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    人載脂蛋白A-I表達(dá)上調(diào)劑的發(fā)現(xiàn)與活性研究

    2014-10-28 08:43:40杜郁賈曉健王麗王麗非姜華軍楊帆司書毅楊媛洪斌
    關(guān)鍵詞:熒光素酶培養(yǎng)液膽固醇

    杜郁,賈曉健,王麗,王麗非,姜華軍,楊帆,司書毅,楊媛,洪斌

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    人載脂蛋白A-I表達(dá)上調(diào)劑的發(fā)現(xiàn)與活性研究

    杜郁,賈曉健,王麗,王麗非,姜華軍,楊帆,司書毅,楊媛,洪斌

    100050 北京,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)生部抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(杜郁、賈曉健、王麗、王麗非、姜華軍、楊帆、楊媛、洪斌),國(guó)家新藥(微生物)篩選實(shí)驗(yàn)室(司書毅)

    篩選上調(diào)人載脂蛋白 A-I(ApoA-I)基因表達(dá)的新型活性化合物,并在表達(dá)和功能水平對(duì)其作用進(jìn)行研究。

    利用人 ApoA-I 基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行篩選;對(duì)發(fā)現(xiàn)的活性化合物在 ApoA-I 啟動(dòng)子水平進(jìn)行量效關(guān)系研究;利用實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè) ApoA-I mRNA 的表達(dá)水平;利用 Western blot、ELISA 和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) ApoA-I 的蛋白表達(dá);利用膽固醇流出試驗(yàn)檢測(cè) ApoA-I 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流的情況。

    從 20000 樣次化合物篩選中得到活性化合物 5238B-69,在一定濃度范圍內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的量-效關(guān)系,當(dāng)化合物濃度為 0.30 μg/ml 時(shí),上調(diào) ApoA-I 表達(dá)活性達(dá)到最高值(408%),EC50為 0.01 μg/ml。5238B-69 能顯著上調(diào) HepG2 細(xì)胞中 ApoA-I mRNA 的水平;同時(shí),Western blot 結(jié)果顯示 5238B-69 能增加 HepG2 細(xì)胞 ApoA-I 蛋白的表達(dá)。ELISA 結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,5238B-69 作用 48 h 時(shí),胞外 ApoA-I 水平增加了 48%,流式細(xì)胞檢測(cè)表明,5238B-69 作用 24 h 后,胞內(nèi) ApoA-I 蛋白水平增加了 21.4%。功能分析試驗(yàn)顯示,5238B-69 作用 HepG2 細(xì)胞上調(diào)生成的 ApoA-I,能促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW 264.7 內(nèi) [3H] 標(biāo)記的膽固醇的流出。

    得到一個(gè)具有上調(diào) ApoA-I 表達(dá)的活性化合物,在提高 ApoA-I 表達(dá)水平和生物學(xué)功能方面均有明顯的效果。

    載脂蛋白 A-I; 基因表達(dá)調(diào)控; 動(dòng)脈粥樣硬化; 轉(zhuǎn)錄水平

    血漿高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平偏低是心血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,在過去的三十年中,國(guó)內(nèi)外的研究人員一直尋求通過升高血漿中高密度脂蛋白膽固醇的水平來(lái)降低動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病的發(fā)生。隨著對(duì) HDL 生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn) HDL 是包括了一系列大小、形態(tài)、密度及結(jié)構(gòu)極不均一的脂蛋白顆粒,根據(jù)結(jié)構(gòu)組成上的異質(zhì)性,HDL 可分為多種亞型并表現(xiàn)有代謝和功能上的差異[1]。2006 年和 2012 年,兩個(gè)旨在升高血漿 HDL-C 水平的膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)抑制劑 torcetrapib 和 dalcetrapib(JTT-705)臨床試驗(yàn)分別遭遇失敗[2-3],引發(fā)了研究人員對(duì) HDL 復(fù)雜性與心血管病收益的一系列爭(zhēng)論,研究關(guān)注的焦點(diǎn)逐漸從升高 HDL-C的水平轉(zhuǎn)向提升 HDL-C 的功能。

