一測(cè)多評(píng)法測(cè)定青錢(qián)柳中異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷的含量

張丁文，劉 悅，解生旭，司云珊，劉云雪，關(guān) 欣，徐雅娟*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定青錢(qián)柳中異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷的含量

張丁文1，劉 悅2，解生旭2，司云珊2，劉云雪1，關(guān) 欣1，徐雅娟2*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

目的 建立超高效液相色譜法測(cè)定青錢(qián)柳中異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷含量的一測(cè)多評(píng)法。方法 以阿福豆苷為內(nèi)參物，建立阿福豆苷與異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的相對(duì)校正因子，并用該校正因子進(jìn)行異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的含量計(jì)算（計(jì)算值），實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng);同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定藥材中3種黃酮含量（實(shí)測(cè)值），并比較計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的差異。結(jié)果經(jīng)測(cè)定異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷在藥材中的含量分別為1.403，1.314，1.633 mg/g;5批青錢(qián)柳藥材中3種異黃酮的含量計(jì)算值與實(shí)測(cè)值間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 以外標(biāo)法測(cè)定阿福豆苷，利用相對(duì)校正因子實(shí)現(xiàn)對(duì)異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷含量進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)準(zhǔn)確、可行。

青錢(qián)柳;含量測(cè)定;黃酮苷;超高效液相色譜

青錢(qián)柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinakaja）又名青錢(qián)李（江西）［1］，系青錢(qián)柳屬（Cyclocarya Ijinsk）落葉喬木［2］。因其葉甘甜滋潤(rùn)，民間常作甜茶飲［3-4］。研究［5-10］表明，黃酮類(lèi)成分是青錢(qián)柳相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中最多的一類(lèi)成分，含量很高，也是青錢(qián)柳中重要的活性成分，該類(lèi)成分在人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)中的攝入量與心腦血管等疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。因此，著力控制青錢(qián)柳藥材的質(zhì)量問(wèn)題勢(shì)在必行。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用一測(cè)多評(píng)法（Quantitative Analysis of Multi-Components By Single Marker，QAMS）［11］對(duì)青錢(qián)柳中3種黃酮成分進(jìn)行了含量測(cè)定，為青錢(qián)柳藥材的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent1200超高效液相色譜儀;青錢(qián)柳干燥葉購(gòu)自江西省九江市修水縣，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院徐國(guó)經(jīng)老師鑒定;阿福豆苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、異槲皮苷對(duì)照品均為實(shí)驗(yàn)室自制;乙腈（色譜純）;乙酸（分析純）;水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 AgilentXDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm）;流動(dòng)相:A為H2O∶HOAc=98∶2，（2%乙酸pH為3.0）。流動(dòng)相B為CH3CN，洗脫程序?yàn)?0～5min，20%B ～24%B;5 ～10 min，24%B ～30%B;10 ～12 min，30%B ～60%B，梯度洗脫;流速:0.4 mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:6.0 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定異槲皮苷4.94 mg，槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷 4.93 mg，阿福豆苷4.92 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得，保存于4℃冰箱，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取青錢(qián)柳干燥葉2.5 g，粉碎后置圓底燒瓶中，精密加入石油醚（60～90℃）75 mL，加熱回流提取1h，棄去提取液并揮至無(wú)醚味，加入75 mL甲醇加熱回流2次，每次1 h，合并提取液，加入75 mL乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后蒸干，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻，即得，保存于4℃冰箱，備用。

