余甘子葉藥材的HPLC指紋圖譜研究

毛健+++劉振杰

[摘要] 目的 建立余甘子葉的指紋圖譜。 方法 采用高效液相色譜法測定，乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，流速1.0 ml/min，柱溫25℃，紫外檢測波長218 nm。 結(jié)果 余甘子葉中有15個(gè)共有峰被確定為指紋峰，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件評(píng)價(jià)10批余甘子葉指紋圖譜的相似性，其結(jié)果均>0.9。 結(jié)論 該方法簡便，穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好，可用于余甘子葉的鑒別，作為質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞] 余甘子葉；高效液相色譜法；指紋圖譜

[中圖分類號(hào)] R284.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2014）06（b）-0011-04

Study on HPLC fingerprint analysis of Phyllanthus emblica L.

MAO Jian1 LIU Zhen-jie2▲

1.Department of Clinical medicine,People′s Hospital of Fuchuan County in Hezhou City of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Fuchuan 542700,China;2.Conservation Center,Guangxi Institute of Medicinal Plant,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530023,China

[Abstract] Objective To establish a method of fingerprint analysis on Phyllanthus emblica L. by HPLC. Methods The chromatographic finger-prints were obtained by HPLC.The detective wave-length was set at 218 nm;the flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was maintained at 25℃. Results 15 co-possessing peaks were selected as the fingerprint peaks of Phyllanthus emblica L. and good similarities with correlation coefficients higher than 0.9 were found in fingerprints between the different samples of Phyllanthus emblica L. and the standard fingerprint. Conclusion The method with good reproducibility is simple and accurate,it can be used as an effective quality control method for Phyllanthus emblica L.

[Key words] Phyllanthus emblica L.;High performance of liquid chromatography;Fingerprint

余甘子葉（Phyllanthus emblica L.）系大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）余甘子Phyllanthus emblical L.落葉小喬木或灌木的葉[1]，余甘子樹在我國資源豐富，收載于1978年版《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》、1974年出版的《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》和多版《中華人民共和國藥典》，別名有橄欖、滇橄欖、油甘子、山油甘、庵摩勒、牛甘子、喉甘子、楊甘等,余甘子果果實(shí)生食酸甜酥脆，初食味酸澀，后回味甘甜爽口，故名余甘[2]。余甘子味甘、酸、澀、性涼，具有化痰止咳，健胃消食，清熱生津，保肝解毒等功效[3]。主治感冒發(fā)熱、咳嗽、咽喉痛、白喉、煩熱口干、消化不良、腹痛、慢性肝炎、高血壓、肥胖癥、高脂血癥、濕熱性水腫、尿頻、血病、赤巴病、培根病、肝病、心臟病，以治療血熱血瘀引起的血病為長[4]。近年研究表明余甘子具有抗菌[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[8-9]、抗乙型肝炎病毒[10]、保肝[11]、增強(qiáng)免疫[12-13]等作用。余甘子有多種化學(xué)成分，藥理活性研究主要集中在多酚類成分上，槲皮素、沒食子酸為其有效成分[14-15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)余甘子葉進(jìn)行指紋圖譜研究，以期對(duì)其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供有效方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀；含在線真空脫氣機(jī)；高壓四元梯度泵；可變波長檢測器；二極管陣列檢測器Agilent1100；Series色譜工作站（美國安捷倫科技公司）；SB3200T超聲波清洗儀（上海能信超聲有限公司）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純，乙酸乙酯、磷酸及其他試劑均為分析純。水為超純水。槲皮素對(duì)照品和沒食子酸對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供（槲皮素對(duì)照品批號(hào)：110081-200406；沒食子酸對(duì)照品批號(hào)：110831-200302）。

1.3 藥材

實(shí)驗(yàn)所用余甘子葉藥材于廣西各地及云南玉溪收集，產(chǎn)地和采收時(shí)間見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物教研室劉壽養(yǎng)副教授鑒定為余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥葉。

表1 余甘子葉產(chǎn)地和批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

取余甘子葉粗粉1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 ml，密塞，稱重量。靜置1 h，超聲30 min后放冷，補(bǔ)重，濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml，揮干，殘?jiān)?5 ml水溶解至分液漏斗中，加入乙酸乙酯振搖提取3次，每次25 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，?5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液為供試品溶液。

