沖液，均不利于最大限度得到純化的目的蛋白。

以包涵體形式存在的外源表達蛋白的復性是蛋白制備工藝的瓶頸所在[12]。本研究以活性融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 含量為指標，對透析復性液中的關鍵成分 GSH、GSSG 和 L-Arg 進行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些因素均能不同程度地影響融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 復性效率，且每一步優(yōu)化均可使活性蛋白含量提高 13% ~ 20%，提示融合蛋白Ec- LDP-TRAIL 復性是多因素共同作用的結(jié)果。

本研究通過對融合蛋白Ec-LDP-TRAIL 制備過程中所涉及的包涵體表達、樣品預處理、固定化 Ni2+螯合層析、透析復性等過程的優(yōu)化，使融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 含量達到 95%，并檢測到了一定的靶抗原結(jié)合能力。綜上，本研究為融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 生產(chǎn)制備及后續(xù)研究工作奠定了良好的條件和基礎，也為其他基于 TRAIL 的以包涵體形式表達的靶向蛋白藥物制備提供了相關實驗依據(jù)。

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Optimization of preparation process for the fusion protein consisting of TRAIL, epidermal growth factor receptor/EGFR peptide ligand and apoprotein of lidamycin

ZHU Da-qiang, CHEN Shu-zhen

To optimize the preparation process of the fusion protein Ec-LDP-TRAIL expressed in the form of inclusion body.

Based on the selective antitumor activity of TRAIL in tumor cells rather than normal cells, and the target of EGFR ligand peptide, we constructed a bi-specific fusion protein consisting of TRAIL, EGFR ligand peptide and lidamycin. Conditions of fermentation of engineering bacteria, preparation and dissolution of inclusion body, Ni2+affinity chromatography of the target protein and refolding through stepwise dialysis were investigated.

After optimization, the purity of fusion protein Ec-LDP-TRAIL was more than 95% by immobilized Ni2+affinity chromatography under denaturing conditions. Besides that, after optimization of the refolding process using orthogonal design, the yield of active fusion protein Ec-LDP-TRAIL was 2.2 mg from 1 L LB medium which was 2-fold higher than that of the initial refolding conditions. The purified fusion protein Ec-LDP-TRAIL could bind to both human epidermoid carcinoma A431 cells and human large cell lung carcinoma H460 cells.

Optimization of preparation process for Ec-LDP-TRAIL expressed as the form of inclusion body provides the experimental basis for the future development and production of the protein. Furthermore, it might serve as a relatively practical system for the preparation of other TRAIL-based proteins expressed in the form of inclusion body.

Inclusion bodies; Recombinant fusion proteins; Protein renaturation; TNF-related apoptosis-inducing ligand

CHEN Shu-zhen, Email: bjcsz@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.004

國家自然基金面上項目（81072664、81373437）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301-002-001-022）

陳淑珍，Email：bjcsz@imb.pumc.edu.cn

2013-11-15

Author Affiliation:Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union College, Beijing 100050, China