紫杉醇抗良性膽管瘢痕纖維化的最佳抵抗因素研究

宋飛，向盈盈，張小文Δ

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安醫(yī)院 口腔科，云南 昆明 650031）

紫杉醇抗良性膽管瘢痕纖維化的最佳抵抗因素研究

宋飛1，向盈盈2，張小文1Δ

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安醫(yī)院 口腔科，云南 昆明 650031）

目的探討紫杉醇（paclitaxel，PTX）抗良性膽管瘢痕纖維化的最佳抵抗因素，為臨床防治膽管良性瘢痕纖維化提供有效依據(jù)。方法體外培養(yǎng)人膽管上皮細(xì)胞（biliary epithelial cell，BEC），并將配制好的PTX藥物濃度梯度按0.001 uM、0.005 uM、0.1 uM、0.5 uM、1 uM加入細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h，MTT法檢測PTX對BEC半抑制率IC50，從而確定最佳PTX濃度；人膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)0 h，24 h，48 h，72 h，MTT法測 100 nM、250 nM、500 nM 3種不同含量的紫杉醇-殼聚糖緩釋膜（PTX-Chitosan Sustained release membrane，PTX-SRM）與最佳濃度PTX對BEC的抑制率，得到最佳濃度的PTX-SRM；細(xì)胞培養(yǎng)48 h，72 h后采用Western Blot和Realtime PCR方法檢測PTX及PTX-SRM對BECα-SMA、E-cadherin、Vimentin蛋白及基因表達變化。結(jié)果單獨PTX對良性膽管瘢痕發(fā)揮抵抗作用的最佳濃度為250 nM；PTX和PTX-SRM均能有效抑制BEC的增殖、轉(zhuǎn)化；中、低濃度的PTX-SRM對良性膽管瘢痕纖維化的治療效果最佳，最佳載藥量分別為100 nM、250 nM；PTX-SRM對BEC的抑制持續(xù)時間長于單獨PTX（P＜0.05）。結(jié)論PTX－SRM對BEC增殖、轉(zhuǎn)化的抑制作用優(yōu)于單獨PTX給藥，為臨床對良性膽管瘢痕的預(yù)防和治療提供了科學(xué)可行的新方法。

紫杉醇；良性瘢痕纖維化；抵抗；殼寡糖緩釋膜

1 材料與方法

1.1 材料 人膽管上皮細(xì)胞（ScienCell公司，貨號：5100），紫杉醇（重慶美聯(lián)制藥有限公司，貨號：G0411003）、PRIM 1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，貨號：11875-093），胰酶-EDTA消化液（Gibco公司，貨號：25200-056，），二甲基亞砜（sigma公司，貨號：D-2650），噻唑藍(lán)（美國 Sigma公司，貨號：0793），胎牛血清（Gibco公司，貨號：10099141），TGF-β1（美國 PeproTech公司，貨號：100-21c），ZW-A型微量振蕩器（金壇市白塔新寶儀器廠）。PT-3502酶標(biāo)分析儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司），MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（上海旦鼎國際有限公司），H1650-w型微量離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），紫杉醇分別配制濃度為0.001 uM、0.005 uM、0.1 uM、0.5 uM、1 uM的溶液，體積均為20mL。

3種不同濃度的紫杉醇-N-琥珀酰化羥乙基殼聚糖緩釋膜為本實驗室前期自制合成，紫杉醇載藥量分別為100 nM、250 nM、500 nM。

1.2 實驗分組

1.2.1 體外培養(yǎng)BEC，加sns／m L TGF-b1誘導(dǎo)形成膽管瘢痕，根據(jù)不同處理分為A、B、C、D、E共5組，其中A組為未載藥SRM組；B組為最佳PTX濃度組；C組為100 nM PTX-SRM組；D組為250 nM PTX-SRM組；E組為500 nM PTX-SRM組。