2.2 提取溶劑的考察

比較水、無水乙醇、甲醇等提取溶劑，結(jié)果表明以甲醇、無水乙醇提取時(shí)，所得的色譜圖中的色譜峰數(shù)較多；余甘子葉的現(xiàn)代研究表明，沒食子酸和槲皮素為余甘子葉的有效成分，所以以其沒食子酸和槲皮素含量計(jì)算，用甲醇為溶劑，藥材中沒食子酸和槲皮素提取較完全[16]。經(jīng)綜合考慮，選定提取溶劑為甲醇。

2.3 超聲時(shí)間的考察

樣品分別超聲20、30、40 min，結(jié)果表明，超聲的時(shí)間為30 min以上，以其沒食子酸和槲皮素含量計(jì)算，藥材提取較完全。故選定提取時(shí)間為超聲30 min。

2.4 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫（表2）；柱溫25℃；檢測波長218 nm；進(jìn)樣量5 μl。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)取批號(hào)為200701藥材，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.42%，相對(duì)峰面積RSD<2.94%，結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為200701藥材，制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣檢測共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.30%，相對(duì)峰面積RSD<2.47%，結(jié)果表明，常溫下樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為200701藥材5份，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.65%，相對(duì)峰面積RSD<2.78%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.6 余甘子葉HPLC指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.6.1 指紋圖譜選擇及特征峰的標(biāo)定測定10批余甘子葉88 min內(nèi)指紋圖譜，獲得15個(gè)共有峰，由指紋圖譜可以看出1號(hào)峰峰面積積分百分比較大，分離度及峰形較好，因此選擇1號(hào)峰作為參照峰，標(biāo)號(hào)為S，其他特征峰依次標(biāo)號(hào)為S，2，3，……，15。采用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件對(duì)10批余甘子葉圖譜進(jìn)行處理得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（圖1）和指紋圖譜縱向疊加圖（圖2）。

圖1 余甘子葉標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜

圖2 10批余甘子葉的HPLC指紋圖譜縱向疊加圖

2.6.2 余甘子葉指紋圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的確定采用10批余甘子葉的指紋圖譜，選用1號(hào)峰作為參照峰，選取10批樣品的共有峰共15個(gè)，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間（表3）和相對(duì)峰面積（表4）。

2.6.3 指紋圖譜相似度的計(jì)算采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件對(duì)10批余甘子葉指紋圖譜進(jìn)行處理得到指紋圖譜相似度分析結(jié)果。10批次不同產(chǎn)地余甘子葉樣品的HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果均>0.9，分別為0.966、0.969、0.973、0.981、0.931、0.902、0.963、0.955、0.983、0.974，表明各批次余甘子葉藥材與對(duì)照指紋圖譜有較好的一致性。

3 討論

余甘子葉藥材的成分復(fù)雜，本文通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相洗脫程序，使各成分在整個(gè)分析時(shí)間段內(nèi)充分分離洗脫。在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇，本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸系統(tǒng)，結(jié)果表明各成分在乙腈-水、甲醇-水中無法分離，峰形差。在酸性流動(dòng)相中，磷酸可改善其分離度與峰形，對(duì)比甲醇-磷酸系統(tǒng)、乙腈-磷酸，前者洗脫能力較弱，各組分出峰時(shí)間太慢，色譜圖基線漂移，不能達(dá)到中藥指紋圖譜色譜峰基線分離的要求，故本文選用乙腈-磷酸系統(tǒng)。經(jīng)過多次優(yōu)化發(fā)現(xiàn)在100 min內(nèi)能較好地分離余甘子葉中各組分，重現(xiàn)性良好。

本文考察了三種不同的色譜柱對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果表明，同一色譜方法，不同色譜柱，會(huì)產(chǎn)生不同的分離效果，使得某些成分無法達(dá)到基線分離，同時(shí)，對(duì)柱效、峰形也有不同程度的影響。美國熱電BDS色譜柱在實(shí)驗(yàn)過程中能使各主要有效成分有較好的分離效果，故本文選擇了美國熱電BDS色譜柱。

余甘子葉中已知成分有沒食子酸、槲皮素，兩者最大吸收波長為270 nm和370 nm，本文根據(jù)此特點(diǎn)，用二極管陣列檢測器，分別在210、218、258、270、280、300、360 nm檢測色譜圖，并同時(shí)獲得全波長三維色譜圖，結(jié)果表明218 nm的色譜圖能給出最多峰信息，故本文最終選定218 nm為檢測波長。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10批指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，但各成分的共有色譜峰峰面積存在一定差異。此研究為快速鑒別和區(qū)分不同來源的余甘子葉以及進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行全面質(zhì)量控制研究提供了科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)對(duì)于余甘子葉藥材的選購和用藥具有一定的指導(dǎo)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：167.

