平陽(yáng)霉素新輔助化療對(duì)陰莖癌組織c—myc、Ras—P21、P53蛋白表達(dá)影響的研究

徐磊 劉文龍 王志超 喬忠杰

[摘要] 目的 探討應(yīng)用平陽(yáng)霉素新輔助化療對(duì)陰莖癌組織基因蛋白c-myc、Ras-P21、P53表達(dá)的影響及意義。 方法 收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科1995～2005年罹患陰莖鱗狀細(xì)胞癌的住院患者100例，按照術(shù)前是否進(jìn)行輔助化療分為兩組，其中新輔助化療組50例，術(shù)前應(yīng)用平陽(yáng)霉素化療7 d，化療后行陰莖部分切除術(shù)，并行雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)改良清掃術(shù)；對(duì)照組50例，直接行手術(shù)治療（手術(shù)治療方法同新輔助化療組），術(shù)前不進(jìn)行化學(xué)藥物治療。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法（SP）對(duì)兩組患者的陰莖鱗狀細(xì)胞癌組織進(jìn)行c-myc、Ras-P21以及P53等指標(biāo)檢測(cè)。 結(jié)果 新輔助化療組組織標(biāo)本中c-myc、Ras-P21、P53等指標(biāo)表達(dá)的陽(yáng)性率經(jīng)檢測(cè)分別為30%、27%、23%。對(duì)照組組織標(biāo)本中，c-myc、Ras-P21、P53等指標(biāo)表達(dá)的陽(yáng)性率經(jīng)檢測(cè)分別為52%、48%、50%。新輔助化療組與對(duì)照組的c-myc、Ras-P21、P53指標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 應(yīng)用平陽(yáng)霉素新輔助化療后，陰莖鱗狀細(xì)胞癌組織中c-myc、Ras-P21、P53蛋白的表達(dá)明顯下降，平陽(yáng)霉素新輔助化療可降低陰莖癌的惡性程度。

[關(guān)鍵詞] 陰莖癌；平陽(yáng)霉素；新輔助化療；免疫組織化學(xué)法

[中圖分類號(hào)] R737.27 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）07（c）-0004-04

陰莖鱗狀細(xì)胞癌是陰莖最常見的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的治療方法多采用陰莖部分或全部切除配合腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)[1]。臨床采用平陽(yáng)霉素新輔助化療配合改良的淋巴結(jié)清掃術(shù)治療陰莖癌取得了良好的效果。平陽(yáng)霉素是由我國(guó)自主研制的抗腫瘤藥物，從放線菌（Streptomycespingyangensisn.sp）培養(yǎng)液中分離得到，目前已成為我國(guó)臨床常用的抗癌藥物，被廣泛應(yīng)用于治療頭頸部等部位鱗癌、皮膚癌、食道癌、外陰癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌和宮頸癌等惡性腫瘤。近年來，平陽(yáng)霉素在臨床應(yīng)用過程中有不少新的發(fā)現(xiàn)與擴(kuò)展。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法研究平陽(yáng)霉素新輔助化療后陰莖癌患者腫瘤組織中c-myc、Ras-P21、P53蛋白表達(dá)的變化，以證實(shí)平陽(yáng)霉素新輔助化療治療陰莖癌的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）1995～2005年罹患陰莖鱗狀細(xì)胞癌患者100例，所有病例均附有完整的臨床資料。年齡35～86歲，平均（42.2±0.03）歲；病程5個(gè)月～3年，平均（1.6±0.02）年。其中包莖83例，包皮過長(zhǎng)17例；臨床表現(xiàn)為陰莖頭部、冠狀溝、包皮內(nèi)板處丘疹、潰瘍、菜花狀腫物，膿性分泌物80例，惡臭76例，3例尿道狹窄，有排尿困難；術(shù)前、術(shù)后病理檢測(cè)均為陰莖鱗狀細(xì)胞癌，83%以上的患者有腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。按照術(shù)前是否進(jìn)行輔助化療分為新輔助化療組和對(duì)照組，每組各50例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 新輔助化療組50例，術(shù)前于陰莖頭腫瘤處取病理組織證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。常規(guī)血液檢驗(yàn)如血常規(guī)、肝腎功能等，并行胸部正側(cè)位X線片檢查，結(jié)果正常后進(jìn)行化療。化療方案如下：平陽(yáng)霉素8 mg+生理鹽水2 mL深部肌內(nèi)注射，每天1次。同時(shí)可給予對(duì)癥支持治療，給藥時(shí)間為7 d，2周后經(jīng)各項(xiàng)檢查正常后行陰莖部分切除術(shù)加改良腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)。

