反應(yīng)溫度調(diào)控生物催化立體選擇性的研究進展

俞恩光，鄭仁朝，鄭裕國

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

手性藥物的藥理作用是藥物小分子通過與體內(nèi)大分子之間的嚴(yán)格手性匹配與分子識別而實現(xiàn)的。因此，服用消旋體藥物導(dǎo)致在攝入活性對映體的同時，攝取了大量無效甚至有毒有害的對映體。2006年美國FDA批準(zhǔn)的小分子藥物中，80%是手性化合物，其中75%是手性化合物中的單個對映異構(gòu)體。同年1月，我國SFDA也出臺了相應(yīng)的政策法規(guī)［1］?？梢?，醫(yī)藥化工業(yè)對手性合成提出了越來越高的要求。由于生物催化具有優(yōu)異的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，且反應(yīng)條件溫和(中性、室溫)、介質(zhì)環(huán)保、“三廢”排放少等諸多優(yōu)點，在有機合成特別是手性醫(yī)藥化學(xué)品的合成中受到越來越多的關(guān)注。生物催化劑(酶)對其天然底物通常具有較好的反應(yīng)活性和立體選擇性，但對于非天然底物，其催化活性、穩(wěn)定性和選擇性卻難以盡如人意。而有機合成所用底物一般都是人工合成的非天然底物，這就要求開發(fā)提高生物催化劑反應(yīng)活性、穩(wěn)定性和選擇性的方法。目前主要的方法有:①對生物催化劑進行分子改造［2-3］;②對非天然底物進行結(jié)構(gòu)修飾［4］;③對生物催化劑進行預(yù)處理(凍干、印跡酶、固定化等)［5-6］;④添加表面活性劑、金屬離子或抑制劑［7-8］。但這些方法操作繁瑣，成本較高。溫度除了可以改變酶促反應(yīng)的速度外，對酶催化反應(yīng)的立體選擇性也有較大影響。與其他方法相比，溫度調(diào)控立體選擇性具有簡單、便捷等優(yōu)勢。

1 酶催化立體選擇性與反應(yīng)溫度的關(guān)系:理論分析

酶的立體選擇性由對映體選擇率(enantiomeric ratio，E)表示，它是一個溫度依賴性常數(shù)［9］。下面從熱力學(xué)理論角度分析溫度對其選擇性影響的原因。

溫度對酶催化反應(yīng)選擇性的影響是由于溫度變化范圍內(nèi)熵和焓變化產(chǎn)生的差異引起的。根據(jù)對映體選擇率E的定義可知:

由于酶的立體選擇性是由2種對映體之間所存在的吉布斯自由能差異所產(chǎn)生的，故

同時，根據(jù)熱力學(xué)定理可得:

假設(shè)在某一溫度時，酶對消旋底物的2種構(gòu)型單體選擇性相同，則E=1，ΔΔG+=0，此時，熵和焓對酶催化的作用相等。

整理得

Tr被定義為“消旋溫度”。這就意味著當(dāng)反應(yīng)溫度在Tr附近變化時，酶反應(yīng)的選擇性就會發(fā)生反轉(zhuǎn)。當(dāng)反應(yīng)溫度小于Tr時，熵的貢獻很小，ΔΔG+主要是活化焓差異 ΔΔH+決定的，E值會隨溫度的升高而降低，直到T=Tr時，E=1。相反地，當(dāng)反應(yīng)溫度大于Tr時，ΔΔG+由 TΔΔS+主導(dǎo)，焓起很小的作用，E值隨溫度的升高而升高。

以lnE對1/T作圖可得酶催化反應(yīng)的 ΔΔH+和 ΔΔS+。

式中參數(shù):

(1)ΔΔG+:反應(yīng)自由能。分子間發(fā)生反應(yīng)所需自由能;(2)ΔΔH+:反應(yīng)的焓變。與反應(yīng)自由能相關(guān)的溫度依賴性常數(shù)，是反應(yīng)形成過渡態(tài)時產(chǎn)生的偶極和空間作用力相關(guān);(3)ΔΔS+:反應(yīng)的熵變。也是反應(yīng)自由能相關(guān)的溫度依賴性常數(shù)，主要是由于反應(yīng)形成過渡態(tài)時溶劑和反應(yīng)介質(zhì)所形成的阻礙作用。