[2]王輝.余甘子的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2011，13（11）：52.

[3]周濤，邱德文.民族藥余甘子的本草藥學(xué)概況[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24（3）：3.

[4]羅蘭.閩藥余甘子藥理作用及提取分離方法研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2013，25（11）：18

[5]鐘振國，曾春蘭.余甘子葉提取物體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材，2008，31（3）：428.

[6]曾春蘭，鐘振國.余甘子葉提取物體外抗腫瘤作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（3）：580.

[7]潘國慶，趙旭升，蔣炘治.余甘子抗氧化作用的研究[J].青?？萍?，2007，12（6）：33.

[8]王綠婭，王大全，秦彥文，等.余甘子抗脂質(zhì)過氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（10）：505.

[9]劉麗梅，高政，李寶文.余甘子對(duì)實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔的影響[J].中國臨床康復(fù)，2003，7（5）：766.

[10]黃正昌，鄧學(xué)龍，朱宇同，等.臺(tái)灣細(xì)葉油柑體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（3）：260.

[11]李萍，謝金鮮，林啟云.民族藥余甘子對(duì)D2半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2003，12（3）：161.

[12]羅春麗.余甘子對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用及免疫調(diào)節(jié)的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：155.

[13]崔炳權(quán)，何震宇，楊澤民，等.余甘子提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1920.

[14]陳國珍，張穎君，蔡文鋒，等.余甘子中水解單寧類化合物體外抗氧化活性研究[J].中國藥理通訊，2003，20（1）：5.

[15]梁臣艷，甄漢深，劉振杰，等.廣西余甘子葉醋酸乙酯部位化學(xué)成分的研究[J].中成藥，2009，31（5）：761

[16]劉曉麗，趙謀明.余甘子果汁活性成分與抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，23（5）：151.

（收稿日期：2014-03-08本文編輯：郭靜娟）

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為200701藥材，制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣檢測共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.30%，相對(duì)峰面積RSD<2.47%，結(jié)果表明，常溫下樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為200701藥材5份，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.65%，相對(duì)峰面積RSD<2.78%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.6 余甘子葉HPLC指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.6.1 指紋圖譜選擇及特征峰的標(biāo)定測定10批余甘子葉88 min內(nèi)指紋圖譜，獲得15個(gè)共有峰，由指紋圖譜可以看出1號(hào)峰峰面積積分百分比較大，分離度及峰形較好，因此選擇1號(hào)峰作為參照峰，標(biāo)號(hào)為S，其他特征峰依次標(biāo)號(hào)為S，2，3，……，15。采用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件對(duì)10批余甘子葉圖譜進(jìn)行處理得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（圖1）和指紋圖譜縱向疊加圖（圖2）。

圖1 余甘子葉標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜

圖2 10批余甘子葉的HPLC指紋圖譜縱向疊加圖

2.6.2 余甘子葉指紋圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的確定采用10批余甘子葉的指紋圖譜，選用1號(hào)峰作為參照峰，選取10批樣品的共有峰共15個(gè)，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間（表3）和相對(duì)峰面積（表4）。

2.6.3 指紋圖譜相似度的計(jì)算采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件對(duì)10批余甘子葉指紋圖譜進(jìn)行處理得到指紋圖譜相似度分析結(jié)果。10批次不同產(chǎn)地余甘子葉樣品的HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果均>0.9，分別為0.966、0.969、0.973、0.981、0.931、0.902、0.963、0.955、0.983、0.974，表明各批次余甘子葉藥材與對(duì)照指紋圖譜有較好的一致性。

3 討論

余甘子葉藥材的成分復(fù)雜，本文通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相洗脫程序，使各成分在整個(gè)分析時(shí)間段內(nèi)充分分離洗脫。在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇，本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸系統(tǒng)，結(jié)果表明各成分在乙腈-水、甲醇-水中無法分離，峰形差。在酸性流動(dòng)相中，磷酸可改善其分離度與峰形，對(duì)比甲醇-磷酸系統(tǒng)、乙腈-磷酸，前者洗脫能力較弱，各組分出峰時(shí)間太慢，色譜圖基線漂移，不能達(dá)到中藥指紋圖譜色譜峰基線分離的要求，故本文選用乙腈-磷酸系統(tǒng)。經(jīng)過多次優(yōu)化發(fā)現(xiàn)在100 min內(nèi)能較好地分離余甘子葉中各組分，重現(xiàn)性良好。

