LRIG3反義寡核苷酸對宮頸癌Hela229細(xì)胞LRIG3、EGFR表達(dá)及增殖的影響

郭歷琛，史惠蓉，盛浴瀾，張平安，張 銳

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海 201800

LRIG3反義寡核苷酸對宮頸癌Hela229細(xì)胞LRIG3、EGFR表達(dá)及增殖的影響

郭歷琛1,2)，史惠蓉1)#，盛浴瀾2)，張平安2)，張 銳2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海 201800

#通訊作者，女，1959年12月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤,E-mail:Hrshi2011@163.com

LRIG3；反義寡核苷酸；EGFR；增殖；宮頸癌

目的：探討LRIG3反義寡核苷酸(ASODN)對宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞LRIG3、EGFR表達(dá)及增殖的影響。方法利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別用150、200及250 mg/L的LRIG3 ASODN、正義寡核苷酸(SODN)及無關(guān)序列核苷酸(MSODN)轉(zhuǎn)染Hela229細(xì)胞24、48及72 h，分別應(yīng)用RT-PCR和Western blot法檢測細(xì)胞LRIG3、EGFR mRNA及蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖率。 以常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作空白對照。結(jié)果轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，ASODN組細(xì)胞增殖率均較空白對照組、SODN組、MSODN組明顯增高(P<0.05)，LRIG3 mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表達(dá)增高(P<0.05)；3個(gè)ASODN劑量組間比較，隨著LRIG3 ASODN劑量的增加，細(xì)胞增殖率增高(P<0.05)，LRIG3 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論LRIG3 ASODN可促進(jìn)宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞的增殖，該效應(yīng)可能與抑制LRIG3表達(dá)、促進(jìn)EGFR表達(dá)有關(guān)。

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌發(fā)病率僅次于乳癌，且出現(xiàn)患者年輕化的趨勢，傳統(tǒng)的手術(shù)治療和放化療有著很大的局限性，特別是對于局部晚期宮頸癌患者治療效果不甚令人滿意。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從基因?qū)用嬷委煂m頸癌已逐漸成為新的研究方向。分子靶向治療具有副作用小、專一性高等優(yōu)點(diǎn)，其中反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASODN)技術(shù)有著靶向性強(qiáng)、可控、易操作等優(yōu)點(diǎn)。具有亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(the leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains，LRIG)是一組最近發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)膜蛋白，被稱為LRIG基因家族，該家族共有3個(gè)成員，即LRIG1、LRIG2和LRIG3[1-4]。LRIG1是最先發(fā)現(xiàn)的家族成員，最近的研究[5]證實(shí)LRIG1可以抑制腫瘤的惡化和增生。LRIG3與LRIG1的組成結(jié)構(gòu)較為相似，可能有著與LRIG1相似的功能[6]。作者觀察了利用ASODN技術(shù)抑制LRIG3表達(dá)對宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞增殖的影響，為宮頸鱗癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑Hela229細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(美國Gibco公司)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Trizol為MRC公司產(chǎn)品，MTT、DAB顯色劑為美國Sigma公司產(chǎn)品，Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，鼠抗人LRIG3單克隆抗體、兔抗人LRIG3多克隆抗體、兔抗人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)多克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2LRIG3反義寡核苷酸的合成應(yīng)用RNA structure3.5對LRIG3的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，針對LRIG3 mRNA設(shè)計(jì)一條ASODN、一條正義寡核苷酸(SODN)、一條無關(guān)序列(MSODN)。3條序列皆進(jìn)行硫代修飾，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，-20 ℃保存?zhèn)溆?。LRIG3 ASODN序列：5’-GGT CTCCAATTCATTGTTGT-3’；LRIG3 SODN序列： 5’-ACAACAAUGAAUUGGAGACC-3’；LRIG3 MSODN序列：5’-TTAGCTTTGCTGGATGTCAG-3’。

1.3實(shí)驗(yàn)分組利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別將150、200、250 mg/L的LRIG3 ASODN、SODN和MSODN體外轉(zhuǎn)染Hela229細(xì)胞24、48和72 h，然后進(jìn)行LRIG3、EGFR mRNA和蛋白表達(dá)的檢測，同時(shí)檢測細(xì)胞增殖率。設(shè)常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作空白對照。

