多不飽和脂肪酸合成途徑研究進(jìn)展

廖靈旋，于 昊，黃建忠

(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福建 福州 350108)

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含有2個或者2個以上雙鍵的長鏈脂肪酸，碳原子數(shù)目一般為18～22個。主要包括α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、亞油酸(LA)、二高-γ-亞麻酸(DHGLA)、花生四烯酸(ARA)等［1-2］。其中，根據(jù)距離甲基端第1個雙鍵位置不同可以將多不飽和脂肪酸分為 ω-3、ω-6、ω-7、ω-9 等系列(也可以用n表示)［3］。主要的多不飽和脂肪酸如表1所示，這些多不飽和脂肪酸對于維持和調(diào)節(jié)人類健康起著至關(guān)重要的作用，是人類必需的脂肪酸(EFA)［4］。本文主要對多不飽和脂肪酸的微生物來源、作用機理、生物合成及新發(fā)現(xiàn)的聚酮合酶途徑等方面做一簡述。

1 多不飽和脂肪酸的微生物來源

多不飽和脂肪酸對于維護(hù)人體健康是非常重要的，但由于哺乳動物缺少合成長鏈PUFAs關(guān)鍵酶基因，因此，只能通過外在的飲食來獲取。目前，在飲食方面PUFAs主要來自海洋魚類和植物種子油。由于市場對PUFAs的需求，從各種微生物中尋找PUFAs的來源成為研究熱點，主要的微生物有細(xì)菌、真菌、和藻類。

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，真菌和藻類產(chǎn)不飽和脂肪酸明顯高于細(xì)菌。對于真菌，產(chǎn)不飽和脂肪酸主要有高山被孢霉、長被孢霉、水霉、輪枝霉、樟疫霉、毛霉、小克銀漢霉等［5-6］。在海洋魚類中雖然有多不飽和脂肪酸，但其真正來源是食物，而非自產(chǎn)，海洋中的微生物才是多不飽和脂肪酸真正的生產(chǎn)者［7］。目前已經(jīng)從海洋中分離到一些富含DHA和EPA的微生物，其中，藻類中的金藻綱、黃藻綱、綠藻綱和隱藻綱富含EPA，而DHA主要集中在甲藻、金藻和硅藻中?，F(xiàn)在用于商業(yè)生產(chǎn)DHA的海洋微生物主要是裂殖壺菌［8-9］和隱甲藻［10］。

表1 主要的多不飽和脂肪酸Table 1 Typical PUFAs

2 多不飽和脂肪酸的作用機理

多不飽和脂肪酸是人類必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，必須通過食物獲得。對這些多不飽和脂肪酸的深入研究發(fā)現(xiàn)，它們具有很多重要的生理功能，如降低心血管疾病風(fēng)險、提高免疫、抗癌等。因其對人體健康的有利影響，從而引起人們很大的關(guān)注［11-12］。

2.1 細(xì)胞膜的組成部分

多不飽和脂肪酸是大多數(shù)真核生物細(xì)胞膜磷脂的關(guān)鍵組成成分，在細(xì)胞表面信號傳遞上起到至關(guān)重要的作用［13］。其中，ω-3多不飽和脂肪酸中的DHA在大腦和視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞膜上含量非常豐富。在大腦的組織細(xì)胞中，DHA的含量可達(dá)到細(xì)胞總脂的10%;在視網(wǎng)膜的細(xì)胞中，DHA的含量可達(dá)到細(xì)胞總脂的60%以上［14］。所以，多不飽和脂肪酸對于人體腦神經(jīng)及視覺有重要作用。

2.2 影響細(xì)胞膜流動性

細(xì)胞膜的流動性是由于構(gòu)成膜之間的磷脂雙分子和蛋白質(zhì)分子不斷處于橫向或縱向的運動狀態(tài)。對于細(xì)胞代謝來說，有著非常重要的作用，如物質(zhì)運輸、細(xì)胞識別、細(xì)胞分化、細(xì)胞融合與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等都與細(xì)胞膜的流動性有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸對細(xì)胞膜流動性的影響，是由于其插入膜脂質(zhì)雙分子層中，最終來影響膜的結(jié)構(gòu)［15］。