    載脂蛋白 A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I)約占 HDL 蛋白組成的 70%,因而血漿ApoA-I 的濃度與 HDL-C 水平密切相關(guān)。同時(shí),ApoA-I 作為 ATP 結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-binding cassette-A1,ABCA1)的配體,能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中游離膽固醇的外流,從而起始 HDL 的生物合成,同時(shí)啟動(dòng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程,在肝外組織清除過多膽固醇的過程中發(fā)揮了重要作用。動(dòng)物體內(nèi)的研究表明,過表達(dá)人 ApoA-I 基因能顯著抑制小鼠體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化早期損傷——脂紋的形成[4],更重要的是,在動(dòng)脈粥樣硬化易感小鼠中,過表達(dá) ApoA-I 通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞 RCT 增加了糞便中膽固醇的排出,這有可能是其消退動(dòng)脈粥樣斑塊的潛在機(jī)制[5-6]。所以,ApoA-I 不僅是 HDL 的主要結(jié)構(gòu)蛋白,還是 HDL 發(fā)揮心血管保護(hù)功能的重要組成單位。因此,以 ApoA-I 為靶點(diǎn)的藥物被認(rèn)為是基于 HDL 的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物中極具應(yīng)用前景的治療策略[7]。為尋找能夠提高 ApoA-I 表達(dá)水平的活性化合物,作者在前期工作中構(gòu)建了 ApoA-I 基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型[8]。本研究在此模型的基礎(chǔ)上,對(duì)國(guó)家新藥(微生物)篩選實(shí)驗(yàn)室化合物庫(kù)進(jìn)行了20 000 樣次篩選,得到了結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物 5238B-69,對(duì)其生物活性進(jìn)行了研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株 HepG2 和小鼠的單核-巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 均為本室保存;ApoP- Luc HepG2 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[8]。

    1.1.2 主要試劑 Luciferase assay system 細(xì)胞裂解液和熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)、SV 總 RNA 提取試劑盒、TMB 單相發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó) Promega公司;Turbo script 1st-strand cDNA synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自原平皓生物技術(shù)有限公司;熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 試劑盒(Faststart universal SYBR green PCR master,ROX)購(gòu)自瑞士 Roche 公司;兔抗人 ApoA-I 多克隆抗體(178422)購(gòu)自美國(guó) Calbiochem 公司;增強(qiáng)型 HRP 化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司;MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品;胎牛血清、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和G418 抗生素為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司;牛血清白蛋白購(gòu)自美國(guó) Sigma Aldrich 公司。篩選所用的化合物來(lái)自國(guó)家新藥(微生物)篩選實(shí)驗(yàn)室,純度 > 95%,可商業(yè)購(gòu)買。

    1.1.3 儀器 EnVision 多功能微孔板檢測(cè)儀和 MicroBeta2液體閃爍計(jì)數(shù)儀為美國(guó) Perkin Elmer 公司產(chǎn)品;iQ5 Multicolor real time PCR 儀為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品;TE-70PWR 半干式轉(zhuǎn)膜儀和 ImageQuant 300 凝膠成像儀為美國(guó) GE Healthcare 公司產(chǎn)品;EPICS XL 流式細(xì)胞儀為美國(guó) Coulter 公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株 HepG2 培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基中;ApoP-Luc HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含 700 μg/ml G418 和 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基中;小鼠的單核-巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。所有細(xì)胞都在 5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃貼壁培養(yǎng)。

    1.2.2 化合物高通量篩選 在前期工作中,構(gòu)建了含有人 ApoA-I 基因啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,并獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株——ApoP-Luc HepG2 細(xì)胞[8],本研究利用該細(xì)胞考察化合物上調(diào) ApoA-I 基因表達(dá)的作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用含 G418 700 μg/ml 的 MEM 選擇培養(yǎng)液調(diào)節(jié)至 5 × 105個(gè)/ml,接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔 100 μl。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)6 h 后,吸棄含血清的培養(yǎng)液上清,更換無(wú)血清 MEM 培養(yǎng)液,并加入待篩化合物樣品(初篩樣品濃度為 2 μg/ml)及 DMSO(終濃度 0.1%)對(duì)照。20 h 后移去細(xì)胞培養(yǎng)液上清,PBS 漂洗細(xì)胞 2 次,每孔加入 20 μl 細(xì)胞裂解液,37 ℃孵育 15 min 以充分裂解,加入 Luciferase assay system 中提供的熒光素酶檢測(cè)液后,通過微孔板多功能檢測(cè)儀讀取熒光素酶活性數(shù)值。以熒光素酶的表達(dá)活性來(lái)考察化合物對(duì) ApoA-I 基因表達(dá)的上調(diào)作用。熒光素酶活性的評(píng)價(jià)采用調(diào)節(jié)率來(lái)定義:

    調(diào)節(jié)率=(樣品組細(xì)胞熒光素酶活性/DMSO 組細(xì)胞熒光素酶活性)× 100%

    本研究將化合物樣品的調(diào)節(jié)率大于 150% 視為初篩陽(yáng)性。

    1.2.3 篩選模型量效關(guān)系研究 將化合物溶于 DMSO,制成濃度為 10 mg/ml 的母液。在 96 孔板中接種 ApoP-Luc HepG2 細(xì)胞,將化合物濃度從0.625 μg/ml 開始行對(duì)倍稀釋,共制備 12 個(gè)濃度梯度,并使 DMSO 終濃度保持為 0.1%(W/V)。按照 1.2.2 所述方法檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。利用 SigmaPlot9.0 制圖軟件計(jì)算 EC50。

    1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè) ApoA-I mRNA 的表達(dá) 取人肝癌細(xì)胞 HepG2,以細(xì)胞數(shù) 8 × 105/孔接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h,用 PBS 漂洗細(xì)胞后,加入含指定濃度化合物的無(wú)血清培養(yǎng)液,對(duì)照孔加入 0.1% 的 DMSO。37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h。450 ×離心5 min,收集細(xì)胞,用 SV 總 RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總 RNA。ApoA-I 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 114 bp,正向引物為 5' TGTGTACGTGGATGTGCTCAAAG 3',反向引物為 5' GTCACGCTGTCCCAGTTGTCA 3';內(nèi)參基因?yàn)镚APDH,正向引物 5' AGCCACAT CGCTCAGACAC 3';反向引物 5' GCCCAATACGA CCAAATCC 3'。PCR 條件為 95 ℃預(yù)變性 10 min,95 ℃變性 15 s,60 ℃退火 30 s,30 個(gè)循環(huán)。

    1.2.5 Western blot 檢測(cè) ApoA-I 蛋白表達(dá) HepG2 細(xì)胞接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入化合物,作用 24 h后,消化收集細(xì)胞,以 RIPA 裂解液處理細(xì)胞,抽提細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞蛋白樣品經(jīng) 10% SDS-PAGE 分離,上樣量為 50 μg,采用半干電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上,5% 脫脂奶粉封閉 1 h,加入 ApoA-I 一抗(1:1000)4 ℃孵育過夜,TBST 洗膜 3 次,加入 HRP 標(biāo)記的二抗(1:3000),室溫孵育 1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。以 β-actin 作為內(nèi)參,用兩者灰度掃描結(jié)果的比值進(jìn)行 ApoA-I 表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)分析。

    1.2.6 ELISA 檢測(cè)胞外 ApoA-I 蛋白水平 取細(xì)胞培養(yǎng)液上清,酶標(biāo)板每孔加 100 μl 包被過夜。用 3% BSA 封閉,將 ApoA-I 抗體按 1:1000稀釋,每孔 100 μl,37 ℃放置 1 h,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:5000),37 ℃孵育 1 h,加入 TMB 顯色底物,室溫靜置 30 min,加入1 mol/L HCl 終止反應(yīng),每步驟之間用 PBST 洗滌 4 次,以酶標(biāo)儀檢測(cè)450。

    1.2.7 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)胞內(nèi) ApoA-I 蛋白表達(dá) 消化收集細(xì)胞,經(jīng) 4%(W/V)多聚甲醛室溫固定 40 min,PBS 漂洗,以 0.1% Triton 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿孔處理,含 5% FBS 的 PBS 封閉 15 min,PBS 漂洗后用 ApoA-I 一抗(1:50)4 ℃處理50 min,PBS 漂洗細(xì)胞 3 次,F(xiàn)ITC 標(biāo)記二抗(1:100)處理 50 min,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi) ApoA-I 蛋白水平的變化,每組樣品平均檢測(cè)細(xì)胞數(shù)為 10 000 個(gè),各組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)積分圖表示。

    1.2.8 膽固醇流出試驗(yàn) 取 RAW 264.7 細(xì)胞,按 2 × 104個(gè)/孔接種于 24 孔板,于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 6 h 后,用 0.5 ml 含 1 μCi/ml [3H] 標(biāo)記膽固醇的 DMEM 培養(yǎng)液(5% FBS、0.2% 牛血清白蛋白)孵育 24 h。棄去含同位素的上清培養(yǎng)基,PBS 漂洗細(xì)胞,加入含濃度為 0.3 mmol/L 的 cAMP 的 DMEM 無(wú)血清培養(yǎng)液以上調(diào) ABCA1 表達(dá),培養(yǎng) 24 h。PBS 洗滌細(xì)胞,加入化合物作用 HepG2 細(xì)胞后的培養(yǎng)液上清,孵育 6 h。收集 RAW 264.7 細(xì)胞培養(yǎng)液上清,高速離心 3 min,取上清液檢測(cè);細(xì)胞部分用 500 μl 0.1 mol/L NaOH 裂解,收集裂解液。用閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞的[3H] 標(biāo)記膽固醇。膽固醇流出程度用如下公式表示:

