人脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)異種軟骨種子細(xì)胞的影響

高鉞，劉舒云，黃靖香，郭維民，陳繼鳳，張莉，趙斌，彭江，汪愛(ài)媛，王玉，許文靜，盧世璧，郭全義

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人脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)異種軟骨種子細(xì)胞的影響

高鉞，劉舒云，黃靖香，郭維民，陳繼鳳，張莉，趙斌，彭江，汪愛(ài)媛，王玉，許文靜，盧世璧，郭全義

100853 北京，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所

觀察人脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（hACAM）對(duì)異種兔軟骨種子細(xì)胞增殖和表型的影響。

將差速梯度離心法制作的人脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，配制成 0.5% 的漿料，分別鋪于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板和 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，形成 1 mm 厚的薄膜，以此培養(yǎng)板為實(shí)驗(yàn)組。空白對(duì)照組培養(yǎng)板僅使用單純培養(yǎng)液培養(yǎng)。在培養(yǎng)板上培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。通過(guò) hochest33258 染色驗(yàn)證人軟骨細(xì)胞外基質(zhì)脫細(xì)胞完全與否；分別在第 5、15 天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)倒置顯微鏡、甲苯胺藍(lán)染色觀察兩種培養(yǎng)方法的兔軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞表型和增殖情況，用 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)比較兩種培養(yǎng)方法在第1、3、7、10 天的增殖情況。

通過(guò) hochest33258 染色發(fā)現(xiàn)差速梯度離心的人軟骨細(xì)胞外基質(zhì)脫細(xì)胞完全。通過(guò)倒置顯微鏡觀察第 5 和15 天的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖情況優(yōu)于空白對(duì)照組，甲苯胺藍(lán)染色的結(jié)果也證明這個(gè)觀點(diǎn)；CCK-8 細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示第 7 天 hACAM 組在細(xì)胞增殖方面明顯地優(yōu)于單純培養(yǎng)液的對(duì)照組（= 0.0298），hACAM 組的軟骨細(xì)胞與空白組的軟骨細(xì)胞在第 10 天的增殖情況相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

hACAM 免疫原性低，無(wú)細(xì)胞毒性，能夠很好地促進(jìn)異種軟骨細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞外基質(zhì)； 軟骨； 軟骨細(xì)胞； 組織工程； 細(xì)胞增殖

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上常見(jiàn)的疾病，由于關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力有限，目前的一些傳統(tǒng)方法尚無(wú)法獲得滿意的治療效果[1-2]。通過(guò)構(gòu)建組織工程軟骨或骨軟骨復(fù)合體來(lái)修復(fù)軟骨缺損被認(rèn)為是目前較有前景的治療手段。在組織工程研究領(lǐng)域，種子細(xì)胞、可降解的支架材料以及信號(hào)因子并稱為組織工程的三大基本要素，其中種子細(xì)胞在軟骨組織工程方法修復(fù)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程最常用的種子細(xì)胞，但軟骨細(xì)胞增殖數(shù)量有限、體外培養(yǎng)易出現(xiàn)去分化等缺陷，是目前軟骨組織工程大量應(yīng)用的瓶頸[1]。目前軟骨組織最常用的細(xì)胞外支架材料為人工合成材料：如聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸（polylactic acid、PLA）等。但由于人工合成材料本身為異物，有可能導(dǎo)致過(guò)敏、感染等問(wèn)題[2]。比起人工合成的支架材料，人脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（human articular cartilage acellular matrix，hACAM）用優(yōu)選的方法脫去了具有免疫原性的細(xì)胞，保留了大量對(duì)細(xì)胞黏附、增殖有利的蛋白多糖和 II 型膠原等，該基質(zhì)在經(jīng)過(guò)處理做成支架以后的力學(xué)性質(zhì)與天然的軟骨也很相近[3]，而且還具有能提供對(duì)細(xì)胞黏附有益的信號(hào)分子[4]。有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)脫細(xì)胞耳軟骨基質(zhì)可以促進(jìn)同種耳軟骨種子細(xì)胞增殖，而且可以修復(fù)耳軟骨缺損[5-6]，因此，我們認(rèn)為人關(guān)節(jié)軟骨的 hACAM 也能對(duì)兔軟骨種子細(xì)胞增殖和表型維持起到一定的作用，本實(shí)驗(yàn)的目的在于探索 hACAM 對(duì)異種軟骨種子細(xì)胞的影響[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 小鼠抗人II型膠原蛋白抗體購(gòu)自北京世安科興科技公司；BCPCAS 4800 型掃描電子顯微鏡、低溫高速離心機(jī)為美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品；IX70-121 型熒光顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；H-DMEM 培養(yǎng)基分別為美國(guó) Hyclone 和 Gibco 公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品，0.2% 的II型膠原酶為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；II型膠原抗體（SC-28887）、“三抗體”（青霉素、鏈霉素、兩性霉素）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Gen5 酶標(biāo)儀為美國(guó)BioTek 公司產(chǎn)品；CCK-8 為美國(guó) Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性新西蘭白兔，4 月齡，2.5 kg，解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 軟骨組織 人軟骨取自關(guān)節(jié)置換的正常軟骨部分。

