應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對兩個(gè)豚鼠封閉群的遺傳學(xué)研究

李芳芳，魏 杰，王 洪，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

豚鼠因?yàn)槠涮厥獾纳飳W(xué)特性和生理解剖特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的研究領(lǐng)域。目前，國內(nèi)使用的豚鼠多為Hartley品系，屬于封閉群，遺傳結(jié)構(gòu)呈雜合性[1]，由于缺乏有效地遺傳監(jiān)測，其實(shí)際遺傳背景和遺傳多樣性尚不清楚。為保持豚鼠的基因雜合度及遺傳穩(wěn)定性，對豚鼠的遺傳質(zhì)量實(shí)行監(jiān)測成為重要的課題，而開發(fā)一套基因組分子標(biāo)記是檢測的前提[2,3]。微衛(wèi)星DNA是一類以1-6bp核苷酸為基本序列的多次串聯(lián)重復(fù)序列，由于重復(fù)序列的數(shù)目不同，產(chǎn)生了DNA的多態(tài)性，又稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)或短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats)。微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳檢測已被證明具有獨(dú)特優(yōu)勢和良好前景[4-7]，特別是其高度多態(tài)性及位點(diǎn)充足的特點(diǎn)，尤其適用于封閉群的遺傳檢測[8]。

本研究應(yīng)用篩選獲得的25個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合熒光標(biāo)記-半自動(dòng)基因分型技術(shù)，對北京的兩個(gè)豚鼠封閉群進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，為封閉群豚鼠遺傳檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

豚鼠為Hartley，分別來自兩個(gè)封閉群。A群為1994引自日本，封閉至今，動(dòng)物36只，許可證號(hào)SCXK(京)2009-0017；B群2004年從Charles River引入,動(dòng)物28只，許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(京)2011-0008.

1.2 主要試劑及儀器

試劑：1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mol/L EDTA-2Na (pH 8.0), 6 mol/L NaI, 50×TAE, 氯仿，異戊醇，異丙醇，乙醇，Taq聚合酶，dNTP，10× PCR buffer，D2000 plus marker，瓊脂糖等，為寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

儀器：PCR儀 (Bio-Rad公司)，核酸瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad公司)，離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司)，電子天平(Mettler GB303)等。

1.3 引物選擇及篩選

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，初步選擇多態(tài)性好的40個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過PCR擴(kuò)增最終篩選出25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行研究，引物信息見表1，所有引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成并進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA的提?。翰扇⌒呐K采血，每只豚鼠采500 μL血樣，并立即注入4 mL EDTA抗凝真空采血管中，充分搖勻并編號(hào)。參照《分子克隆指南》[12]及Loparev VN等[13]方案，NaI法提取抗凝血基因組DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增：25 μL反應(yīng)體系：滅菌dd H2O 18.3 μL；10× PCR buffer (Mg2+) 2.5 μL；dNTP (2 mM) 2.0 μL； 上游引物 (10 pmol/μL) 0.5 μL；下游引物 (10 pmol/μL) 0.5 μL；；模板 (30 ng/μL) 1.0 μL；Taq酶(2.5 U/μL) 0.2 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR試劑為寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.4.3 等位基因分離：2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，篩選出擴(kuò)增效果好的產(chǎn)物進(jìn)行STR掃描。共選取三種熒光標(biāo)記，分別為FAM、HEX和TAMRA。

1.4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：用GeneMapper4.0軟件分析STR掃描結(jié)果，讀取等位基因片段大小，通過PopGen 1.32軟件計(jì)算觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)[14]、觀測雜合度、期望雜合度、F-統(tǒng)計(jì)量、Shannon信息指數(shù)、Nei遺傳相似度及遺傳距離[15,16]等指標(biāo)。在線軟件GenePop對各位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及雜合子缺失檢驗(yàn)。PIC_CALC軟件對每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)信息含量(PIC)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各微衛(wèi)星位點(diǎn)在總?cè)后w上的遺傳分布

統(tǒng)計(jì)25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在兩個(gè)豚鼠群體各個(gè)體的基因型，計(jì)算各位點(diǎn)的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀察雜合度、期望雜合度、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)信息含量、F-統(tǒng)計(jì)量，結(jié)果見表2。25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在兩個(gè)群體中共發(fā)現(xiàn)121個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)2～10個(gè)，平均4.84個(gè)。有效等位基因數(shù)在1.0812～7.0865之間，平均為3.148；觀察雜合度在0.0781～0.8281之間，平均為0.4726；期望雜合度在0.0757～0.8656之間，平均為0.6070；Shannon信息指數(shù)在0.165～2.0572之間，平均為1.1702；多態(tài)信息含量(PIC)在0.072～0.843之間，平均為0.552。

