煙草對(duì)常見(jiàn)口腔微生物生長(zhǎng)影響的初步研究

季惠惠，劉騰飛，王小 林，鞠 雯，張 平，陳美玲，王 璨，閆珺涵，閆志勇

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系，山東 青島 266071;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系，山東 青島 266071;3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)系，山東 青島 266071;4.青島大學(xué)附屬中學(xué)，山東 青島 266071;5.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

近年來(lái)，關(guān)于吸煙對(duì)人體危害的研究越來(lái)越深入。研究表明，吸煙可引起多種常見(jiàn)疾病，如肺癌、支氣管炎、肺氣腫、心血管疾病等［1-2］。此外，口腔是人體富含正常微生物群的部位，口腔微生態(tài)環(huán)境中微生物的數(shù)量和種類很易受外界環(huán)境的影響。然而，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)香煙對(duì)口腔中微生物及相關(guān)疾病影響的研究卻相對(duì)較少，且結(jié)果相互矛盾。有研究認(rèn)為香煙可改變口腔微環(huán)境從而有利于微生物的生長(zhǎng)，增加口腔白斑及牙周疾病的發(fā)病率［3-4］;也有研究認(rèn)為香煙對(duì)口腔微生物沒(méi)有明顯影響［5］，甚至還有研究認(rèn)為吸煙可促進(jìn)鏈球菌等口腔常見(jiàn)細(xì)菌的生長(zhǎng)［6］。因此，本文采取不同的方法觀察香煙對(duì)口腔微生物的影響，研究香煙與其生長(zhǎng)之間的關(guān)系，以客觀評(píng)價(jià)香煙對(duì)口腔微生物的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單胞菌(ATCC 25668)、白色假絲酵母(ATCC14053)、草綠色鏈球菌(自行分離);尼古丁(上海源葉生物科技有限公司)，香煙(泰山宏圖，焦油量12 mg，煙氣煙堿量 1.1 mg，煙氣一氧化碳量 1.2 mg，山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn));營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血瓊脂平板、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)、麥?zhǔn)媳葷峁?0.5 個(gè)單位)等為自行配制。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 將上述菌株接種在相應(yīng)培養(yǎng)基上，分離出單個(gè)菌落，分別選取其單個(gè)菌落混懸于生理鹽水中，稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝坏臐岫?，備用?/p>