    膽固醇流出程度(%)= 培養(yǎng)液中 cpm 值/(培養(yǎng)液中cpm 值+ 培養(yǎng)細(xì)胞中cpm 值)× 100 %(cpm:每分鐘記數(shù))。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 化合物篩選結(jié)果

    用 ApoP-Luc HepG2 細(xì)胞對(duì)本所國(guó)家新藥(微生物)篩選實(shí)驗(yàn)室化合物庫(kù)進(jìn)行篩選,若相對(duì)熒光素酶活性增加 50% 以上,則認(rèn)為是初篩陽(yáng)性化合物,進(jìn)一步進(jìn)行量效關(guān)系復(fù)篩。通過對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行 20 000 樣次篩選及復(fù)篩,獲得活性化合物5238B-69(圖 1A)。5238B-69 的化學(xué)名稱是 2-(1,3- 苯并噻唑-2-巰基)-N-喹啉基-5-乙酰胺,化學(xué)式為 C18H13N3OS2,分子量是 351.45。MTT 結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)所采用的濃度范圍內(nèi),化合物 5238B-69 對(duì) HepG2 細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒活性。

    2.2 5238B-69 在 ApoA-I 表達(dá)上調(diào)劑篩選模型中的量效關(guān)系曲線

    檢測(cè)不同濃度的化合物作用于ApoP-Luc HepG2 細(xì)胞后熒光素酶表達(dá)活性的變化,得到化合物在 ApoA-I 表達(dá)上調(diào)劑篩選模型上的量效關(guān)系曲線(圖 1B)。結(jié)果表明,5238B-69 以劑量依賴的方式增強(qiáng) ApoP-Luc HepG2 細(xì)胞熒光素酶表達(dá)活性。5238B-69 在質(zhì)量濃度為 0.30 μg/ml 時(shí),其上調(diào)ApoA-I 表達(dá)活性達(dá)到最高值408%,EC50為 0.01 μg/ml。

    相對(duì)熒光素酶活性(%)Relative luciferase activity (%) 400 300 200 100 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 A 5238B-69 濃度(μg/ml)Concentration of 5238B-69 (μg/ml)B

    Figure 1 Chemical structure of 5238B-69 (A) and dose-response curve in log scale (B)

    mRNA 表達(dá)相對(duì)含量Relative mRNA expression(ApoA-I/GAPDH)1.5 1.0 0.5 0 mRNA 表達(dá)相對(duì)含量Relative mRNA expression(ApoA-I/GAPDH)1.5 1.0 0.5 0 對(duì)照 0.01 0.05 0.1 0.5 1Control 12 24 36 48 5238B-69 濃度(μg/ml)Concentration of 5238B-69 (μg/ml)A 時(shí)間(h)Time (h)B

    Figure 2 Effect of 5238B-69 on ApoA-I mRNA expression in HepG2 cells in a concentration-dependent (A) and time-dependent manner (B) (*< 0.05,**< 0.01)

    2.3 5238B-69 對(duì) HepG2 細(xì)胞中 ApoA-I mRNA 水平的影響

    HepG2 細(xì)胞經(jīng)化合物 5238B-69 處理 24 h 后,提取細(xì)胞總 RNA,反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后,采用RT-PCR 反應(yīng)檢測(cè) ApoA-I 的 mRNA 表達(dá)。以管家基因 GAPDH(不同樣品間表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參,得到樣品待測(cè)基因相對(duì)于內(nèi)參基因的含量,再同對(duì)照組相比考察 mRNA 的含量變化。結(jié)果顯示,5238B-69 能增加 HepG2 細(xì)胞中 ApoA-I mRNA 的表達(dá),當(dāng)化合物在濃度為 0.01 ~ 0.1 μg/ml 的范圍內(nèi)時(shí),mRNA 表達(dá)上調(diào)與對(duì)照組相比有顯著的差異,在 0.05 μg/ml 時(shí),mRNA 水平上調(diào)最高,可以達(dá)到(1.33 ± 0.05)倍(圖 2A)。進(jìn)而考察了0.1 μg/ml 的 5238B-69 在不同時(shí)間對(duì) ApoA-I mRNA 表達(dá)的影響(圖 2B),作用 24 h 后,ApoA-I mRNA 水平上調(diào)最高。