在一些研究過程中，發(fā)現(xiàn)用多不飽和脂肪酸(DHA、EPA)來培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，能夠增加膜的流動性，并呈劑量反應(yīng)，是由于顯著地改變了細(xì)胞膜磷脂構(gòu)成，從而提高了細(xì)胞膜的流動性［16］。另外，在對乳腺癌細(xì)胞膜研究中，發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的不同構(gòu)成比例對其也有影響［17］，這也是由于相關(guān)膜蛋白活性跟膜功能受到影響而導(dǎo)致的［18-19］。

2.3 調(diào)節(jié)膜離子通道

早在20世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)格陵蘭愛斯基摩人由于食用富含多不飽和脂肪酸的魚類食物，患心血管疾病的人較少［20-21］，從而使多不飽和脂肪酸受到高度重視。經(jīng)過眾多的研究發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸是通過調(diào)節(jié)膜上離子通道來降低心律失常。研究顯示，不飽和脂肪酸能夠抑制心肌細(xì)胞膜上的鈉離子通道，通過抑制鈉離子電流，使動作電位縮短，減少異常興奮的產(chǎn)生，降低心率［22］。另外，多不飽和脂肪酸還能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜上鈣離子通道，通過阻斷電壓門控鈣離子流，從而使鈣離子濃度降低［23］。

2.4 免疫調(diào)節(jié)作用

多不飽和脂肪酸對于人體的免疫細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)作用，由于多不飽和脂肪酸不僅是人體必需的脂肪酸，也是細(xì)胞膜成分磷脂的組成部分。多不飽和脂肪酸的攝入，可以明顯改變免疫細(xì)胞T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、K淋巴細(xì)胞和NK淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜組成，從而影響這些細(xì)胞受體的空間構(gòu)象、功能以及與外在因子的結(jié)合能力，最終起到對細(xì)胞免疫作用的影響［24］。一些研究表明，通過給小鼠飼喂適量多不飽和脂肪酸DHA、EPA，可以改變第二信使的產(chǎn)生，從而影響淋巴細(xì)胞的功能，明顯抑制了T細(xì)胞分泌IL-2［25-26］。

2.5 影響基因表達(dá)

多不飽和脂肪酸除了是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，還對機體的某些基因起著調(diào)控作用。近年來經(jīng)過研究表明［27］，多不飽和脂肪酸參與一些基因的表達(dá)調(diào)控主要是通過與核受體和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來發(fā)揮其功能，特別是對脂肪代謝中酶和蛋白基因的調(diào)控［28］。研究中還發(fā)現(xiàn)，不同種類的脂肪酸對這些代謝基因都具有調(diào)節(jié)作用［29-30］，其中以多不飽和脂肪酸最為顯著［31］。

3 微生物產(chǎn)多不飽和脂肪酸的生物合成途徑

在真核微生物如真菌和藻類中，已知的多數(shù)多不飽和脂肪酸是通過脂肪酸延長酶和去飽和酶在線粒體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上經(jīng)過一系列反應(yīng)而獲得的［32-33］。在生物體內(nèi)形成多不飽和脂肪酸是一個復(fù)雜的過程，它是以飽和脂肪酸硬脂酸(18∶0)為底物，通過脂肪酸延長酶與去飽和酶作用完成的。其中碳鏈的延長與去飽和作用是交替進(jìn)行的，最終經(jīng)過一系列的脫氫和碳鏈延長而形成。如，已知DHA的生物合成是從乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A開始經(jīng)過縮合、還原、脫水、還原等，接近30個不同的酶反應(yīng)和70個包括4個重復(fù)的脂肪酸循環(huán)反應(yīng)最終形成。其中在合成途徑中，去飽和酶是關(guān)鍵酶，它控制著不飽和脂肪酸的不飽和程度，合成途徑如圖1所示［34］。