1.2.2 尼古丁對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的影響 將尼古丁用 PBS 稀釋為400、40 μg/mL;取 40 μL 已稀釋的菌液置于無(wú)菌EP管中，按1∶1的比例分別與 400、40、0 μg/mL 的尼古丁均勻混合，置于恒溫震蕩器中(37℃，220 r/min)震蕩作用6 h，將草綠色鏈球菌與各濃度尼古丁的混合液按照1∶1000比例進(jìn)行稀釋。同理，大腸埃希菌、金黃色等等球菌、銅綠假單胎菌、白色假絲酵母菌等菌液混合液按照1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶100 比例進(jìn)行稀釋。分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌的稀釋液50 μL滴于普通平板中，傾倒適量已高壓滅菌的保溫60℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂(白色假絲酵母菌用沙保羅瓊脂)，輕輕晃動(dòng)平板使之均勻混合，待其冷卻后，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h;取草綠色鏈球菌與尼古丁的混合液50 μL置于血平板表面，將菌液涂抹均勻，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)48 h。取出上述培養(yǎng)物查看生長(zhǎng)情況并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，各菌均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 煙草浸出液對(duì)口腔微生物的影響 將20支香煙的煙絲取出，置于裝有50 mL無(wú)菌蒸餾水的潔凈離心管內(nèi)，37℃水浴24 h，5000 r/min離心15 min，取上清液用0.22 μm的濾菌器過(guò)濾除菌，然后進(jìn)行 1∶10、1∶100 稀釋，參照 1.2.2 的方法使菌液與煙草浸出液混合作用6 h后，分別采取瓊脂稀釋法和涂布法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4 煙霧提取物對(duì)口腔微生物的影響 將無(wú)菌蒸餾水20 mL置于水煙漏斗中，使水煙漏斗的出氣口與真空泵相連;取10支已去掉過(guò)濾嘴的香煙依次插于水煙漏斗進(jìn)氣口處并點(diǎn)燃，開(kāi)啟真空泵使其燃燒產(chǎn)生的煙霧進(jìn)入水煙漏斗并溶解于無(wú)菌蒸餾水，每只香煙均控制在10 min左右燃燒完。將水煙漏斗中的煙霧水溶液倒入試管中，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。將滅菌后的煙霧水溶液用0.22 μm 的濾菌器過(guò)濾除菌，并進(jìn)行 1∶10、1∶100稀釋，參照1.2.2的方法將菌液與煙草浸出液的混合作用6 h后，分別采取瓊脂稀釋法和涂布法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5 吸煙對(duì)志愿者口腔中微生物的影響 召集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院2011級(jí)吸煙(平均吸煙10支/d，時(shí)間為3 a以上)和不吸煙的男生各25名，清晨待志愿者使用課題組統(tǒng)一提供的牙膏刷牙后，每名志愿者取10 mL生理鹽水漱口30 s，分別吐入潔凈的無(wú)菌紙杯中;取1 mL漱口液置于試管中，然后稀釋1000倍，將稀釋液各取50 μL涂布血平板表面，放入37℃孵箱培養(yǎng)48 h，觀察不同形態(tài)的菌落，并通過(guò)革蘭染色和生化試驗(yàn)對(duì)出現(xiàn)頻率較高的菌落進(jìn)行初步鑒定，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行，方法為兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用t'檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼古丁對(duì)口腔常見(jiàn)微生物生長(zhǎng)的影響

如表1所示，高濃度的尼古丁對(duì)口腔微生物有不同程度的抑制作用，低濃度的尼古丁對(duì)大腸埃希菌、白色假絲酵母菌作用不明顯，對(duì)草綠色鏈球菌生長(zhǎng)的抑制作用顯著，而對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

表1 不同濃度的尼古丁對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的影響Table 1 The effects of nicotine in different concentration on the common microbes in the oral cavity

2.2 煙草浸出液對(duì)口腔常見(jiàn)微生物生長(zhǎng)的影響

如表2所示，高濃度的煙草浸出液對(duì)草綠色鏈球菌、大腸埃希菌有明顯的抑制作用，而低濃度有明顯的促進(jìn)作用。不同濃度的煙草浸出液對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌均有不同程度的抑制作用，且與濃度無(wú)相關(guān)性。高濃度的煙草浸出液對(duì)白色假絲酵母菌有輕微促進(jìn)作用，低濃度對(duì)白色假絲酵母菌有明顯的促進(jìn)作用。

表2 煙草浸出液對(duì)口腔中常見(jiàn)微生物的影響Table 2 The effects of tobacco extract in different concentration on the common microbes in the oral cavity

2.3 煙霧提取物對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的影響

不同濃度的煙霧提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌均有抑制作用，且與濃度成正相關(guān)，見(jiàn)表3。

表3 煙霧提取物對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的影響Table 3 The effects of cigarette smoke extract in different concentration on the common microbes in the oral cavity

2.4 吸煙對(duì)志愿者口腔漱口液中微生物的影響

如表4所示，吸煙組白色假絲酵母菌的數(shù)量高于不吸煙組;吸煙組的草綠色鏈球菌和葡萄球菌數(shù)均顯著低于不吸煙組;奈瑟菌數(shù)量2組間無(wú)明顯差異。

表4 志愿者口腔漱口液微生物的比較Table 4 The comparison of the microbes in the oral cavity among the volunteers'mouthwash