對(duì)照組50例，術(shù)前于陰莖頭腫瘤處取病理組織證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。術(shù)前未行任何治療，行陰莖部分切除術(shù)+改良的腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)。

1.2.2 病理檢查方法 本研究的所有標(biāo)本均來自我院病理科，附有查找完整的臨床資料。兩組患者術(shù)后病理均取材于陰莖頭腫瘤組織，檢測(cè)均為陰莖鱗狀細(xì)胞癌，標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋。每個(gè)標(biāo)本均制成5 μm厚的組織切片3張，3張切片均行c-myc、Ras-P21、P53免疫組化染色。

采用免疫組織化學(xué)SP法：石蠟切片脫蠟和水化后，沖洗3次；將過氧化酶阻斷劑加入；PBS（pH=7.4）沖洗3次；抗原微波修復(fù)，pH6.0枸櫞酸緩沖液共計(jì)15 min沖洗，沖洗后自然冷卻，時(shí)間共20 min，再次使用PBS清洗標(biāo)本3次，各1 min；將10%即用型非免疫血清加入每張切片，于37℃下孵育10 min；加入第一抗體（鼠抗人c-myc、ras-P21及P53）4℃過夜；標(biāo)本加1滴或50 μL的二抗，加入二抗后于37℃下濕盒孵育30 min；使用PBS清洗標(biāo)本3次，每次1 min；標(biāo)本加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，37℃下孵育30 min；使用PBS清洗標(biāo)本沖洗3次，每次5 min；蒸餾水沖洗2次，1 min，蘇木素復(fù)染30 s～1 min，脫水后樹膠封片。以上試劑均來自北京生物技術(shù)有限公司。

對(duì)照染色使用TBS緩沖液代替單抗，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)可見棕黃色顆粒樣著色為Ras-P21蛋白陽(yáng)性標(biāo)記；細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核可見棕黃色顆粒樣著色為c-myc蛋白陽(yáng)性標(biāo)志。P53蛋白細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒著色為陽(yáng)性標(biāo)志。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者術(shù)后免疫組織化學(xué)SP法結(jié)果顯示：對(duì)照組50例標(biāo)本中表達(dá)陽(yáng)性者，c-myc為26例，占52%；Ras-P21為4例，占48%；P53為23例，占46%。新輔助化療組的50例標(biāo)本中表達(dá)陽(yáng)性者，c-myc為15例，占30%；Ras-P21為13例，占26%；P53為11例，占22%。新輔助化療組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1～6，表1～3。

3 討論

陰莖鱗狀細(xì)胞癌是陰莖最常見的惡性腫瘤，針對(duì)陰莖鱗狀細(xì)胞癌的傳統(tǒng)治療方法多以手術(shù)為主，術(shù)式多采用陰莖全切除術(shù)、陰莖部分切除術(shù)等，因陰莖鱗狀細(xì)胞癌患者多伴有腹股溝淋巴結(jié)腫大，其中約50%經(jīng)病理證實(shí)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，陰莖癌手術(shù)同時(shí)行雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)，患者創(chuàng)傷大，常因陰莖切除范圍較大而出現(xiàn)影響術(shù)后性生活甚至喪失，排尿姿勢(shì)改變等并發(fā)癥，因腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重的雙下肢及陰囊水腫等并發(fā)癥，明顯降低了患者的生活質(zhì)量。我院采用平陽(yáng)霉素新輔助化療配合改良的手術(shù)治療陰莖癌，明顯地提高了陰莖癌患者生存率，降低了復(fù)發(fā)率，增加了最大保留陰莖功能的機(jī)會(huì)，提高了患者的生活質(zhì)量[2]。