1.2 方法

1.2.1 hACAM 的制備及培養(yǎng)板的包被 采用改良脫細(xì)胞方法[8-9]，雙氧水漂洗軟骨組織，將其切成片狀后以無(wú)菌 PBS 溶液漂洗，用勻漿機(jī)制成懸浮的漿料，分離大顆粒的懸浮微粒，將懸浮微粒多次、不同轉(zhuǎn)速離心，獲得 hACAM。將 hACAM 稀釋至 0.5%（W/V）鋪于試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)板上，酒精固定后，用 PBS 清洗，風(fēng)干，于 4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)板分別有兩種，一種底部沒(méi)有鋪蓋玻片，另一種底部鋪有蓋玻片，方便以后的染色。hACAM 包被的培養(yǎng)板在使用前用 PBS 洗滌 2 次[10]。

1.2.2 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 無(wú)菌打開(kāi) 4 月齡新西蘭兔軟骨的膝關(guān)節(jié)和肩關(guān)節(jié)，用尖刀削下關(guān)節(jié)軟骨，置于培養(yǎng)皿中，PBS 洗滌 2 次，每次 2 min，棄去上清液。用眼科剪將軟骨塊剪至極小塊之后加入II型膠原酶，用吸管充分吹打混勻后，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中消化 2 h（隔 30 min 用移液器吹打 1 次，每次持續(xù) 1 min）；加入 8 ml 含10% FBS 的 H-DMEM 培養(yǎng)液終止消化，充分吹打混勻后收集至 15 ml 的離心管中，以599 ×離心 5 min，棄上清，加入 7 ml 培養(yǎng)液，充分吹打混勻，取混懸液分至培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)[11-12]。24 h 后進(jìn)行首次換液，此后隔日換液。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到培養(yǎng)瓶底部的 70% ~ 80% 后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用第二代（P2）的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的培養(yǎng)板上。

1.2.3 形態(tài)學(xué)和組織學(xué)染色

⑴甲苯胺藍(lán)染色：將分離出來(lái)的 P2 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和分別在 hACAM 組和空白對(duì)照組的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用 PBS 洗 2 次，每次 5 min，10% 甲醛固定 15 min，然后用 PBS 洗滌 2 次，每次5 min，室溫下加 1% 甲苯胺藍(lán)染色，37 ℃孵育2 h；去除多余的染料，PBS 洗 2 次，每次 5 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

⑵番紅 O 染色：將脫細(xì)胞后的 hACAM 涂在載玻片上，酒精固定，三蒸水清洗后，Weigert 蘇木精染色 3 min，自來(lái)水沖洗，在酸性酒精（加入 1%鹽酸的 70%酒精）中使之分化 15 s，自來(lái)水沖洗 3 min，在 0.02%堿性孔雀綠水溶液中染色3 min，在 1%的醋酸中快速漂洗，載玻片引流，在 0.1% 的番紅 O 水溶液中染色 3 min，95%酒精沖洗，脫水，清理，封片觀察。

⑶II型膠原免疫組化染色：將兔關(guān)節(jié)軟骨上分離出來(lái)的軟骨細(xì)胞用多聚甲醛固定漂洗后晾干，3% 的雙氧水室溫孵育 10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，棄封閉液，滴加 1:100 的II型膠原抗體，4 ℃過(guò)夜，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，然后加入生物標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，DAB/雙氧水顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片照相。

