LP小鼠突變基因的定位及鑒定

張粉麗，陳 兵，薛整風,李 怡

(1. 南京師范大學生命科學學院，南京，江蘇 210046；2.揚州大學比較醫(yī)學中心，揚州，江蘇 225009)

ENU是目前公認的最強的小鼠誘變劑,其誘導的突變分為顯性、隱性或沉默突變，顯性突變的篩查比較簡單，G0代雄性小鼠精原細胞中所攜帶的突變就可以在G1代小鼠中出現(xiàn)對應表型；隱性突變的篩查十分復雜，因為堿基的突變在G1小鼠中不出現(xiàn)相應的表型，研究者需要對G1小鼠采取一定的交配手段，使得可能存在的(無突變表型)突變基因純合，才能發(fā)現(xiàn)新的表型。ENU誘變劑誘導突變作為一種表型驅(qū)動法可以通過篩選獲得并建立人類疾病相似的動物模型，同時也可以進行基因功能的分析[1，2]。

2003年，通過ENU誘變小鼠揚州大學比較醫(yī)學中心篩選到6種白斑突變小鼠，其中一種C57BL/6J小鼠的腹部、爪子以及尾部出現(xiàn)白斑突變，被命名為Wbct[3](white belly, claws and tails)。在Wbct小鼠保種過程中出現(xiàn)了一種新表型突變小鼠——卷尾白斑突變小鼠，但是這種突變小鼠與正常B6小鼠回交后，白斑表型消失，卷尾表型能夠遺傳下去。因此我們獲得了一例只有卷尾(loop-tail, LP)而無白斑的B6突變小鼠。

本研究確定了LP小鼠的遺傳模式，并對突變位點進行了精確定位，篩選到了卷尾突變表型的強力候選基因—Vangl2。通過對Vangl2部分基因序列的測序，發(fā)現(xiàn)了該基因的一個新突變位點，為Vangl2基因功能的深入研究及建立相應的動物模型打下了基礎[4]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

正常C57BL/6J(B6)、C3He/J(C3H)小鼠，卷尾突變小鼠由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2012-0004，動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境的動物房內(nèi)，飼料(江蘇協(xié)同醫(yī)藥公司生產(chǎn))采用60Co照射，自由采食和飲水，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，濕度控制在(55±5)%，室內(nèi)照明采用12 h:12 h明暗交替。實驗動物使用許可證：SYXK(蘇)2012-0029

1.2 試劑及儀器

蛋白酶K，動物組織消化液，TRIzol reagent, Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit, LA Taq, QIA quick Gel Exaction Kit, PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，常溫離心機，冷凍離心機，超凈工作臺，電熱恒溫水槽。

1.3 方法

1.3.1 確定LP小鼠的遺傳模式：將B6背景的LP雄鼠與正常B6, C3H雌鼠各12只交配，記錄G1代中LP小鼠與正常小鼠的數(shù)目。

1.3.2 N2代LP小鼠的獲得及N2代小鼠基因組DNA提取：將B6背景的LP小鼠與正常C3H小鼠交配，獲得F1代LP小鼠，再將F1代小鼠與正常B6小鼠交配獲得[(B6×C3H)F1×B6]N2代LP小鼠。剪取N2代LP小鼠尾尖0.5 cm左右，常規(guī)蛋白酶K消化，酚氯仿方法提取基因組DNA[5]。

1.3.3 連鎖分析：通過微衛(wèi)星引物D1Mit113和D1Mit149 PCR擴增N2代LP小鼠基因組DNA。記錄并計算突變基因與微衛(wèi)星之間的重組率，采用基因連鎖分析以確定突變基因在1號染色體上的位置。

1.3.4 候選基因Vangl2序列分析：提取LP小鼠及正常B6小鼠尾DNA, PCR擴增Vangl2基因的外顯子以及側翼區(qū)，膠回收后測序。用DNAstar軟件將LP小鼠測序結果與數(shù)據(jù)庫中及正常B6小鼠的Vangl2序列比對，或者分析LP小鼠測序峰圖中是否出現(xiàn)明顯重疊波并選擇不同突變個體重復測序1次驗證結果的準確性。引物序列為：