1.2.2 試驗分為6組：①對照組為單獨BEC培養(yǎng)；②TGF-β1組為 BEC＋5 ng／mL TGF-β1；③TGF-β1＋PTX（48 h）組為在48小時時間點下，BEC＋5 ng／mL TGF-β1＋250 nM PTX；④TGF-β1＋PTX（72 h）組為在 72小時時間點下，BEC＋5 ng／mL TGF-β1＋250 nM PTX；⑤TGF-β1＋SRM（48 h）組為在48小時時間點下，BEC＋5 ng／m L TGF-β1＋250 nM PTX-SRM；⑥TGF-β1＋SRM（72 h）組為在72小時時間點下，BEC＋5ng／mL TGF-β1＋250 nM PTX-SRM。

1.3 實驗步驟

1.3.1 MTT法測定細(xì)胞生長抑制率，確定IC50：將處于對數(shù)生長期的BEC用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個／mL并接種于96孔板，每孔50μL。接種細(xì)胞分別為空白組（不含細(xì)胞的培養(yǎng)液）、細(xì)胞對照組（含單細(xì)胞的培養(yǎng)液）、紫杉醇藥物實驗組（濃度梯度為0.001 uM、0.005 uM、0.1 uM、0.5 uM、1 uM）。每排12個孔，邊緣孔用 Hank液填充。紫杉醇原濃度配制為50 uM。孵箱常規(guī)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束時加入5mg／mL的噻唑藍(lán)20μL，繼續(xù)孵育4 h后離心棄上清，加入DMSO 150μL，90 rpm搖床上振蕩5min。在酶標(biāo)儀上測定490 nm的吸光度值（A值），計算公式：抑制率＝1-（實驗組A值一空白組A值）／（對照組A值一空白組A值）。確定紫杉醇溶液抑制一半膽管上皮細(xì)胞生長時的濃度（IC50），選擇最佳紫杉醇的濃度。

1.3.2 在PTX最佳抑制濃度的前提下，按照1.2.1實驗分組，在0小時，24小時，48小時，72小時時間點下用MTT法測定PTX-SRM及PTX對BEC生長的增殖的影響。增殖率＝（實驗組A值一空白組A值）／（對照組A值一空白組A值）（MTT方法同3.1.1）。PTX-SRM裁剪大小為0.25 cm2放入具有PTX-SRM實驗組培養(yǎng)板中。確定PTX-SRM的最佳載藥量。

1.3.3 按照1.2.2實驗分組，Real-time PCR方法檢測膽管上皮細(xì)胞α-SMA、E-cadherin、Vimentin mRNA表達：收集 PTX及PTX-SRM預(yù)處理48，72 h的膽管上皮細(xì)胞，PBS洗滌2次，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，取同等量細(xì)胞，TRizol試劑盒抽取細(xì)胞總 mRNA。2μLmRNA，總體系為20μL逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。PCR反應(yīng)體系為 25μL：2.5μL 10×Buffer，1.5μL 25 mmol／L MgCl2，0.5μL dNTP，0.5μLcDNA，各 0.5μL上下游引物，0.5μL Taq DNA聚合酶，18.5μL去離子水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；96℃1 m in、60℃15 s共40個循環(huán)，60℃延伸時采集熒光信號。所有PCR反應(yīng)均在LightCycler核酸擴增儀上進行。比較單獨藥物PTX及PTX-SRM的療效差異。各基因引物及序列見表1。

表1 各基因引物及序列

1.3.4 按照1.2.2實驗分組，Western-blot檢測 α-SMA、E-cadherin、Vimentin蛋白表達：制備聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品20μg加入上樣孔，進行80 V／120 V電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜；1×TBST洗滌，加5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；加入α-SMA、E-cadherin、Vimentin兔抗人單克隆抗體（1∶200）和β-actin兔抗人單克隆抗體（1∶400），4℃孵育過夜；1×TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000），37℃孵育1 h，曝光、分析。比較單獨藥物PTX及PTX-SRM的療效差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料采用“±s”，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測PTX對BEC的影響