1.2.4 掃描電鏡觀察 將種植有兔軟骨種子細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），用緩沖液漂洗，3% 戊二醛固定 2 h 以上，0.1 mol/L 磷酸緩沖液漂洗 3 次，每次 15 min，1% 鋨酸固定2 h，采用 50%、70%、80%、90%、95% 的酒精各 15 min 梯度脫水，然后換醋酸異戊酯脫水 15 min，冷凍干燥，鍍膜，把標(biāo)本置于掃描電鏡下面觀察。

1.2.5 CCK-8 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將兔軟骨細(xì)胞接種到 hACAM 鋪板的 96 孔平板上（2 × 103個(gè)/孔），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)樣品 7 個(gè)孔，用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，并于第 1、3、7、10 天進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入 10 μl CCK-8，37 ℃孵育 2 h，使用空白培養(yǎng)板作對(duì)照，測(cè)量在 492 nm 處的值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[13-14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)及活性檢測(cè)

對(duì)差速梯度離心脫細(xì)胞前后的 hACAM 進(jìn)行hochest33258 染色，結(jié)果顯示脫細(xì)胞完全（圖1）。組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn) hACAM 中含大量糖胺多糖、透明質(zhì)酸，證明在差速梯度離心脫細(xì)胞中去除免疫原性的同時(shí)保留了多種軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的成分（圖 2）。通過(guò)電鏡觀察（圖 3），鋪在 6 孔板的 hACAM 質(zhì)地均一，膠原含量豐富。分離的兔關(guān)節(jié)軟骨原代細(xì)胞剛接種時(shí)呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中，12 h 后大多數(shù)細(xì)胞開(kāi)始貼壁，細(xì)胞逐漸呈短梭狀，或多角形、星形，體積小，生長(zhǎng)緩慢。第 7 天，細(xì)胞有 90% 融合，呈多角形，形態(tài)均一[15]。P2 代兔軟骨細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化染色為陽(yáng)性，證實(shí)其增殖和生長(zhǎng)情況良好，并能很好地分泌軟骨細(xì)胞基質(zhì)（圖 4）。

圖 1 hACAM 的 hochest33258 染色（A：脫細(xì)胞前；B：脫細(xì)胞后）

Figure 1 Hochest33258 staining of hACAM (A: Before the decellularization; B: After the decellularization)

光鏡觀察脫細(xì)胞軟骨膜基質(zhì)呈均質(zhì)的細(xì)顆粒狀，脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)呈不規(guī)則、邊緣略模糊的蜂巢樣結(jié)構(gòu)。P2 代軟骨細(xì)胞種植后，其形態(tài)為輪廓清晰的圓形，核明亮而清楚，可偏向細(xì)胞的一側(cè)，有較強(qiáng)的折光性[6]。光鏡下可見(jiàn)，在第 5、15 天時(shí)，hACAM 組生長(zhǎng)的兔軟骨細(xì)胞的增殖情況明顯優(yōu)于空白對(duì)照組的兔軟骨細(xì)胞（圖 5），甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果可見(jiàn)軟骨細(xì)胞增殖有明顯差異（< 0.05）（圖 6）。

圖 2 hACAM 的組織學(xué)染色（A：甲苯胺藍(lán)染色；B：番紅 O 染色）

Figure 2 Histological stainings of hACAM (A: Toluidine blue staining; B: Saffron O staining)

圖 3 鋪膜后未接種細(xì)胞的 hACAM 電鏡圖

Figure 3 The SEM image of hACAM-plated not seeding chondrocytes

圖 4 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的光鏡觀察和組織化學(xué)染色（A：第1 天的 P2 代兔軟骨細(xì)胞；B：第3 天的 P2 代兔軟骨細(xì)胞；C：P2 代兔軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色；D：P2 代兔軟骨細(xì)胞II型膠原免疫組織化學(xué)染色）

Figure 5 Light microscope images and histological staining of the rabbit cartilage chondrocytes (A: Passage 2 of rabbit cartilage chondrocytes after 1d; B: Passage 2 of rabbit cartilage chondrocytes after 3d; C: Toluidine blue staining of P2 chondrocytes; D: Collagen II immunohistochemistrical staining of the P2 rabbit chondrocytes)

5 d 15 d 人脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)組hACAM groups 空白對(duì)照組Control groups