Vangl2-452 Forward: 5′-AAACACCCTAGCTATC TTAGAAAGC-3′

Vangl2-452 Reverse: 5′-GGAAGTAGGACTGGC AGAAATGTG-3′;

Vangl2-324 Forward: 5′-TAGGATGAGCAGTGA GCACCTGCG-3′

Vangl2-324 Reverse: 5′-GACAAGAAGCTGGAC AGAGAGGAC-3′;

Vangl2-908 Forward: 5′-ACCTGCCCTGATGTGT CCCTTC-3′

Vangl2-908 Reverse: 5′-GCTTTCTCAGCCCAGT TCATCC-3′。

1.3.5 胚胎總RNA提取及RT-PCR：LP小鼠互交后檢栓，E12.5 d脫頸椎處死，取胚胎頭部于1000μLTrizol變性液中研磨，氯仿、異丙醇抽提獲得總RNA,立即用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄。以cDNA模板進行為RT-PCR,PCR產(chǎn)物回收并測序。最適宜退火溫度為61℃，引物序列Forward:5′-TACTACGAGGAAG CCGAGCATGA-3′; Reverse:5′-GCAGCCGCATGA CGAACTTATGT-3′。

1.3.6 基因型分析：提取LP小鼠互交后E12.5 d胚胎DNA, PCR擴增Vangl2基因中包含點突變的基因片段(452bp)，引物序列Vangl2-452 Forward:5′-AAACACCCTAGCTATCTTAGAAAGC-3′; Vangl2-452 Reverse:5′-GGAAGTAGGACTGGCAGAAATGTG-3′。FspBI(BfaI)內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物37℃酶切12h,酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳。野生型正常小鼠，顯示一條帶(452 bp)；突變雜合子小鼠，顯示三條帶(分別為452 bp、319 bp、133 bp)；突變純合子小鼠，顯示兩條帶(分別為319 bp、133 bp)。

2 結果

2.1 LP小鼠遺傳模式及表現(xiàn)型分析

LP小鼠與正常B6小鼠回交獲得103只小鼠，出現(xiàn)LP表型的后代32只。LP與正常C3H小鼠雜交獲得后代36只，有LP表型的僅1只。提示該突變基因表型與背景品系有關，同時表明LP小鼠的遺傳模式為單基因不完全顯性遺傳，外顯率不完全。

2.2 LP小鼠突變基因的定位及候選基因的確定

用微衛(wèi)星D1Mit113(距著絲粒79.54 cM)和D1Mit149(距著絲粒80.13 cM)對42個N2代小鼠DNA樣品進行連鎖分析，結果顯示D1Mit113與突變基因重組0例，重組率為0；D1Mit149與突變基因重組0例，重組率為0。對附近逐個基因功能分析發(fā)現(xiàn)距著絲粒79.54 cM的Vangl2基因突變表型[6]與本例小鼠表型極為相似，因此Vangl2基因為LP突變表型的強力候選基因(圖1)。

圖1 突變基因在小鼠第1號染色體上的位置

2.3 Vangl2基因的測序結果及蛋白預測

PCR產(chǎn)物測序結果表明，與正常B6小鼠Vangl2基因序列相比，LP小鼠的Vangl2基因第8外顯子出現(xiàn)單堿基突變，即在Vangl2基因編碼區(qū)1345bp處堿基由C→T(圖2A, B)。該突變導致純合子小鼠編碼的蛋白449位點出現(xiàn)無義突變CAG→TAG(圖2C)，同時C→T堿基突變在此產(chǎn)生了一個FspBI(BfaI)內(nèi)切酶位點。