    2.4 5238B-69 對(duì) HepG2 細(xì)胞 ApoA-I 蛋白水平的影響

    分別以不同濃度的化合物 5238B-69 作用 HepG2 細(xì)胞,48 h 后提取培養(yǎng)基上清中和細(xì)胞總蛋白,SDS-PAGE 分離后,采用 Western blot 法檢測(cè) ApoA-I 蛋白含量。結(jié)果顯示,在 0.001~0.05 μg/ml 的濃度范圍內(nèi),5238B-69 能明顯增加 HepG2 細(xì)胞分泌到上清中的 ApoA-I 蛋白水平,同時(shí)對(duì)胞內(nèi) ApoA-I 的蛋白水平也存在一定程度的上調(diào)(圖 3)。

    上清 Supernatant胞內(nèi) Cell lysatesβ-actin 對(duì)照 0.05 0.01 0.005 0.001Control 5238B-69 濃度(μg/ml)Concentration of 5238B-69 (μg/ml)

    Figure 3 Western blot analysis for the effect of 5238B-69 at different concentrations on ApoA-I protein expression in HepG2 cells

    2.5 ELISA 檢測(cè) 5238B-69 對(duì)分泌到 HepG 細(xì)胞上清中 ApoA-I 蛋白水平的影響

    為進(jìn)一步明確化合物對(duì)上清中 ApoA-I 水平的影響,采用 ELISA 的技術(shù)手段分析了0 ~ 72 h 上清中 ApoA-I 蛋白的變化。結(jié)果顯示,在 48 h,0.1 μg/ml的 5238B-69 處理組的 ApoA-I 分泌至胞外的蛋白水平是對(duì)照組的 1.48 倍(< 0.05)(圖 4)。

    上清中 ApoA-I 蛋白相對(duì)含量Relative ApoA-I in media2.0 1.5 1.0 0.5 0 0 24 48 72 時(shí)間(h)Time (h)

    Figure 4 ELISA anlysis of the effect of 5238B-69 on ApoA-I protein level in media for the indicated time (*< 0.05)

    2.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) 5238B-69 對(duì) HepG2 胞內(nèi) ApoA-I 蛋白表達(dá)的作用

    由于流式細(xì)胞技術(shù)能較敏感地從單個(gè)細(xì)胞水平定量或半定量檢測(cè)細(xì)胞蛋白,利用該技術(shù)分析了化合物對(duì)胞內(nèi) ApoA-I 表達(dá)的影響。結(jié)果表明,0.5 μg/ml 的 5238B-69 處理 HepG2 細(xì)胞 24 h 后,化合物處理組 ApoA-I 的蛋白含量比對(duì)照組增加了 21.4%(圖 5),進(jìn)一步證實(shí)了化合物 5238B-69的作用。

    2.7 5238B-69 對(duì) RAW 264.7 細(xì)胞中[3H] 標(biāo)記膽固醇流出的影響

    0.05 μg/ml 的化合物 5238B-69 作用 HepG2 細(xì)胞 24 h 后,吸取培養(yǎng)基上清,與事先荷載有 [3H]-膽固醇的 RAW 264.7 細(xì)胞共同孵育。6 h 后,分別收集 RAW 264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)基上清及細(xì)胞裂解液,利用液體閃爍儀檢測(cè)其中的 [3H] 標(biāo)記膽固醇,分析 [3H] 標(biāo)記膽固醇流出的情況。功能水平的初步研究結(jié)果顯示,對(duì)照組、化合物組和 HDL(50 μg/ml)組的膽固醇流出分別是(15.7 ± 3.9)%、(22.5 ± 6.2)% 和(19.9 ± 2.5)%。5238B-69 作用 HepG2 細(xì)胞后分泌產(chǎn)生的 ApoA-I,促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出明顯高于對(duì)照組(= 0.036),從而在生物學(xué)功能水平證明該化合物所上調(diào)表達(dá)的 ApoA-I 是具有接受膽固醇功能的(圖 6)。

    3 討論

    動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病是全球范圍造成人口死亡的主要病因,盡管他汀類藥物能減少 40% 左右的心血管病的發(fā)生,但此類疾病的復(fù)發(fā)和繼續(xù)發(fā)展的可能性依然很高,心血管病的剩留風(fēng)險(xiǎn)依然存在。為此,研究人員一直在積極尋找動(dòng)脈粥樣硬化疾病的新型治療策略,在降低低密度脂蛋白膽固醇的同時(shí),從逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的新靶點(diǎn)入手,開發(fā)具有新作用機(jī)制的藥物。

    ApoA-I 相對(duì)蛋白水平Relative ApoA-I protein levels1.5 1.0 0.5 0 對(duì)照 5238B-69Control