2 反應(yīng)溫度調(diào)控生物催化對映選擇性的應(yīng)用

目前，通過溫度調(diào)節(jié)酶立體選擇性的實例越來越多，在醇脫氫酶、青霉素G酰化酶和脫鹵酶，特別在具有較廣溫度適應(yīng)范圍(－40～120℃)的脂肪酶和酯酶［10-11］中報道較多。

2.1 反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)醇脫氫酶立體選擇性

Phillips等［12］利用 Thermoanaerobacter ethanolicu仲醇脫氫酶(SADH)催化外消旋2-丁醇、2-戊醇和2-己醇生成相應(yīng)的手性醇中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，酶的立體選擇性下降甚至發(fā)生逆轉(zhuǎn)。以2-丁醇為底物時，Tr=26℃。當(dāng)T＜26℃時，(S)-2-丁醇是酶偏好的底物(lnE＜0)，而當(dāng)T＞26℃時，(R)-2-丁醇是酶偏好的底物(lnE＞0)。即酶的立體選擇性發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，由原來的S型選擇性變?yōu)镽型選擇性(圖1)。以2-戊醇為底物時，也觀察到同樣的變化過程，Tr=70℃。

圖1 醇脫氫酶不對稱拆分(R，S)-2-丁醇生成相應(yīng)的手性醇Fig.1 Enantioselective resolution of(R，S)-2-butanol by SADH

2.2 反應(yīng)溫度調(diào)控脂肪酶或酯酶的立體選擇性

酯酶和脂肪酶催化的反應(yīng)類型多，且在不同類型的反應(yīng)中均發(fā)現(xiàn)溫度對其立體選擇性影響較大。

2.2.1 溫度對脂肪酶催化的乙?；磻?yīng)立體選擇性的調(diào)控 Amir等［13］在利用固定化 Candida antarctita脂肪酶立體選擇性乙?；?-(羥甲基)-1，4-苯并二氮雜卓-2-(酮)中發(fā)現(xiàn):當(dāng)溫度由40℃降至－15℃時，酶對3-(羥甲基)-1-甲基-4-苯并二氮雜卓-2-(酮)的立體選擇性提升至原來的5倍;而對 3，3-二羥甲基-1，4-苯并二氮雜卓-2-(酮)，產(chǎn)物ee值由0℃時的90%下降為60℃的69%。Tomoko等［14］利用脂肪酶在超臨界二氧化碳和乙酸乙烯酯中立體選擇性乙?；庀?-(p-氯苯)-2，2，2-三氟乙醇中發(fā)現(xiàn)，該脂肪酶的 E值由低溫低壓的60下降到高溫高壓的10左右。

2.2.2 溫度對脂肪酶催化的氨解反應(yīng)立體選擇性的調(diào)控 Paloma等［15］利用 CALB、Thermomyces lanuginosus脂肪酶(TLL)和 Pseudomonas alcaligenes脂肪酶(PAL)分別催化苯基甘氨酸甲酯、苯基丙氨酸甲酯的氨解反應(yīng)發(fā)現(xiàn)(圖2)，CALB對苯基甘氨酸甲酯的E值隨反應(yīng)溫度由40℃降低到－20℃時從17提高到52，而對苯基丙氨酸甲酯的E值變化不大。TLL和PAL對苯基丙氨酸甲酯的E值隨溫度由40℃下降到－20℃時，由13提高到84。

圖2 脂肪酶催化苯基甘氨酸甲酯/苯基丙氨酸甲酯的氨解反應(yīng)Fig.2 Ammoniolysis of the methyl esters of phenylglycine/phenylalanine by lipase