圖1 多不飽和脂肪酸在生物體的合成途徑Fig.1 biosynthetic pathway of PUFAs

然而，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在某些深海中的一些海洋微生物不需要通過脂肪酸延長酶和脂肪酸去飽和酶來形成PUFAs，其合成PUFAs的途徑是通過聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)來催化的，這一條新穎代謝途徑的發(fā)現(xiàn)，為轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)新的不飽和脂肪酸提供了希望［35］。近年來，一些研究小組在海洋中發(fā)現(xiàn)一些富含不飽和長鏈DHA和EPA的微生物，如產(chǎn)DHA的海產(chǎn)弧菌(Vibrio marinus MP-1)、產(chǎn) EPA的希瓦氏菌(Shewanella sp.)等［36］。最早報道能產(chǎn) PUFAs的是腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens SCRC2378)，通過構(gòu)建該菌株的基因組文庫，研究設(shè)計從中獲得1段38 kb DNA，對其所包含的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有5個開放閱讀框 (Open reading frame，ORF)與脂肪酸合成酶具有同源性［37］。對這些ORF進(jìn)行序列比對分析并導(dǎo)入大腸埃希菌進(jìn)行異源表達(dá)，在不依賴大腸脂肪酸合酶 (Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和任何長鏈中間物質(zhì)的情況下，發(fā)現(xiàn)能夠獲得二十二碳五烯酸 (22∶5)從而也證實了這5個ORF能夠完全獨立的催化形成PUFAs。另外，通過構(gòu)建pEPA質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到不具合成多不飽和脂肪酸能力的大腸埃希菌中，在厭氧條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)仍能合成EPA，說明該EPA的合成與之前的合成途徑不同，不涉及有氧脫氫機制。此外，在陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一些產(chǎn)多不飽和脂肪酸的海洋細(xì)菌中，也有與產(chǎn)EPA類似的基因簇，所以通過這些研究可以表明這些海洋細(xì)菌合成多不飽和脂肪酸不涉及脂肪酸的脫氫和延長，而是由聚酮合酶來催化產(chǎn)生的。

圖2 假設(shè)希瓦氏菌聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸代謝途徑Fig.2 Hypothetical pathway for PUFAs synthesis by the Shewanella polyketide synthase

雖然確切的催化機制尚未闡明，但 Jim Metz［35］等經(jīng)過對基因簇的比對分析，提出了PUFA在腐敗希瓦氏菌的合成途徑，如圖2所示［38］。它是在PKS合成酶的作用下，以乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A為底物，經(jīng)過縮合、還原、脫水、還原/異構(gòu)化循環(huán)反應(yīng)，最終形成多不飽和脂肪酸。在這個合成途徑中，PKS合成酶與脂肪酸合酶執(zhí)行了一些相同的反應(yīng)，用了相同的小蛋白，酰基載體蛋白(ACP)［39］，作為一個共價結(jié)合位點延長碳鏈。不同的是PKS途徑過程不像傳統(tǒng)的途徑需要氧去飽和引入雙鍵，因為在PKS合成酶中存在脫水酶和異構(gòu)酶，可以直接形成雙鍵，因此也稱為厭氧聚酮合酶途徑。對于聚酮合酶合成不飽和脂肪酸，盡管確切的生物合成機制還有待進(jìn)一步闡明，但其關(guān)鍵步驟主要有縮合和異構(gòu)化。其中，參與反應(yīng)的酶有3-酮基合成酶、3-酮脂酰還原酶、烯醇還原酶、脫水酶及異構(gòu)酶等，在合成途徑中酮基合成酶起著關(guān)鍵酶的作用，催化很多底物的縮合反應(yīng)。

4 聚酮合酶合成不飽和脂肪酸中的關(guān)鍵基因及功能

4.1 PKS途徑中關(guān)鍵基因的克隆

1996 年，Yazawa［37］從海洋細(xì)菌腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens SCRC2378)中克隆到合成EPA的基因簇，片段大小為38 kb，將該目的片段導(dǎo)入大腸埃希菌中做異源表達(dá)［40］，在發(fā)酵液中能夠檢測到EPA。因此，對克隆到的基因簇進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其共包含了8個ORF，但其中合成EPA所必需的只有5個 ORF，總長約 20 kb，分別被命名為pfaA、pfaB、pfaC、pfaD 和 pfaE［41］。另外，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這5個DRF共包含11個酶，其中8個與PKS基因相關(guān)，另外3個與細(xì)菌脂肪酸合成酶蛋白具有同源性［35］。