本文考察了三種不同的色譜柱對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果表明，同一色譜方法，不同色譜柱，會(huì)產(chǎn)生不同的分離效果，使得某些成分無法達(dá)到基線分離，同時(shí)，對(duì)柱效、峰形也有不同程度的影響。美國熱電BDS色譜柱在實(shí)驗(yàn)過程中能使各主要有效成分有較好的分離效果，故本文選擇了美國熱電BDS色譜柱。

余甘子葉中已知成分有沒食子酸、槲皮素，兩者最大吸收波長為270 nm和370 nm，本文根據(jù)此特點(diǎn)，用二極管陣列檢測器，分別在210、218、258、270、280、300、360 nm檢測色譜圖，并同時(shí)獲得全波長三維色譜圖，結(jié)果表明218 nm的色譜圖能給出最多峰信息，故本文最終選定218 nm為檢測波長。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10批指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，但各成分的共有色譜峰峰面積存在一定差異。此研究為快速鑒別和區(qū)分不同來源的余甘子葉以及進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行全面質(zhì)量控制研究提供了科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)對(duì)于余甘子葉藥材的選購和用藥具有一定的指導(dǎo)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：167.

[2]王輝.余甘子的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2011，13（11）：52.

[3]周濤，邱德文.民族藥余甘子的本草藥學(xué)概況[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24（3）：3.

[4]羅蘭.閩藥余甘子藥理作用及提取分離方法研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2013，25（11）：18

[5]鐘振國，曾春蘭.余甘子葉提取物體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材，2008，31（3）：428.

[6]曾春蘭，鐘振國.余甘子葉提取物體外抗腫瘤作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（3）：580.

[7]潘國慶，趙旭升，蔣炘治.余甘子抗氧化作用的研究[J].青?？萍迹?007，12（6）：33.

[8]王綠婭，王大全，秦彥文，等.余甘子抗脂質(zhì)過氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（10）：505.

[9]劉麗梅，高政，李寶文.余甘子對(duì)實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔的影響[J].中國臨床康復(fù)，2003，7（5）：766.

[10]黃正昌，鄧學(xué)龍，朱宇同，等.臺(tái)灣細(xì)葉油柑體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（3）：260.

[11]李萍，謝金鮮，林啟云.民族藥余甘子對(duì)D2半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2003，12（3）：161.

[12]羅春麗.余甘子對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用及免疫調(diào)節(jié)的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：155.

[13]崔炳權(quán)，何震宇，楊澤民，等.余甘子提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1920.

[14]陳國珍，張穎君，蔡文鋒，等.余甘子中水解單寧類化合物體外抗氧化活性研究[J].中國藥理通訊，2003，20（1）：5.

[15]梁臣艷，甄漢深，劉振杰，等.廣西余甘子葉醋酸乙酯部位化學(xué)成分的研究[J].中成藥，2009，31（5）：761

[16]劉曉麗，趙謀明.余甘子果汁活性成分與抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，23（5）：151.

（收稿日期：2014-03-08本文編輯：郭靜娟）

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為200701藥材，制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣檢測共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.30%，相對(duì)峰面積RSD<2.47%，結(jié)果表明，常溫下樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為200701藥材5份，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.65%，相對(duì)峰面積RSD<2.78%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.6 余甘子葉HPLC指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.6.1 指紋圖譜選擇及特征峰的標(biāo)定測定10批余甘子葉88 min內(nèi)指紋圖譜，獲得15個(gè)共有峰，由指紋圖譜可以看出1號(hào)峰峰面積積分百分比較大，分離度及峰形較好，因此選擇1號(hào)峰作為參照峰，標(biāo)號(hào)為S，其他特征峰依次標(biāo)號(hào)為S，2，3，……，15。采用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件對(duì)10批余甘子葉圖譜進(jìn)行處理得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（圖1）和指紋圖譜縱向疊加圖（圖2）。

圖1 余甘子葉標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜

圖2 10批余甘子葉的HPLC指紋圖譜縱向疊加圖

2.6.2 余甘子葉指紋圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的確定采用10批余甘子葉的指紋圖譜，選用1號(hào)峰作為參照峰，選取10批樣品的共有峰共15個(gè)，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間（表3）和相對(duì)峰面積（表4）。