2.2.3 溫度對脂肪酶或酯酶催化的酯化反應(yīng)立體選擇性的調(diào)控 ①當(dāng)T＜Tr時，溫度升高酶立體選擇性降低，溫度降低酶立體選擇性增加:Yoshitaka等［16］利用來自Candida rugosa脂肪酶MY在丁醇和異丙醚中催化2-苯基丙酸衍生物(圖3)酯化生成相應(yīng)的酯類。圖3中1、2隨著溫度的升高，酶的E值下降到1(57℃)左右，此時，酶無選擇性。Takashi等［17］利用Burkholderia cepacia 脂肪酶拆分環(huán)氮乙烷-2-甲醇(圖4)。當(dāng)溫度降低至－40℃時，酶的E值由17提高到符合工業(yè)化要求的99，將脂肪酶固定化到多孔陶瓷上后，酶催化反應(yīng)速度提高了80倍，這為低溫生物催化的工業(yè)化應(yīng)用提供了可能。②當(dāng)T＞Tr時，溫度升高酶立體選擇性增加，溫度降低酶立體選擇性降低:Robert等［18］利用Candida rugosa(CRL)酯酶、Rhizomucor miehei(Palatase?)酯酶和極端嗜熱菌Sulfolobus solfataricus P1羧酸酯酶Sso EST1催化萘普生甲酯的水解(圖5)。CRL酯酶和Palatase?酯酶對萘普生甲酯的消旋溫度(Tr)分別為(－46.3±8.9)、(1.1±0.4)℃，溫度從0℃升高到60℃時，lnE分別從3提高到5，0提高到1(表1)。羧酸酯酶Sso EST1的Tr為(88.1±6.9)℃，當(dāng)溫度由0℃升高到70℃時，lnE由3降低為1。這是由于羧酸酯酶Sso EST1催化過程主要是由焓控制的，而CRL酯酶和Palatase?酯酶則是由反應(yīng)的熵控制的。

圖3 脂肪酶MY催化2-苯基丙酸衍生物的酯化反應(yīng)Fig.3 Lipase MY catalyzed esterification of 2-phenoxypropionic acids

圖4 脂肪酶拆分環(huán)氮乙烷-2-甲醇Fig.4 Lipase-catalyzed resolution of azirine-2-methanol

圖5 酯酶催化(R，S)-萘普生甲酯的水解Fig.5 Esterase-Catalyzed Hydrolysis of(R，S)-Naproxen Methyl Ester

表1 酯酶催化(R，S)-萘普生甲酯的水解反應(yīng)中的熱力學(xué)參數(shù)和消旋溫度Table 1 Thermodynamic parameter and Trof hydrolysis of(R，S)-Naproxen Methyl Ester catalyzed by Esterase

2.3 反應(yīng)溫度調(diào)控其他酶的立體選擇性

2.3.1 青霉素 G 酰化酶 Gianfranco等［19］利用青霉素G?；竸恿W(xué)拆分β-內(nèi)酰胺(圖6)，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，酶的E值下降至24(T=301 K)，溫度繼續(xù)升高，酶的E值又上升至130(T=328 K)。通過對溫度的簡單調(diào)節(jié)，可以使原本不適用的酶變得非常有效。

圖6 青霉素G?；竸恿W(xué)拆分β-內(nèi)酰胺Fig.6 Kinetic resolution of racemic β-lactam 1 by PGA(Penicillin G-Acylase)

2.3.2 脫鹵酶 Radka等［20］利用 Bradyrhizobium japonicum USDA110鹵代烷脫鹵酶DbjA研究溫度對酶立體選擇性的影響。該酶催化不同底物的E值和熵焓變化見表2。研究發(fā)現(xiàn)，降低溫度可顯著提高該酶的選擇性。對2-溴戊烷，溫度由50℃降低至20℃時，E值由13提高至174;對乙基-2-溴丙酸鹽，由197提高至474;對底物甲基-2-溴丁酸鹽，由83提高至225。

表2 脫鹵酶DbjA催化鹵化物脫鹵反應(yīng)E值和熵焓變Table 2 Thermodynamic parameter and Trof dehalo-reaction catalyzed by DbjA

3 結(jié)語

綜上所述，溫度對脂肪酶、酯酶、脫鹵酶、醇脫氫酶和青霉素G?；傅牧Ⅲw選擇性有較大影響。一般來說，當(dāng)反應(yīng)溫度高于Tr時，提高溫度會降低酶催化的立體選擇性，但當(dāng)溫度小于Tr時，提高溫度可以提高酶的立體選擇性。當(dāng)反應(yīng)的Tr很低時，可以通過添加有機溶劑調(diào)高酶的Tr，從而可以在室溫條件下調(diào)節(jié)酶的選擇性。當(dāng)在室溫條件下E值很低時，可降低反應(yīng)溫度來提高E值，從而達到工業(yè)化應(yīng)用的要求。因此，溫度調(diào)節(jié)將在酶立體選擇性調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

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