MTT法檢測48 h時PTX對BEC的IC50為213.8 nM，因此我們選擇250 nM進行后續(xù)實驗（見圖1）。

圖1 不同濃度紫杉醇對膽管上皮細(xì)胞增殖的抑制率Fig.1 The rate of Inhibition on the proliferation of bile duct epithelial cell in different concentrations of paclitaxel

2.2 MTT法檢測PTX-SRM及PTX對BEC增殖的影響按照1.2.1實驗分組，MTT法檢測 0、24 h、48 h、72 h各個時間點、不同組的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示：無載藥的SRM對BEC也具有一定的抑制作用；100 nM PTX-SRM與250 nMPTX在48 h時間點對細(xì)胞抑制率無差別，48 h以后仍有抑制作用（P＜0.05），而250 nM PTX-SRM較250 nM PTX可以有效抑制BEC的增殖（P＜0.05），48 h抑制效果最好，72 h抑制率略有下降；500 nM PTX-SRM較250 nMPTX具有更加明顯抑制細(xì)胞增殖效果（P＜0.05）。PTX-SRM抑制BEC的增殖具有濃度依賴性，高濃度PTX-SRM產(chǎn)生的細(xì)胞增殖抑制作用可能是由于PTX的毒性引起。本實驗中選用250 nM PTX-SRM進行后續(xù)試驗。（見圖2）。細(xì)胞增殖藥效（見圖3，圖4）。

圖2 PTX-SRM及PTX對膽管上皮細(xì)胞增殖的影響*P＜0.05，與SRM組相比；＃P＜0.05，與單純PTX處理組相比Fig.2 Effect of PTX-SRM and PTX on bile duct epithelial cells proliferation*P＜0.05，compared with SRM group；＃P＜0.05，conpared with single PTX treatment group

圖3 PTX-SRM及PTX對TGF-β1誘導(dǎo)的E-cadherin、Vimentin和α-SMA mRNA表達的影響*P＜0.05，與對照組相比；＃P＜0.05，與單純PTX處理組相比Fig.3 Effect of PTX-SRM and PTX on the expression of E-cadherin，Vimentin andα-SMA mRNA induced on TGF-β1*P＜0.05，compared with control group；＃P＜0.05，compared with single PTX treatment group

2.3 PTX-SRM及PTX對TGF-β1誘導(dǎo)BEC的上皮標(biāo)志物（E-cadherin）和間葉標(biāo)志物（Vimentin和 α-SMA）mRNA及蛋白水平表達的影響。

按照1.2.2實驗分組，Real-time PCR結(jié)果顯示：與對照組相比，TGF-β1可以誘導(dǎo)BEC的上皮標(biāo)志物E-cadherinmRNA及蛋白表達下降，而Vimentin和α-SMA mRNA及蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。48 h時，單純 PTX組和 PTX-SRM組均升高了上皮標(biāo)志物E-cadherin mRNA及蛋白表達，而降低了間葉標(biāo)志物Vimentin和α-SMA的mRNA及蛋白表達水平（P＜0.05）。而72 h時，單純PT組的E-cadherinmRNA及蛋白表達水平較48 h降低，但仍高于TGF-β1組，Vimentin和α-SMA的mRNA及蛋白表達水平較48小時升高，但低于 TGF-β1組（P＜0.05）；而PTX-SRM組各指標(biāo)的mRNA及蛋白表達水平基本與48 h持平。72小時后，PTX-SRM組E-cadherin mRNA及蛋白表達水平較單獨使用PTX高，而Vimentin和α-SMA的mRNA及蛋白表達水平低（P＜0.05），說明PTX-SRM較單純PTX組有持續(xù)性的抑制

圖4 PTX-SRM及PTX對TGF-β1誘導(dǎo)的 E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表達的影響Fig.4 Effect of PTX-SRM and PTX on the expression of E-cadherin，Vimentin andα-SMA protein induced on TGF-β1