    Figure 5 Flow cytometry analysis for the effect of 5238B-69 on ApoA-I protein levels in HepG2 cells (*< 0.05)

    [3H]標(biāo)記膽固醇外排(%)[3H]-cholesterol efflux (%)35 30 25 20 15 10 5 0 對(duì)照 5238B-69 HDLControl

    Figure 6 5238B-69 promoted cholesterol efflux from RAW 264.7 cells (*< 0.05)

    HDL 和 ApoA-I 因有促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出、啟動(dòng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎、抗氧化、抗血栓、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等多種功能,可能是其多效性發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛在機(jī)制。van der Steeg 等[9]在HDL-C、HDL 顆粒、ApoA-I 與心血管病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),盡管極高濃度的 HDL-C 和大顆粒的 HDL 可能存在增加心血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),但 ApoA-I 始終表現(xiàn)出動(dòng)脈保護(hù)作用,提示 ApoA-I 在抗動(dòng)脈粥樣硬化過程中的關(guān)鍵作用。目前有多項(xiàng)以 ApoA-I 為靶點(diǎn)的藥物正處于臨床研究階段。CSL-112 是由血漿中純化的 ApoA-I 重組成適合于輸注的 HDL,能夠顯著增強(qiáng)人體內(nèi)膽固醇流出,同時(shí)升高pre-β-HDL 的水平,有望減輕動(dòng)脈粥樣硬化在急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)病初期所造成的負(fù)擔(dān),目前正在進(jìn)行臨床 II 期研究[10-11]。CER-001 是首個(gè)模擬 pre-β-HDL 結(jié)構(gòu)及功能的類似物,也是一個(gè)基于 ApoA-I 的模擬肽,臨床前研究證實(shí),CER-001 能促進(jìn)膽固醇動(dòng)員,增強(qiáng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn),2011 年開始進(jìn)行臨床 II 期研究[12]。D-4F/L-4F 是根據(jù) ApoA-I 脂質(zhì)結(jié)合區(qū)雙親性螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)合成的含有 18 個(gè)氨基酸的短肽。動(dòng)物水平的研究發(fā)現(xiàn),它可促進(jìn) ABCA1 及 B 族 I 型清道夫受體(scavenger receptor class B member 1,SR-BI)介導(dǎo)的膽固醇流出,但 D-4F 在人體中生物利用度較低[13]。

    和上述以 ApoA-I 為靶點(diǎn)的藥物相比,本研究發(fā)現(xiàn)的新型化合物 5238B-69 具有潛在的優(yōu)勢(shì)。首先,它是一個(gè)小分子化合物,結(jié)構(gòu)新穎,成藥性好。而上述 CSL-112、CER-001 等藥物屬于多肽蛋白類,這一屬性在很大程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。其次,上文提到的藥物大都是通過外源性直接增加 HDL 的數(shù)量進(jìn)而發(fā)揮作用,本文的研究結(jié)果顯示,5238B-69 是內(nèi)源性上調(diào) ApoA-I 表達(dá)的化合物,膽固醇流出試驗(yàn)表明這種基于蛋白表達(dá)水平的上調(diào)所產(chǎn)生的是具有生理功能的 ApoA-I 及 HDL,可通過增強(qiáng) ApoA-I/HDL 介導(dǎo)的膽固醇外排來(lái)減少細(xì)胞中脂質(zhì)的累積。RVX-208 是第一個(gè)能增加 ApoA-I 內(nèi)源性表達(dá)的小分子化合物,臨床試驗(yàn)證實(shí),RVX-208 顯著增加 ApoA-I 和大顆粒 HDL 的水平,可能在增強(qiáng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中發(fā)揮重要作用。剛剛結(jié)束的 Assure 研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),聯(lián)用瑞舒伐他汀和 RVX-208 的患者表現(xiàn)出顯著的斑塊消退,其動(dòng)脈粥樣斑塊體積百分比(percent atheroma volume,PAV)變化為 –1.43%,是試驗(yàn)預(yù)先設(shè)定的 PAV 終點(diǎn)(–0.6%)的兩倍多[14-15]。隨著結(jié)果的陸續(xù)公布,必將繼續(xù)深入地揭示這類藥物在抗動(dòng)脈粥樣硬化治療中的重要作用。