LP雜合子小鼠RT-PCR擴增產(chǎn)物測序結果顯示，突變等位基因能夠被轉錄、拼接，而不是無義降解，但是可能會導致編碼蛋白的部分功能喪失(圖2D)。

(A) 局部Vangl2基因組DNA測序結果(B)Vangl2 基因部分外顯子與內(nèi)含子結構圖(C)蛋白預測結果(紅色字體為堿基突變位點)(D)LP雜合子小鼠RT-PCR產(chǎn)物測序結果

2.4 LP小鼠基因型分析結果

3對LP小鼠互交后獲得28只E12.5d胎鼠，胎鼠基因組DNA經(jīng)FspBⅠ(BfaⅠ)酶切、電泳后出現(xiàn)三種不同大小的條帶，由電泳條帶可以鑒定出互交后代的基因型(圖3)。

注：+/+為野生型正常小鼠，顯示一條帶(452bp)；+/-為突變雜合子小鼠，顯示三條帶(分別為452bp、319bp、133bp)；-/-為突變純合子小鼠，顯示兩條帶(分別為319bp、133bp)

3 討論

ENU誘變小鼠是分子遺傳學、基因組學及實驗動物學間的交叉。ENU誘變能夠獲得功能基因研究的新材料，即獲得人類遺傳性疾病的動物模型[7-9]，在定位克隆突變基因的基礎上，研究突變基因的功能，并用于研究疾病的發(fā)生機制及進行治療藥物的開發(fā)。通過模式小鼠研究功能基因或人類疾病，有可能會成為一種最有前景的手段和途徑[10]。本研究中利用ENU誘變獲得的1例卷尾突變小鼠，在先前初步定位工作的基礎上對突變基因精確定位，最終確定該卷尾突變表型是由Vangl2基因無義突變引起。

本研究中發(fā)LP純合子胚胎從后腦到尾端的神經(jīng)管都是開放的，引起嚴重的神經(jīng)管缺陷(neural tube defects, NTD)——顱脊柱裂(craniorachischisis)[11-13]。在鑒定LP小鼠雜交后代基因型中發(fā)現(xiàn)沒有純合子出生，純合子在胚胎期出現(xiàn)顱脊柱裂，并且死于子宮中。因此我們發(fā)現(xiàn)的LP突變純合子小鼠可以作為研究人類NTDs疾病的模型。

目前已報道的卷尾小鼠突變表型有三種：自然突變的LP和化學誘變的Lpm1Jus, Lpm2Jus三種突變位點分別是Vangl2S464N、Vangl2E255D、Vangl2R259L[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)的是一種由ENU誘導的新的LP突變，突變發(fā)生在Vangl2基因編碼蛋白的449位點，是一種無義突變，引起蛋白編碼的提前終止，是導致卷尾突變表型的原因。若Vangl2突變基因可以轉錄，將產(chǎn)生一種損傷的、只含有448個氨基酸的蛋白，而Vangl2基因編碼后的蛋白共有521個氨基酸。我們預測這種無義突變可能導致編碼后蛋白的某些功能喪失，因此該突變是深入研究Vangl2基因功能良好的材料。

Vangl2基因(也被稱為LPP1、Stbm)編碼膜蛋白，它的蛋白結構包括4個跨膜蛋白(TM)區(qū)域和C末端PDZ結構域，PDZ結構域參與蛋白間的相互作用(Torban et al.,2004)。本研究中Vangl2基因1345bp處堿基C→T的突變，可能引起編碼后蛋白C末端PDZ結構域的缺失，從而導致卷尾表型的發(fā)生。Vangl2基因編碼的蛋白屬于一類高度保守的平面細胞極化蛋白(planar cell polarity,PCP)[17-18]，參與非經(jīng)典Wnt信號通路[19-20]，該信號通路的紊亂將會導致癌細胞的侵襲以及NTDs的發(fā)生。人與小鼠的Vangl2基因在核苷酸水平有近89%的同源性，在氨基酸水平有99%的同源性。因此了解Vangl2基因的各種作用機理將會為未來治療人類NTDs奠定堅實的基礎。

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