近年來，Ras-P21基因在惡性腫瘤的發(fā)病中受到了一定的重視視，并被視為一種預(yù)后基因，如肺癌、腸癌[3]、膀胱癌[4]等，不但ras基因異?；罨襊21有不同程度的表達(dá)[5]；惡性程度越高，Ras-P21表達(dá)越高，預(yù)后越差[6-10]。有學(xué)者證實(shí)Ras-P21蛋白對(duì)陰莖癌的預(yù)后、惡性度的評(píng)估有重要的參考意義[11]。

C-myc基因是myc基因家族的重要成員之一，是一種可易位基因、可調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)的變化與細(xì)胞的增殖及分化狀態(tài)有關(guān)，其表達(dá)產(chǎn)物也參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者指出，浸潤(rùn)程度增高的胃癌患者的腫瘤組織標(biāo)本中，c-myc基因產(chǎn)物P62的表達(dá)增強(qiáng)[12]，而且c-myc表達(dá)產(chǎn)物P62陽(yáng)性者較陰性者預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)c-myc表達(dá)增強(qiáng)的陰莖癌患者，臨床期別更晚、惡性程度更高、預(yù)后更差，陰莖癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率以及腫瘤相關(guān)病死率都高于c-myc表達(dá)陰性者，提示c-myc蛋白表達(dá)可以協(xié)助評(píng)價(jià)陰莖癌病情進(jìn)展及預(yù)后情況[14]。

P53是一種腫瘤抑制基因，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)有重要的調(diào)控作用，在近50%的惡性腫瘤中會(huì)出現(xiàn)P53基因的突變。野生型P53基因和突變型P53基因均參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，野生型P53對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，而突變型P53則對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用。而P53基因的過度表達(dá)往往源于P53基因的突變。P53突變是陰莖癌發(fā)生的早期事件[15]。研究表明P53蛋白參與了陰莖癌的發(fā)病過程[16]。

以上的研究結(jié)果表明，Ras-P21、P53以及c-myc蛋白的表達(dá)可以作為判斷陰莖癌惡性程度的良好指標(biāo)。c-myc、Ras-P21、P53的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的組織分級(jí)、臨床分期、預(yù)后有關(guān)，分化程度越差，臨床分期越晚，陽(yáng)性表達(dá)率越高，患者預(yù)后越差。

在本研究中，應(yīng)用此3個(gè)蛋白的表達(dá)程度作為判斷平陽(yáng)霉素新輔助化療效果的指標(biāo)，采用免疫組織化學(xué)法對(duì)應(yīng)用平陽(yáng)霉素新輔助化療（新輔助化療組）和未應(yīng)用平陽(yáng)霉素化療（對(duì)照組）的陰莖癌患者石蠟包埋病理組織各50例標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)。在對(duì)照組50例患者中，Ras-P21蛋白陽(yáng)性24例（48%），而新輔助化療組P21蛋白陽(yáng)性13例（26%）；對(duì)照組c-myc蛋白陽(yáng)性26例（52%），而平陽(yáng)霉素新輔助化療組c-myc蛋白陽(yáng)性15例（30%）；對(duì)照組P53蛋白陽(yáng)性23例（46%），新輔助化療組P53蛋白陽(yáng)性11例（22%），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見表1～3。新輔助化療后c-myc、P21、P53蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示平陽(yáng)霉素新輔助化療可明顯降低陰莖癌的惡性程度。