3 討論

吸煙是心血管、呼吸、內(nèi)分泌等系統(tǒng)疾病的患病危險(xiǎn)因素，也可以引起黏膜過(guò)角化、白斑、牙周炎、牙齦炎等口腔疾病，因此，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注香煙與健康的關(guān)系。口腔由于富含營(yíng)養(yǎng)且與外界相通，是人體正常微生物群含量最多的部位［7］。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)吸煙對(duì)口腔中微生物影響的研究報(bào)道，國(guó)外相關(guān)研究也較為少見(jiàn)，且部分研究結(jié)果相互矛盾，如Ali等［4］認(rèn)為煙霧對(duì)口腔微生態(tài)中的主要細(xì)菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，Karina等［5］研究認(rèn)為尼古丁對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響作用，而Zonuz AT［6］等類似研究的結(jié)論卻是吸煙可促進(jìn)鏈球菌等口腔常見(jiàn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此，為了探討香煙對(duì)口腔微生物的影響及與人類健康的關(guān)系，本研究分別檢測(cè)了尼古丁、煙草浸出液、煙霧提取物對(duì)口腔微生物的影響，并比較了吸煙組與非吸煙組志愿者間微生物的差異，以客觀評(píng)價(jià)香煙在口腔疾病等方面的作用。香煙中的主要成分有尼古丁(Nicotine，煙堿)、酚類、醛類、有機(jī)酸，而香煙點(diǎn)燃后，不僅包含了煙草中所有的化學(xué)成分，同時(shí)比煙草本身又增加了一氧化碳和焦油等［8］。本研究分別觀察尼古丁純品、煙草浸出液和煙霧提取物對(duì)口腔微生物的影響，根據(jù)相關(guān)資料計(jì)算尼古丁的含量［9］，確定20支香煙浸泡于50 mL蒸餾水制成煙草浸出液。

本研究結(jié)果顯示，高濃度的尼古丁對(duì)細(xì)菌有不同程度的抑制作用，低濃度對(duì)細(xì)菌有不同程度的促進(jìn)作用，不同濃度的尼古丁對(duì)草綠色鏈球菌均有促進(jìn)作用;而不同濃度的煙草浸出液對(duì)不同的試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)的影響不同，不同濃度的煙霧提取物對(duì)試驗(yàn)菌株均有明顯的抑制作用。高濃度的煙霧提取物對(duì)大腸埃希菌、草綠色鏈球菌、白色假絲酵母菌等部分實(shí)驗(yàn)菌有抑制作用，而低濃度有明顯促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，這可能是由于煙草浸出液中不僅溶有尼古丁，還包括焦油等成分，這些成分在濃度低時(shí)能作為碳源、氮源，利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，而隨著濃度升高則顯示出對(duì)細(xì)菌的毒性作用。此外，不同濃度的煙霧提取物對(duì)指示菌均有顯著的抑制作用;相關(guān)研究表明，香煙燃燒釋放的煙霧含有3800多種有害成分，因此，煙霧提取物對(duì)指示菌的毒性作用大于煙草浸出液。

對(duì)志愿者漱口液中微生物的研究結(jié)果表明，吸煙一定程度上影響了口腔微生物的種類和數(shù)量。男生吸煙組較不吸煙組白色假絲酵母菌的數(shù)量有所增加，與煙草浸出液的結(jié)果一致，而與尼古丁、煙霧提取物的結(jié)果不符，這可能與口腔中pH值和各種酶的影響有關(guān)。吸煙組中鏈球菌及葡萄球菌的數(shù)目與不吸煙組相比有所減少，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，然而上述微生物數(shù)量的減少并不意味著疾病感染率的降低，反而可能破壞了口腔菌群的平衡及維持自穩(wěn)的能力，有可能促使口腔疾病的發(fā)生。

綜上所述，尼古丁、煙草浸出液、煙霧提取物對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的影響不同，并與其濃度有關(guān)，不同研究材料之間成分的差異也導(dǎo)致了結(jié)果的不同;此外，對(duì)志愿者的研究表明，香煙對(duì)口腔微生物的種類和數(shù)量的確有一定的影響。

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