1999年，Tanaka等在 DHA生產(chǎn)菌株 V.strain MP-1克隆到一段40 kb的目的片段，包括pfaA、pfaB、pfaC、pfaD。發(fā)現(xiàn)這 4 個 ORF 與 EPA生物合成基因簇有很高的同源性［42-43］。另外，Gentile等在1株嗜冷菌希瓦氏菌(Shewanella sp.GA-22)中發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)亞油酸、花生四烯酸和EPA三種不同的多不飽和脂肪酸，通過設(shè)計簡并性引物，只克隆到2個片段pfaA和pfaC［36］，并沒有克隆到已報道的5個pfa，可能是由于其他3個基因與已經(jīng)報道的基因同源性不高而致。

4.2 PKS途徑中關(guān)鍵基因的功能

近來，越來越多的海洋微生物基因組被測序，通過研究發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)多不飽和脂肪酸的細(xì)菌都含有類似pfa基因序列，可以確定PKS途徑形成多不飽和脂肪酸是由于pfa基因簇作用而產(chǎn)生的。對已經(jīng)克隆報道過的pfa基因簇進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)有8個結(jié)構(gòu)域跟PKS相關(guān)。而另外3個與細(xì)菌FAS蛋白同源，其中1個同肺炎雙球菌烯醇還原酶(ER)同源，2個與大腸埃希菌中編碼反式-癸烯酰-ACP 和其異構(gòu)化順式-3-癸烯酰-ACP［44］合成的FabA 脫水酶(DH)同源，如表2 所示［35］。

表2 pfa基因序列功能推測Table 2 The sequence of pfa gene function prediction

通過對聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸中關(guān)鍵基因的克隆，發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)PUFAs的海洋細(xì)菌都含有類似pfa基因序列，且具有不同的排列方式，大致可分為3種類型，第1種是菌中含有完整的pfaA、pfaB、pfaC、pfaD 和 pfaE 五個關(guān)鍵基因，并且這些基因在同一個基因簇上;第2種，也含有完整的pfa基因序列，但是其中的pfaE基因與其他基因不在同一基因簇上;第3種，只包含pfaA、pfaB、pfaC、pfaD四個基因，pfaE基因則被整合到pfaC中。雖然這3種排列方式大致相同，但某些結(jié)構(gòu)域仍有不同之處，執(zhí)行不同的功能，最終導(dǎo)致生成不同的多不飽和脂肪酸。此外，對這些新基因的克隆及功能分析推測有利于科學(xué)家對聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸路線有一個清晰的了解，對今后生物改造海洋細(xì)菌來解決PUFAs供應(yīng)問題具有深遠(yuǎn)的意義。

5 小結(jié)和展望

近年來隨著一些研究機構(gòu)對PUFAs的深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有預(yù)防心血管疾病、高血壓及抗癌作用，導(dǎo)致市場上對于PUFAs的需求大幅度增加，因此需要不斷提高PUFAs的產(chǎn)量及質(zhì)量來滿足需求。對海洋微生物聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸的研究，有利于從海洋微生物中生產(chǎn)獲得PUFAs，以此來解決市場需求問題。目前，主要通過研究培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的優(yōu)化以及高產(chǎn)菌株的選育來提高PUFAs的產(chǎn)量，但效果并不明顯。因此，研究通過其他途徑提高PUFAs的產(chǎn)量有重要的理論意義。隨著研究的不斷深入，通過基因工程手段生產(chǎn)PUFAs成為可能，且具有潛在的重要商業(yè)價值。目前發(fā)現(xiàn)的這些產(chǎn)多不飽和脂肪酸的菌大多來自深海，生存溫度很低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，構(gòu)建適合工業(yè)應(yīng)用的基因工程菌株生產(chǎn)PUFAs成為研發(fā)的熱點［45-46］，這需要對生物合成基因簇的克隆，研究PUFAs途徑中的關(guān)鍵酶基因，在分子水平上進(jìn)行調(diào)控和表達(dá)，從而實現(xiàn)不飽和脂肪酸的高表達(dá)。目前對于新發(fā)現(xiàn)的聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸這一新穎途徑的具體分子合成機制和調(diào)控機制還沒有完全闡明，有待于以后的深入研究。

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