綜上所述，應(yīng)用平陽(yáng)霉素新輔助化療明顯降低了Ras-P21、P53及c-myc蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率，降低了陰莖癌的惡性程度。本研究為平陽(yáng)霉素新輔助化療配合手術(shù)治療陰莖癌，最大程度地保留陰莖功能，降低陰莖癌的復(fù)發(fā)率，提高患者的生存質(zhì)量及生存率提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。平陽(yáng)霉素新輔助化療治療陰莖癌值得臨床上推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 喬忠杰，趙丕顯，陳輝，等.術(shù)前應(yīng)用平陽(yáng)霉素化療配合改良手術(shù)治療陰莖癌的療效的初步觀察[J].現(xiàn)代生物學(xué)進(jìn)展，2006，6（10）：76-80.

[2] 何兆偉，盧燦輝，申鵬飛，等.Ras-p21和P-53在膀胱癌表達(dá)的臨床意義[J].中華泌尿外科雜志，1996，17（1）：20-23.

[3] Sun D，Yu F. MicroRNA-31 activates the RAS pathway and functions as an oncogenic MicroRNA in human colorectal cancer by repressing Ras-p21 GTPase activating protein 1 （RASA1） [J]. Biol Chem，2013，288（13）：9508-9518.

[4] Vioal MV，F(xiàn)romowitz F，Oravez S，et al. Ras oncogene P21 expression is increased in premalignant lesions and high grade bladder tumor [J]. J Exp Med，1985，161（5）：1213-1218.

[5] 周興，于茂生，張兆武，等.Ras-p21的表達(dá)與膀胱癌行為的研究[J].中華泌尿外科雜志，1992，13：167-170.

[6] Blumenschein GR Jr，Reck M. Plasma biomarkers correlating with clinical outcome in a phase Ⅱ study of sorafenib in advanced NSCLC [J]. Cancer Biomark，2011-2012，10（6）：287-298.

[7] Hu C，Huang F. miR-31 promotes oncogenesis in intrahepatic cholangiocarcinoma cells via the direct suppression of RASA1 [J]. Exp Ther Med，2013，6（5）：1265-1270.

[8] EL-Deriy WS，Tokino T，Velculescu VE，et al. WAFl，a potential of p53 tumor suppression [J]. Cell，1993，75（4）：817-825.

[9] Zhang W，Grasso L，Mcolain CD，et al. P53-independent induction of WAF1/CIP1 in human leukemia cells is correlated with growth arrest accompanying monocyte/maceophage differentiation [J]. Cancer Res，1995，55（3）：668-674.

[10] Shaw P，Sklarj，Brada M，et al. Induction of apoptosis by Wild-type p53 in a human colon tumor derived cell line [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1992，89（10）：4495-4499.

[11] 辛軍，王曉雄，孟書禮，等.陰莖癌及癌旁組織中ras產(chǎn)物p21蛋白表達(dá)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，31（3）：261-263.

[12] Field JK，Spandidos DA. The role of ras and myc oncogenes in human solid tumors and their relevance in diagnosis and prognosis [J]. Anticancer Res，1990，10（1）：1-22.

[13] Zhou SL，Yue WB，F(xiàn)an ZM，et al. Autoantibody detection to tumor-associated antigens of P53，IMP1，P16，cyclin B1，P62，C-myc，Survivn，and Koc for the screening of high-risk subjects and early detection of esophageal squamous cell carcinoma [J]. Dis Esophaqus， 2013，21：16-20.

[14] Kayes O，Minhas S. Biomarker discovery in penile cancer [J]. J Urol，2012，188（5）：1660-1661.

[15] 拉萊，蘇祖克，吾甫爾，等.陰莖癌中p53表達(dá)與HPV16、18 DNA的檢測(cè)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2002，18（3）：304-306.

[16] 李西啟，姜元慶，鄒積才，等.Bcl-2和p53基因蛋白在陰莖癌中的表達(dá)[J].實(shí)用癌癥雜志，1997，12（2）：115-116.

（收稿日期：2014-04-14 本文編輯：蘇 暢）