Figure 5 Rabbit chondrocytes of hACAM-plated groups and control groups

5 d 15 d 人脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)組hACAM groups 空白對(duì)照組Control groups

Figure 6 Toluidine blue staining of the rabbit chondrocytes of the hACAM-plated groups and control groups

2.2 CCK-8 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

從 CCK-8 的增殖柱狀圖（圖 7）可以看出，隨著時(shí)間的推移，hACAM 組的軟骨細(xì)胞增殖優(yōu)于空白對(duì)照組，在第 7 天，hACAM 組的軟骨細(xì)胞的增殖情況明顯地優(yōu)于空白對(duì)照組（= 0.0298）；在第 10 天，hACAM 組的軟骨細(xì)胞與空白對(duì)照組的軟骨細(xì)胞的增殖情況相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

OD4924.03.53.02.52.01.51.00.50 1 3 5 7 時(shí)間（d）Time (d)

Figure 7 Rabbit chondrocytes proliferation experiment of the CCK-8 (*< 0.05)

3 討論

軟骨病變是骨科較為常見(jiàn)的疾患，同時(shí)由于關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力有限，而目前的多種治療方法，如微骨折術(shù)、自體或異體組織（骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊）移植等，又存在種種缺陷，限制了其臨床應(yīng)用[16-17]，并且不能獲得滿意的治療效果。組織工程方法的發(fā)展和應(yīng)用為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)提供了新的思路和途徑。應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨被認(rèn)為是目前最有可能解決此難題的技術(shù)手段[18-23]。

軟骨組織由單一的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，細(xì)胞只占軟骨組織體積的 3%，其余均為細(xì)胞外基質(zhì)。軟骨無(wú)血管，故以糖酵解為主，但是成熟軟骨細(xì)胞本身的代謝非常活躍，軟骨細(xì)胞合成和分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，也合成和分泌多種基質(zhì)降解酶，因此軟骨細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的形成和維持起著重要的調(diào)節(jié)作用，另一方面基質(zhì)成分反過(guò)來(lái)也調(diào)節(jié)著軟骨細(xì)胞的功能[15]。有研究表明，滅活的軟骨組織可作為細(xì)胞生長(zhǎng)的支架[24]。因此，我們認(rèn)為脫細(xì)胞的 hACAM 也很有可能成為軟骨種子細(xì)胞很好的生長(zhǎng)場(chǎng)所。況且 hACAM 富含透明質(zhì)酸、糖胺多糖及膠原等，還包括很多生長(zhǎng)因子，諸如胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor I，IGF-1）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）、血小板生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，P-DGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[4]。這些生長(zhǎng)因子和 ECM 結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成了一種微環(huán)境，不僅能提供結(jié)構(gòu)支持，還能保持細(xì)胞的表型[25-26]。本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察 hACAM 對(duì)軟骨種子細(xì)胞的增殖及表型維持的影響，探索使兔軟骨種子細(xì)胞大量擴(kuò)增及維持表型的方法。

組織脫細(xì)胞的研究出現(xiàn)在 20 世紀(jì) 90 年代，它的原理是通過(guò)去除組織的移植免疫原性，從而獲得一種天然的無(wú)免疫排斥反應(yīng)的組織替代物。脫細(xì)胞目的是在去除細(xì)胞、可溶性蛋白、核酸等引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)的同時(shí)，盡可能保留 ECM 成分，保持其生物活性和生物力學(xué)性能[27]。目前，來(lái)源于肌腱、韌帶、小腸黏膜下層、膀胱、肝[28-31]等組織和器官的生物支架材料均是經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理得到的。ECM 材料是目前再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究的熱點(diǎn)，無(wú)論是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床應(yīng)用上都表現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。常用的脫細(xì)胞方法有離子去垢劑法、雙性離子法、酶法、高滲或低滲溶液法、螯合劑法、差速梯度離心法等，非離子的 Triton X-100 脫細(xì)胞劑會(huì)造成大量的糖胺多糖的流失和層黏連蛋白、纖維連接蛋白含量的降低，甚至有的組織使用 Triton X-100 長(zhǎng)達(dá) 4 d 還不能完全除去細(xì)胞的碎片[30-32]；其中差速梯度離心法比起其他脫細(xì)胞方法，能夠避免其他雜質(zhì)摻入到材料中，極大地降低細(xì)胞毒性，更多地保留 ECM 蛋白和生長(zhǎng)因子[27]。脫細(xì)胞人軟骨細(xì)胞外基質(zhì)是生物新鮮組織經(jīng)過(guò)物理方法處理，脫去組織中的所有細(xì)胞、抗原等物質(zhì)后所得到的產(chǎn)物，主要包括膠原、彈性蛋白、非膠原糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖，基本保留了細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分和結(jié)構(gòu)。脫細(xì)胞基質(zhì)的主要特點(diǎn)是具有良好的生物相容性、柔韌性、低抗原性。脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)可以作為一種天然支架，在體外培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)降解變形，保留了培養(yǎng)前的結(jié)構(gòu)，與軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞能在其表面生長(zhǎng)，并產(chǎn)生基質(zhì)，說(shuō)明脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，其本身具有軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的原始結(jié)構(gòu)和環(huán)境，在體內(nèi)具有誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[33]。