2.4 線性范圍 分別精密吸取濃度為0.197 6，0.197 2，0.196 8 mg/mL的異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、阿福豆苷對(duì)照品溶液 2，4，6，8，10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制各成分的線性關(guān)系曲線。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液6 μL，重復(fù)5次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算，3種黃酮成分峰面積平均值分別為6 194.7，4 959.6，4 549.2，RSD分別為0.69%，0.78%，0.75%。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 分別取青錢(qián)柳干燥葉粉碎2.5 g，共6分，精密稱定，按2.3項(xiàng)下的供試品制備方法制備，測(cè)定3種黃酮成分平均含量為1.403，1.314，1.633 mg/g，RSD 分別為2.55%，2.02%，2.52%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.3項(xiàng)下的供試品溶液6 μL，分別放置 0，2，4，6，8，10 h 后進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算，3種黃酮成分峰面積平均值分別為 4 653.0，3 850.8，3 884.6，RSD 分 別 為 0.95%，1.08%，2.10%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的青錢(qián)柳藥材干燥葉約1.25 g，精密稱定，平行6分，分別按樣品含量與對(duì)照品（1∶1）的比例加入一定量的對(duì)照品混合溶液，按2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行制備。測(cè)定，計(jì)算上述3種黃酮成分加樣回收率分別為102.54%，99.43%和100.28%，RSD分別為2.06%，4.00%，3.08%。

2.9 相對(duì)校正因子的建立

2.9.1 相對(duì)校正因子的測(cè)定 取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣 2，4，6，8，10 μL，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算待測(cè)組分與內(nèi)參物阿福豆苷間的相對(duì)校正因子，結(jié)果fⅡ/fⅣ平均值為1.358 8、fⅡ/fⅤ平均值為 1.091 2;RSD分別為1.29%，0.82%。

2.9.2 相對(duì)校正因子的重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2項(xiàng)下的方法，配制對(duì)照品的混合溶液平均4分，分別進(jìn)樣6 μL，測(cè)定3種黃酮成分的峰面積值。分別計(jì)算待測(cè)組分與內(nèi)參物間的相對(duì)校正因子，fⅡ/fⅣ平均值為1.354 7，fⅡ/fⅤ平均值為 1.088 4;RSD分別為0.04%，0.02%。

2.9.3 相對(duì)校正因子的耐用性考察

2.9.3.1 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 試驗(yàn)中采用Agilent 1200超高效液相色譜儀分別考察了Agilent XDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）及 Agilent SB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）2 種不同型號(hào)的色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，測(cè)得，AgilentSB-C18柱 fⅡ/fⅣ為 1.412 0，fⅡ/fⅤ為 1.137 2，AgilentXDB-C18柱 fⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;RSD 分別為3.45%，3.68%。

2.9.3.2 不同溫度對(duì)相對(duì)校正因子的影響 試驗(yàn)中采用Agilent1200超高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentXDBC18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色譜柱，在不同柱溫（25，30，35℃）條件下對(duì)相對(duì)校正因子進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得，25 ℃fⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;30 ℃fⅡ/fⅣ為 1.341 3，fⅡ/fⅤ為1.072 3;35 ℃fⅡ/fⅣ為1.351 8，fⅡ/fⅤ為1.094 6;2種校正因子的RSD分別為0.46%，1.05%。

2.9.3.3 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響 試驗(yàn)中采用Agilent 1200超高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentXDBC18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色譜柱，在不同流速（0.3，0.4，0.5 mL/min）條件下對(duì)相對(duì)校正因子進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得，0.3 mL/min fⅡ/fⅣ為 1.355 9，fⅡ/fⅤ為 1.090 7;0.4 mL/minfⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;0.5 mL/minfⅡ/fⅣ為 1.341 3，fⅡ/fⅤ為 1.072 2;2 種校正因子的RSD分別為0.56%，0.86%。

2.9.3.4 不同修飾劑對(duì)相對(duì)校正因子的影響 試驗(yàn)中采用Agilent 1200超高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentXDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色譜柱，考察了流動(dòng)相中加入不同的修飾劑對(duì)相對(duì)校正因子的影響，測(cè)得，2% 乙酸 fⅡ/fⅣ為 1.352 4，fⅡ/fⅤ為 1.079 6;2% 甲酸 fⅡ/fⅣ為1.357 4，fⅡ/fⅤ為1.091 5;2 種校正因子的RSD分別為0.26%，0.78%。