    為了驗(yàn)證化合物 5238B-69 對(duì) HepG2 細(xì)胞中ApoA-I 蛋白表達(dá)的影響,本研究選用了三種方法檢測(cè) ApoA-I 的蛋白水平。由于細(xì)胞合成 ApoA-I 蛋白后會(huì)不斷向胞外分泌,所以利用 Western blot 的方法分別檢測(cè)了胞內(nèi)和培養(yǎng)基上清中的 ApoA-I。為了進(jìn)一步明確胞外 ApoA-I 蛋白的變化情況,利用 ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示在化合物作用 48 h 后,胞外蛋白的水平與對(duì)照有顯著性差異。進(jìn)一步用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)的蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)在 24 h 時(shí),化合物處理組的 ApoA-I 水平較對(duì)照組顯著地上調(diào)。這些結(jié)果提示化合物 5238B-69 在 24 h 時(shí)即可顯著上調(diào) ApoA-I 的表達(dá)水平,隨著時(shí)間的推移,48 h 時(shí)分泌到胞外的 ApoA-I 蛋白顯著增加。

    本研究首先通過啟動(dòng)子報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),初步證明了化合物對(duì) ApoA-I 轉(zhuǎn)錄的激活作用,繼而在 mRNA 和蛋白水平驗(yàn)證了化合物增強(qiáng) ApoA-I 基因轉(zhuǎn)錄的作用。我們還利用構(gòu)建的另一個(gè)包含有更長(zhǎng) 5'調(diào)控序列(–456 ~ 173 bp)的報(bào)告基因質(zhì)粒,檢測(cè)了 5238B-69 對(duì)其表達(dá)活性的影響(結(jié)果未給出)。研究發(fā)現(xiàn),5238B-69 對(duì)這兩段調(diào)控序列表現(xiàn)出接近的調(diào)控活性和 EC50,提示該化合物可能的作用范圍應(yīng)該在–277 ~ 173 bp 之內(nèi),這段序列含有重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) Site A(–214 ~ –192 bp)、Site B(–169 ~ –146 bp)和 Site C(–134 ~ –119 bp),負(fù)責(zé)與核受體,例如過氧化物酶體增殖物激活型受體(PPAR)、視黃醇類物質(zhì) X 受體(RXR)、肝細(xì)胞核因子 3 或 4(HNF-3/4)和肝 X 受體(LXR)等相識(shí)別,參與對(duì) ApoA-I 基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。接下來(lái)的工作將進(jìn)一步確定發(fā)揮作用的順式元件及轉(zhuǎn)錄因子,以期完善化合物 5238B-69 的分子作用機(jī)制。

    本研究以前期的工作為基礎(chǔ),利用已建立的 ApoA-I 基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型,發(fā)現(xiàn)化合物 5238B-69 具有誘導(dǎo) ApoA-I 基因轉(zhuǎn)錄激活的作用;通過 mRNA 和蛋白水平的研究,證實(shí)了 5238B-69 對(duì) HepG2 細(xì)胞內(nèi) ApoA-I 的表達(dá)上調(diào);以此為基礎(chǔ),在功能水平進(jìn)一步證明該化合物能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇的流出。以上結(jié)果證明,5238B-69 可以上調(diào) HepG2 細(xì)胞中 ApoA-I 的內(nèi)源性表達(dá),并且能在生物學(xué)功能上得到驗(yàn)證。外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚是動(dòng)脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié),促進(jìn)膽固醇的清除代謝是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟,功能試驗(yàn)的結(jié)果提示化合物 5238B-69 可能通過作用于膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的起始環(huán)節(jié),增強(qiáng)外周組織中膽固醇的動(dòng)員,進(jìn)而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本研究為化合物 5238B-69 抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的深入研究提供了重要的依據(jù),為開發(fā)尋找具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗動(dòng)脈粥樣硬化新機(jī)制藥物奠定了基礎(chǔ)。

    [1] Ng DS, Wong NC, Hegele RA. HDL--is it too big to fail? Nat Rev Endocrinol, 2013, 9(5):308-312.

    [2] Tall AR, Yvan-Charvet L, Wang N. The failure of torcetrapib: was it the molecule or the mechanism? Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007, 27(2):257-260.

    [3] Schwartz GG, Olsson AG, Abt M, et al. Effects of dalcetrapib in patients with a recent acute coronary syndrome. N Engl J Med, 2012, 367(22):2089-2099.

    [4] Rubin EM, Krauss RM, Spangler EA, et al. Inhibition of early atherosclerosis in transgenic mice by human apolipoprotein AI. Nature, 1991, 353(6341):265-267.

    [5] Plump AS, Scott CJ, Breslow JL. Human apolipoprotein A-I gene expression increases high density lipoprotein and suppresses atherosclerosis in the apolipoprotein E-deficient mouse. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(20):9607-9611.