3 討論

膽管在肝臟外側(cè)的節(jié)段管壁比較薄，含有豐富的彈性纖維。隨著醫(yī)學(xué)科技水平的發(fā)展，微創(chuàng)手術(shù)已經(jīng)變的非常普及，尤其是腹腔鏡下進行腹部手術(shù)時，很容易醫(yī)源性的對膽管造成刮痕［3-4］。目前膽道瘢痕形成的具體機制不甚清楚。研究認(rèn)為［5-6］上皮細(xì)胞可以發(fā)生上皮-間葉樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化EMT。EMT后上皮細(xì)胞失去了極性，獲得了間質(zhì)樣細(xì)胞的表型，表現(xiàn)為E-鈣黏蛋白等上皮性細(xì)胞標(biāo)志物表達下調(diào)，α-SMA、Vimentin等間葉細(xì)胞標(biāo)志物表達上調(diào)，細(xì)胞的運動和侵襲能力增強，其中α-SMA被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞特異性的標(biāo)記物。目前對于膽管上皮細(xì)胞是否參與EMT的研究很少。當(dāng)膽管出現(xiàn)損傷，在炎性介質(zhì)特別是TGF-β1刺激下會激活大量的成纖維細(xì)胞活化、增殖，過多的成纖維細(xì)胞會堆積在膽管管壁并部分轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進一步引起導(dǎo)管攣縮、細(xì)胞外基質(zhì)增多，導(dǎo)致管壁增生，引發(fā)膽道狹窄甚至閉鎖，造成嚴(yán)重的并發(fā)癥［7-8］。本研究利用TGF-β1與膽管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬膽道損傷的微環(huán)境，我們觀察到TGF-β1刺激膽管上皮細(xì)胞后，膽管上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，呈現(xiàn)梭形成纖維細(xì)胞樣改變；膽管上皮細(xì)胞標(biāo)識物E-cadherin蛋白及基因表達下調(diào)，而間葉標(biāo)識物α-SMA、vimentin蛋白及基因表達上調(diào)，說明TGF-β1可使膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。本實驗證實膽管上皮細(xì)胞同樣可以發(fā)生EMT，EMT后肌成纖維細(xì)胞數(shù)量進一步增加，細(xì)胞外膠原增多，促進膽管瘢痕狹窄。當(dāng)前臨床對逆轉(zhuǎn)膽管上皮細(xì)胞EMT的良藥尚未研制成功，只能等到膽道發(fā)病之后使用手術(shù)切除或擴撐的方法。因此尋找一種安全有效的藥物對良性瘢痕纖維化進行抵抗，成為了當(dāng)前研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇與紫杉醇-殼聚糖緩釋膜均能抑制膽管上皮細(xì)胞的增殖。與單純PTX用藥組相比，低、中濃度的PTX-殼聚糖緩釋膜可以更長時間的有效抑制膽管上皮細(xì)胞的增殖。單純PTX組對膽管上皮細(xì)胞的抑制率在48 h達到最高，然后逐漸降低，72 h后抑制效果顯著下降。而低、中濃度的PTX-殼聚糖緩釋膜在72 h時仍能保持對膽管上皮細(xì)胞的抑制。高濃度PTX-殼聚糖緩釋膜能夠顯著性抑制細(xì)胞增殖，且抑制率最高，說明在該濃度下，細(xì)胞的增殖抑制可能是因為PTX的毒理作用，這對于體內(nèi)用藥的實際情況沒有意義。我們猜測不同濃度之間的紫杉醇-殼聚糖緩釋膜的機理不盡相同：高濃度的PTX-殼聚糖緩釋膜可以阻滯膽管成纖維細(xì)胞周期于G2／M期，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而低、中濃度的PTX-殼聚糖緩釋膜能使細(xì)胞阻滯于G1期，但并不會引起細(xì)胞凋亡，主要是抑制細(xì)胞分裂、遷移、轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)合成等一系列微管相關(guān)功能，故本實驗選擇250 nM PTXSRM進行試驗。另外通過對比紫杉醇-殼聚糖緩釋膜與單獨紫杉醇對膽管上皮細(xì)胞蛋白、基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)紫杉醇-殼聚糖緩釋膜能更好的抑制E-cadherin蛋白及基因表達下調(diào)，以及α-SMA、vimentin蛋白及基因表達上調(diào)，其療效明顯優(yōu)于單獨使用紫杉醇。為臨床上以纖維化為主的膽道疾病，如肝膽管結(jié)石病、硬化性膽管炎和膽道腫瘤等提供新的的治療方法。