2.9.4 相對(duì)校正因子的確定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)取測(cè)定結(jié)果的平均值，最終確定的3種成分間的相對(duì)校正因子分別為:f360nmⅡ/Ⅳ =1.355 2;f360nmⅡ/Ⅴ =1.099 8。

3 待測(cè)成分色譜峰定位參數(shù)考察

“一測(cè)多評(píng)”法應(yīng)用的前提是如何將色譜峰準(zhǔn)確定位。本實(shí)驗(yàn)分別考察了采用不同進(jìn)樣量和不同型號(hào)色譜柱時(shí)待測(cè)成分與阿福豆苷色譜峰間的相對(duì)保留時(shí)間和保留時(shí)間差。結(jié)果表明，采用AgilentXDBC18柱不同進(jìn)樣量時(shí)RSD分別為1.93%、0.93%，采用AgilentSB-C18柱不同進(jìn)樣量時(shí)RSD分別為0.97%、0.48%，采用不同色譜柱時(shí)異槲皮苷和槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷與阿福豆苷相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.66%、0.32%，采用不同進(jìn)樣量、不同色譜柱保留時(shí)間差的RSD也均小于5%?？梢?jiàn)，與阿福豆苷色譜峰間的相對(duì)保留時(shí)間和保留時(shí)間差可作為其他2個(gè)待測(cè)成分色譜峰的定位參數(shù)。

4 數(shù)據(jù)比較

首先，應(yīng)用ESM法對(duì)5批青錢(qián)柳藥材中3種待測(cè)成分進(jìn)行多成分的同步測(cè)定，再用建立的QAMS法對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定位，并計(jì)算含量，最后將二者得到的結(jié)果以相對(duì)誤差進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，二者所得結(jié)果無(wú)顯著性差異，相對(duì)誤差＜5%，表明建立的青錢(qián)柳QAMS質(zhì)量評(píng)價(jià)模式具有較好的準(zhǔn)確性與可行性。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 QAMS與ESM測(cè)得的青錢(qián)柳藥材中3種黃酮類(lèi)成分含量

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選用甲醇作為提取溶劑，并用乙酸乙酯萃取的方法，目標(biāo)成分提取效率最高，較易操作，且干擾峰較少。流動(dòng)相中加入乙酸可以改善分離效果，使峰形更尖銳、對(duì)稱，防止拖尾。

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Determination of the content of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin of cyclocarya paliurus by QAMS

ZHANG Dingwen1，LIU Yue2，XIE Shengxu2，SI Yunshan2，LIU Yunxue1，GUAN Xin1，XU Yajuan2*
（1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.Jilin Academy of Chinese Medicine Sciences，Changchun 130012，China）

ObjectiveTo establish UPLC method for the determination of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin in Cyclocarya paliurus by QAMS.MethodsAsafzelin was used as an internal materials，the relative correction factor between asafzelin，isoquercitrin and quercetin-3-O-α-L-rhamnoside was established，And these correction factors were used to calculate the determination of isoquercitrin，quercetin（calculated value）to achieve QAMS;at the same time，the determination of 3 kind of flavonoids in herbs（measured value）was measured by the external standard method.ResultsThrough determination，the content of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin was 1.403 mg/g，1.314 mg/g，1.633 mg/g respectively;the calculated value of the content of 3 isoflavonoids in 5 batches of cyclocarya paliurus medicinal materials had no significant difference with measured value.ConclusionIt was correct and feasible to determinate asafzelin by ESM，and conduct quality evaluation of the content of isoquercitrin and quercetin-3-O-α-L-rhamnoside by using the relative correction factors.

cyclocarya paliurus;determination;flavonoid glycosides;ultra performance liquid chromatography

R284.2

A

2095－6258（2014）05－0810－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.018

科技部重大創(chuàng)制藥物專(zhuān)項(xiàng)（2009ZX09103-447）。

張丁文（1988－），女，碩士研究生。研究方向:藥物活性物質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)研究。

徐雅娟，電話:0431-86058690，電子信箱:1045758849@qq.com。

2014－05－19）