    [6] Tangirala RK, Tsukamoto K, Chun SH, et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation, 1999, 100(17):1816-1822.

    [7] Shah PK. Atherosclerosis: targeting endogenous apo A-I--a new approach for raising HDL. Nat Rev Cardiol, 2011, 8(4):187-188.

    [8] Du Y, Wang L, Wang LF, et al. Establishment of a high-throughput screening model for identifying upregulator of human Apo A-I expression. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(3):178-183. (in Chinese)

    杜郁, 王麗, 王麗非, 等. 以Apo A-I為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型的建立. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(3):178-183.

    [9] van der Steeg WA, Holme I, Boekholdt SM, et al. High-density lipoprotein cholesterol, high-density lipoprotein particle size, and apolipoprotein A-I: significance for cardiovascular risk: the IDEAL and EPIC-Norfolk studies. J Am Coll Cardiol, 2008, 51(6):634-642.

    [10] Tardif JC, Grégoire J, L'Allier PL, et al. Effects of reconstituted high-density lipoprotein infusions on coronary atherosclerosis: a randomized controlled trial. JAMA, 2007, 297(15):1675-1682.

    [11] Kones R. Reducing residual risk: modern pharmacochemistry meets old-fashioned lifestyle and adherence improvement. Ther Adv Cardiovasc Dis, 2013, 7(3):169-182.

    [12] Keyserling CH, Hunt TL, Klepp HM, et al. CER-001, a synthetic HDL-mimetic, safely mobilizes cholesterol in healthy dyslipidemic volunteers. Circulation, 2011, 124:A15525.

    [13] Bloedon LT, Dunbar R, Duffy D, et al. Safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of oral apoA-I mimetic peptide D-4F in high-risk cardiovascular patients. J Lipid Res, 2008, 49(6):1344-1352.

    [14] Bailey D, Jahagirdar R, Gordon A, et al. RVX-208: a small molecule that increases apolipoprotein A-I and high-density lipoprotein cholesterol in vitro and in vivo. J Am Coll Cardiol, 2010, 55(23): 2580-2589.

    [15] Nicholls SJ, Gordon A, Johannson J, et al. ApoA-I induction as a potential cardioprotective strategy: rationale for the SUSTAIN and ASSURE studies. Cardiovasc Drugs Ther, 2012, 26(2):181-187.

    Identification and characterization of novel upregulator of human Apolipoprotein A-I

    DU Yu, JIA Xiao-jian, WANG Li, WANG Li-fei, JIANG Hua-jun, YANG Fan, SI Shu-yi, YANG Yuan, HONG Bin

    To find potential small molecules that increase endogenous synthesis of apolipoprotein A-I (ApoA-I), and to identify its ability of increasing ApoA-I at expression and functional levels.

    Compounds screening was performed with established screening model based on the ApoP-Luc HepG2 cell line. Dose-response relationship of the active compound was achieved in promoter activity. The expression of ApoA-I in HepG2 cells regulated by the compound was detected by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), Western blot, ELISA and flow cytometry analysis. The cholesterol efflux assay was applied to investigate the effect of promoted ApoA-I on mediating lipid transfer in RAW 264.7 cells.

    In the present study, compound 5238B-69 was found using the screening model. 5238B-69 increased ApoA-I promoter activity in a dose-dependent manner with EC50of 0.01 μg/ml, and maximal activity of 408% at 0.30 μg/ml. 5238B-69 significantly increased ApoA-I mRNA level and protein level in HepG2 cells. ELISA and flow cytometry analysis showed 5238B-69 could increase ApoA-I protein by 48% and 21.4% compared with control in the media and cells, respectively. The functional efflux assay further illustrated the role of ApoA-I induced by 5238B-69 with RAW 264.7 cells.

    A potential small molecular upregulator was obtained, which could significantly increase the expression of human ApoA-I in liver cells and promote cholesterol efflux from mice macrophages.

    Apolipoprotein A-I; Gene expression regulation; Atherosclerosis; Transcriptional regulation

    HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com; YANG Yuan, Email: yangyuan78@hotmail.com

    10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.003

    國(guó)家自然科學(xué)基金(30801401);“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2012ZX09301002-003、2012ZX09301002-001)

    洪斌,Email:binhong69@hotmail.com;楊媛,Email:yangyuan78@hotmail.com

    2013-11-12

    Author Affiliations: Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics of Ministry of Health (DU Yu, JIA Xiao-jian, WANG Li,WANG Li-fei, JIANG Hua-jun, YANG Fan, YANG Yuan, HONG Bin), National Laboratory for Screening New Microbial Drugs (SI Shu-yi), Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

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