表1 25個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的相關(guān)信息

表2 25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在總?cè)后w上的遺傳分布

2.2 兩群體遺傳多樣性比較

如表3所示，A群和B群分別檢測到103和116個(gè)等位基因；平均觀察雜合度分別為0.4467和0.5062；平均期望雜合度分別為0.5195和0.5838；平均多態(tài)信息含量分別為0.459和0.518?？梢钥闯?，B群的豚鼠群體遺傳多樣性稍大于A群。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

本研究采用馬可夫鏈法[17]計(jì)算兩個(gè)群體每個(gè)位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的精確P值[P(HWE)]、雜合子缺陷P值[P(ht.def)]與雜合子過多的P值[P(ht.exc)]，并計(jì)算相應(yīng)的Fis (W&C)和Fis (R&H),結(jié)果見表4。A種群有5個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡[P(HWE)<0.05 ],偏離平衡的這5個(gè)位點(diǎn)中有4個(gè)表現(xiàn)出雜合子缺陷[P(ht.def)<0.05 ]；B種群有6個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡[P(HWE)<0.05 ],偏離平衡的這6個(gè)位點(diǎn)中有5個(gè)表現(xiàn)出雜合子缺陷[P(ht.def)<0.05 ]。

2.4 群體間遺傳關(guān)系

遺傳分化系數(shù)(Fst)和遺傳距離結(jié)果見表2。兩個(gè)群體25個(gè)位點(diǎn)的Fst范圍從0.0043到0.4656，平均為0.1056。兩群體的Nei’s(1972) 遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204。

表3 兩個(gè)封閉群豚鼠的遺傳多樣性

Nei: Nei's (1973) expected heterozygosity

表4 兩群體的Hardy-Weinberg平衡及雜合子缺失和過多檢驗(yàn)

3 討論

3.1 兩個(gè)封閉群豚鼠遺傳多樣性

有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，反映了等位基因的相互影響，可作為群體遺傳變異的一個(gè)指標(biāo)[18]。雜合度或群體平衡狀態(tài)是群體遺傳結(jié)構(gòu)分析最直接和最有效的方法，雜合度值越高所在群體的遺傳多樣性就越豐富，較理想的封閉群體的雜合度值應(yīng)介于0.5～0.7。多態(tài)信息含量是表示微衛(wèi)星座位多態(tài)性高低的一個(gè)指標(biāo)。當(dāng)微衛(wèi)星座位PIC>0.5時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性，為高度多態(tài)性座位；當(dāng)0.25

根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果，A種群豚鼠在5個(gè)位點(diǎn)顯著偏離遺傳平衡，B種群豚鼠在6個(gè)位點(diǎn)顯著偏離遺傳平衡，并且兩個(gè)種群偏離平衡的位點(diǎn)，大多表現(xiàn)為雜合子缺陷。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因除了無效等位基因之外，大部分的偏離可能是在飼養(yǎng)繁殖過程中未能實(shí)現(xiàn)隨機(jī)交配，近交程度有所升高導(dǎo)致的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群Hardy-Weinberg平衡偏離現(xiàn)象似乎是其繁殖過程中經(jīng)常出現(xiàn)的一個(gè)問題[19，20]。目前由于封閉群動(dòng)物普遍缺乏相應(yīng)的遺傳監(jiān)測，因此在繁育過程中要遵守嚴(yán)格的操作程序以避免近交現(xiàn)象，同時(shí)，通過定期的遺傳檢測對其生產(chǎn)管理及繁殖方式等作出評估及調(diào)整是必需的。

3.2 兩個(gè)封閉群豚鼠遺傳關(guān)系

Fst是種群之間遺傳差異的一種測度。F-統(tǒng)計(jì)量計(jì)算結(jié)果表明，兩個(gè)種群在25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均Fst為0.1056，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的10.56%，89.44%的遺傳變異來自群體內(nèi)部的遺傳多樣性。依據(jù)遺傳分化指數(shù)Fst的解釋(介于0-0.05之間說明種群間分化很弱,0.05-0.15之間表示中等分化,0.15～0.25之間表示分化大,大于0.25表明分化極大)[21],說明兩群體間的遺傳分化已達(dá)到中等水平。

遺傳距離以兩個(gè)群體間同一座位上相同等位基因的頻率差異的函數(shù)來測定,被用以描述群體的遺傳結(jié)構(gòu)和品種間的差異。兩群體的Nei’s(1972)遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204，說明兩群體間的親緣關(guān)系較近。

本研究利用25個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對兩個(gè)種群封閉群豚鼠的遺傳檢測表明，兩個(gè)種群均符合封閉群動(dòng)物的群體遺傳特征，遺傳分化處于中等水平，B種群的多樣性略高于A種群。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果提示種群的繁殖過程中有不同程度的近交現(xiàn)象存在。本研究結(jié)果可為封閉群豚鼠遺傳檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)資料。

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