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（編校：吳茜）

Research on optimum resistance factors of paclitaxel against benign biliary scar fibrosis

SONG Fei1，XIANG Ying-ying2，ZHANG Xiao-wen1Δ

（1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，China；2.Department of Stomatology，The Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650051，China）

ObjectiveTo discuss the best resistance factors of paclitaxel（Taxinol）on benign biliary scar fibrosis，in order to provide an effective basis for clinical prevention and treatment of benign biliary scar fibrosis.MethodsHuman bile ductepithelial cellswere cultured in vitro，the prepared PTX at0.001 uM，0.005 uM，0.1 uM，0.5 uM and 1 uM concentration were separately added into cells for48 h.The half inhibitory rate of BEC（IC50）were determined by MTT and the optimal concentration were confirmed.Human bile ductepithelial cellswere cultured in 0 h，24 h，48 h and 72 h，the inhibitory rate of BEC at 100 nM，250 nM，and 500 nM PTX-Chitosan Sustained release membranes and the optimal concentration of PTX were determined by MTT and the optimal concentration of PTX-SRM were obtained.Human bile duct epithelial cells were cultured for 48 h and 72 h，the mRNA and protein expression ofα-SMA，E-cadherin，Vimentin were detected by Western Blot and Real-time PCR methods.ResultsThe optimum resistance concentration of PTX to benign biliary scar was 250 nM.PTX and PTX-SRM could effectively inhibit the proliferation and transformation of BEC，and the best effective treatments to resist benign biliary scar fibrosiswere low and middle concentrations of PTX-SRM，the best drug loadingwere 100 nM and 250 nM.The inhibition duration of PTX-SRM on BEC was longer than PTX alone（P＜0.05）.ConclusionThe inhibition of PTX-SRM on BEC proliferation and transformation isbetter than the single drug of PTX，which provides a new scientific and feasiblemethod for clinicalprevention and treatment of benign biliary scar.

paclitaxel；benign fibrosis；resistance；chitosan sustained releasemembrane

R33；R285.5

A

1005－1678（2014）03－0012－04

良性膽管瘢痕是指由于膽道手術(shù)，膽道細(xì)菌、病毒感染，以及結(jié)石炎癥等原因?qū)е碌哪懝芄艿礼：郏?］。當(dāng)膽管產(chǎn)生瘢痕的同時，也有大量的炎性介質(zhì)產(chǎn)生，特別是轉(zhuǎn)化生子因子-b1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）誘導(dǎo)膽管粘膜下自身的成纖維細(xì)胞通過增殖生長對瘢痕部位進行修復(fù)，導(dǎo)致膽管管壁增生引發(fā)膽管狹窄甚至閉鎖［2］，產(chǎn)生一系列不良的病狀。但對TGF-b1誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞（biliary epithelial cell，BEC）發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transitions，EMT）轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的報道很少。當(dāng)前臨床對膽道閉鎖以及狹窄常規(guī)的治療方法為手術(shù)治療，但手術(shù)治療的質(zhì)量較低，常會引發(fā)膽道良性瘢痕的再生，因此選擇一種能避免此現(xiàn)象且對良性膽管瘢痕具有高效安全作用的治療藥物成為目前研究熱點。本研究采用自制不同濃度紫杉醇-N-琥珀?；u乙基殼聚糖緩釋膜和單獨紫杉醇（Paclitaxel；taxinol，PTX；Taxol）用藥對膽管上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化進行對比，探索抗良性膽管瘢痕纖維化的最佳抵抗因素。

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（81260084）

宋飛，男，博士，研究方向：肝膽胰外科，E-mail：85291753＠qq.com；張小文，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師、教授，研究方向：肝膽胰外科，E-mail：283073084＠qq.com。