1.4細(xì)胞增殖率的測定收集各組對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)過胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種在96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)103～104，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞鋪滿孔底，采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖率。酶標(biāo)儀檢測波長為492 nm。細(xì)胞增殖率=(A實(shí)驗(yàn)組-A0)/A0，A0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)實(shí)驗(yàn)組的A值。

1.5LRIG3和EGFRmRNA的檢測根據(jù)PubMed檢索設(shè)計(jì)合成LRIG3、EGFR以及內(nèi)參GAPDH引物序列，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。LRIG3引物序列：正義鏈 5’-CACATCAATG GAACCTGGGTATTTTGAC-3’，反義鏈5’-GTTTCGGT TCAATTCGAGATGTTGCAGTT-3’，產(chǎn)物長度139 bp。EGFR 引物序列：正義鏈5’-TCCCTCAGCCAC CCATATGTAC-3’，反義鏈5’-GTCTCGGGCCATTTTG GAGAATCC-3’，產(chǎn)物長度125 bp。GAPDH引物序列：正義鏈5’-ACCACAGTCCATGAAATCAC-3’，反義鏈5’-AGGTTTCTCCAGGCGGCATG-3’，產(chǎn)物長度230 bp。用TRN-zol-A+RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用Gel-Doc2000 型凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6LRIG3和EGFR蛋白的檢測采用Western blot法。用PMSF細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白，測定蛋白濃度，用100 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠進(jìn)行蛋白電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜中，用含有50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加一抗4 ℃過夜，用TPST洗膜3次，后加HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，用TBST洗膜3次，DAB 顯色，用圖像分析系統(tǒng)檢測條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組LRIG3、EGFR蛋白及mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞增殖率的比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖率的變化見表1～3。轉(zhuǎn)染LRIG3 ASODN后，細(xì)胞增殖率較空白對照組、SODN組、MSODN組明顯增高。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后,3個(gè)ASODN劑量組間細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.253、51.598、29.328,P=0.003、<0.001、<0.001),隨著ASODN劑量的增加，細(xì)胞增殖率亦增高(P<0.05)。

表1 150mg/LLRIG3SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞增殖率的影響

組別n24h48h72h空白對照組30．645±0．0570．670±0．0500．673±0．085SODN組30．655±0．0970．709±0．0700．824±0．090MSODN組30．607±0．0760．705±0．0640．839±0．113ASODN組30．893±0．119?3．015±0．286?4．895±0．527?F5．8884．31515．837P0．0200．0440．001

*:與其他3組比較，P<0.05。

表2 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞增殖率的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表3 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞增殖率的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

2.2各組細(xì)胞中LRIG3和EGFRmRNA的表達(dá)

見圖1及表4～6。ASODN組細(xì)胞中LRIG3 mRNA表達(dá)較其他3組明顯下降，EGFR mRNA表達(dá)增高。轉(zhuǎn)染24、48、72 h,3個(gè)ASODN劑量組間LRIG3和EGFR mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.043和9.974、47.514和15.066、85.374和11.650,P均<0.05),隨著ASODN劑量的增加，LRIG3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，EGFR mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞中LRIG3(上)和EGFR(下) mRNA的表達(dá)

M：Marker；1～3：150、200、250 mg/L ASODN組；4：150 mg/L SODN組；5：150 mg/L MSODN組；6：空白對照組。

表4 150 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞中LRIG3和EGFR mRNA表達(dá)的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表5 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞中LRIG3和EGFR mRNA表達(dá)的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表6 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞中LRIG3和EGFR mRNA表達(dá)的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

2.3各組細(xì)胞中LRIG3和EGFR蛋白的表達(dá)見圖2及表7～9。ASODN組細(xì)胞中LRIG3蛋白表達(dá)較空白對照組、SODN組、MSODN組明顯下降，EGFR蛋白表達(dá)增高。轉(zhuǎn)染24、48、72 h,3個(gè)ASODN劑量組間LRIG3和EGFR蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.325和4.287、25.185和10.941、16.046和9.951,P均<0.05),ASODN劑量越大，LRIG3蛋白表達(dá)水平越低(P<0.05)，EGFR蛋白表達(dá)水平越高(P<0.05)。