2.6.3 指紋圖譜相似度的計(jì)算采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件對(duì)10批余甘子葉指紋圖譜進(jìn)行處理得到指紋圖譜相似度分析結(jié)果。10批次不同產(chǎn)地余甘子葉樣品的HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果均>0.9，分別為0.966、0.969、0.973、0.981、0.931、0.902、0.963、0.955、0.983、0.974，表明各批次余甘子葉藥材與對(duì)照指紋圖譜有較好的一致性。

3 討論

余甘子葉藥材的成分復(fù)雜，本文通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相洗脫程序，使各成分在整個(gè)分析時(shí)間段內(nèi)充分分離洗脫。在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇，本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸系統(tǒng)，結(jié)果表明各成分在乙腈-水、甲醇-水中無法分離，峰形差。在酸性流動(dòng)相中，磷酸可改善其分離度與峰形，對(duì)比甲醇-磷酸系統(tǒng)、乙腈-磷酸，前者洗脫能力較弱，各組分出峰時(shí)間太慢，色譜圖基線漂移，不能達(dá)到中藥指紋圖譜色譜峰基線分離的要求，故本文選用乙腈-磷酸系統(tǒng)。經(jīng)過多次優(yōu)化發(fā)現(xiàn)在100 min內(nèi)能較好地分離余甘子葉中各組分，重現(xiàn)性良好。

本文考察了三種不同的色譜柱對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果表明，同一色譜方法，不同色譜柱，會(huì)產(chǎn)生不同的分離效果，使得某些成分無法達(dá)到基線分離，同時(shí)，對(duì)柱效、峰形也有不同程度的影響。美國熱電BDS色譜柱在實(shí)驗(yàn)過程中能使各主要有效成分有較好的分離效果，故本文選擇了美國熱電BDS色譜柱。

余甘子葉中已知成分有沒食子酸、槲皮素，兩者最大吸收波長為270 nm和370 nm，本文根據(jù)此特點(diǎn)，用二極管陣列檢測器，分別在210、218、258、270、280、300、360 nm檢測色譜圖，并同時(shí)獲得全波長三維色譜圖，結(jié)果表明218 nm的色譜圖能給出最多峰信息，故本文最終選定218 nm為檢測波長。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10批指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，但各成分的共有色譜峰峰面積存在一定差異。此研究為快速鑒別和區(qū)分不同來源的余甘子葉以及進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行全面質(zhì)量控制研究提供了科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)對(duì)于余甘子葉藥材的選購和用藥具有一定的指導(dǎo)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：167.

[2]王輝.余甘子的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2011，13（11）：52.

[3]周濤，邱德文.民族藥余甘子的本草藥學(xué)概況[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24（3）：3.

[4]羅蘭.閩藥余甘子藥理作用及提取分離方法研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2013，25（11）：18

[5]鐘振國，曾春蘭.余甘子葉提取物體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材，2008，31（3）：428.

[6]曾春蘭，鐘振國.余甘子葉提取物體外抗腫瘤作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（3）：580.

[7]潘國慶，趙旭升，蔣炘治.余甘子抗氧化作用的研究[J].青?？萍?，2007，12（6）：33.

[8]王綠婭，王大全，秦彥文，等.余甘子抗脂質(zhì)過氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（10）：505.

[9]劉麗梅，高政，李寶文.余甘子對(duì)實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈粥樣硬化家兔的影響[J].中國臨床康復(fù)，2003，7（5）：766.

[10]黃正昌，鄧學(xué)龍，朱宇同，等.臺(tái)灣細(xì)葉油柑體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（3）：260.

[11]李萍，謝金鮮，林啟云.民族藥余甘子對(duì)D2半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2003，12（3）：161.

[12]羅春麗.余甘子對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用及免疫調(diào)節(jié)的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：155.

[13]崔炳權(quán)，何震宇，楊澤民，等.余甘子提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1920.

[14]陳國珍，張穎君，蔡文鋒，等.余甘子中水解單寧類化合物體外抗氧化活性研究[J].中國藥理通訊，2003，20（1）：5.

[15]梁臣艷，甄漢深，劉振杰，等.廣西余甘子葉醋酸乙酯部位化學(xué)成分的研究[J].中成藥，2009，31（5）：761

[16]劉曉麗，趙謀明.余甘子果汁活性成分與抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，23（5）：151.

（收稿日期：2014-03-08本文編輯：郭靜娟）