因此，本實(shí)驗(yàn)選擇差速梯度離心法[8]制作hACAM，保留了蛋白多糖、糖胺聚糖、膠原和生長(zhǎng)因子等有效成分，最大限度去除了材料的免疫原性，改善了細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境。組織學(xué)結(jié)果證實(shí)經(jīng)脫細(xì)胞處理后的 hACAM，不但把軟骨細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞成分完全脫除，而且保留了蛋白多糖等主要的 ECM 成分。本實(shí)驗(yàn)以同等密度種植兔軟骨種子細(xì)胞于空白培養(yǎng)板上作為空白對(duì)照組。兩組都以同樣的單純軟骨培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)倒置顯微鏡和組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的推移，hACAM 組的兔軟骨細(xì)胞的增殖情況較空白對(duì)照組更好。通過(guò)掃描電鏡可以看到 hACAM 的膠原交叉地排列在培養(yǎng)板的底部，這些膠原蛋白具有張力和剪力特性，固定基質(zhì)中的蛋白多糖給軟骨細(xì)胞提供更好的黏附環(huán)境，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖的可持續(xù)性。甲苯胺藍(lán)組織學(xué)染色同樣證明 hACAM 上的軟骨細(xì)胞增殖優(yōu)于空白對(duì)照組。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)物理方法制備的 hACAM 免疫原性低，無(wú)細(xì)胞毒性作用，有適合細(xì)胞生長(zhǎng)需要的糖胺聚糖、膠原和生長(zhǎng)因子等成分，能夠很好地促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，能作為組織工程軟骨的候選材料。

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The effect of human articular cartilage acellular matrix on rabbit chondrocytes

GAO Yue, LIU Shu-yun, HUANG Jing-xiang, GUO Wei-min, CHEN Ji-feng, ZHANG Li, ZHAO Bin, PENG Jiang, WANG Ai-yuan, WANG Yu, XU Wen-jing, LU Shi-bi, GUO Quan-yi

To observe the proliferation of rabbit chondrocytes on human articular cartilage acellular matrix (hACAM) duringexpansion.

hACAM was prepared with the differential centrifugation as 0.5 % slurry, and then coated the 6-well and 96-well plate to form 1 mm thick film as the experimental group. There was no any process for the control group. Chondrocytes were isolated from articular cartilage of New Zealand white rabbits and cultured on hACAM-coated plates hochest33258 staining was used to verify no cell in the hACAM. The cell proliferation and morphology were analyzed with an inverted microscope, toluidine blue staining, and Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay.

The cells of hACAM groups grew faster than that of the control groups under the inverted microscope in d5, d15, which was also proved by the results of toluidine blue staining. The cells of hACAM groups proliferated significantly faster than that of the control groups (= 0.0298 < 0.05) in d7. The experiment groups and the control groups were not statistically significant difference in proliferation (= 0.1322 > 0.05) by CCK-8 cell proliferation assay in d10.

hACAM promotes the proliferation of chondrocytes at low immunogenicity and no cytotoxic effects, and then it is used as an ideal biological material.

Extracellular matrix; Cartilage; Chondrocytes; Tissue engineering; Cell proliferation

GUO Quan-yi, Email: doctorguo@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（81071458、81000810）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA020502）

郭全義，Email：doctorguo@163.com

2014-02-10

Author Affiliation: Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China