圖2 轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞中LRIG3和EGFR蛋白的表達(dá)

M：Marker；1～3：150、200、250 mg/L ASODN組；4：150 mg/L SODN組；5：150 mg/L MSODN組；6：空白對照組。

表7 150 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞中LRIG3和EGFR蛋白表達(dá)的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表8 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞中LRIG3和EGFR蛋白表達(dá)的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表9 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細(xì)胞中LRIG3和EGFR蛋白表達(dá)的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

3 討論

研究顯示，LRIGs的異常表達(dá)和人類的許多疾病有一定的關(guān)系，在許多人類的腫瘤組織中都能檢測到LRIGs的異常表達(dá)，但在不同腫瘤中LRIGs的表達(dá)存在很大差異，在結(jié)腸癌細(xì)胞系、前列腺癌細(xì)胞系、透明細(xì)胞癌組織、肺癌細(xì)胞系、皮膚鱗癌患者切除組織等多種組織細(xì)胞內(nèi)LRIG1 mRNA和蛋白表達(dá)均較正常組織下降[7-8]，而在白血病、星狀細(xì)胞瘤、前列腺癌中LRIG1的表達(dá)增高[9-10]。有關(guān)LRIG3與腫瘤的研究資料更為稀缺。

EGFR作為一種受體酪氨酸激酶，是Ⅰ型受體酪氨酸激酶超家族的成員，是原癌基因c-erbB1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物，其在多數(shù)上皮來源性惡性腫瘤中過度表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、惡性程度、預(yù)后、患者生存率密切相關(guān)[11]。EGFR蛋白的過表達(dá)能夠使腫瘤細(xì)胞處于長期活化狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。

作者將LRIG3 ASODN轉(zhuǎn)染宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞，采用RT-PCR和Western blot法檢測其LRIG3、EGFR mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，LRIG3 ASODN能夠顯著抑制細(xì)胞中LRIG3 mRNA和蛋白的表達(dá)，且該效應(yīng)具有一定的劑量依賴性；隨著LRIG3表達(dá)的降低，細(xì)胞的增殖活性亦升高，細(xì)胞中EGFR mRNA和蛋白的表達(dá)也逐漸增強(qiáng)。提示LRIG3有可能通過調(diào)控EGFR的表達(dá)，從而抑制宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，LRIG3或許能成為輔助宮頸鱗癌診斷新的參考指標(biāo)，同時(shí)對LRIG3的表達(dá)水平進(jìn)行干預(yù)，提高其表達(dá)水平，可能成為宮頸癌分子靶向治療的一個(gè)新的途徑。

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(2013-12-10收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of LRIG3-targeted antisense oligonucleotides on proliferation and expressions of LRIG3 and EGFR in Hela229 cells

GUOLichen1,2),SHIHuirong1),SHENGYulan2),ZHANGPing’an2),ZHANGRui2)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGynecologyandObstetrics,CentralHospitalofShanghaiJiadingDistrict,Shanghai201800

LRIG3;antisense oligonucleotide;EGFR;proliferation;cervical carcinoma

Aim: To observe the proliferation and expressions of LRIG3 and EGFR in Hela229 cells transfected with LRIG3-targeted antisense oligonucleotide(ASODN).Methods:The ASODN, SODN and MSODN of LRIG3 at doses of 150, 200 and 250 mg/L were transfected into Hela229 cells by the cationic liposome respectively for 24, 48, and 72 h. RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of LRIG3 and EGFR,and MTT assay was used to examine the proliferation of Hela229 cells. The cells with normal incubation were the blank control. Results: Compared with the blank control group, SODN group and MSODN group, the proliferation rate of ASODN group was significantly higher(P<0.05), the expressions of LRIG3 mRNA and protein decreased(P<0.05), and the expressions of EGFR mRNA and protein increased with the increase of ASODN concentration(P<0.05).Conclusion: LRIG3 ASODN can promote the proliferation of Hela229 cells, which is related to inhibition of LRIG3 expression and promotion of EGFR expression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.009

R737.33