Walker256脛骨癌痛模型大鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞功能評(píng)價(jià)

杜俊英，梁 宜，陳宜恬，吳賽飛，王 虎，房軍帆，方劍喬

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院針灸神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310053)

機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，已有研究認(rèn)為人體免疫功能低下或被抑制時(shí)，腫瘤發(fā)病率增高，而在腫瘤進(jìn)行性生長中，腫瘤患者的免疫功能受抑制，兩者互為因果，雙方各因素的消長對(duì)腫瘤的發(fā)展起著重要的作用[1]。Walker-256脛骨癌痛模型是一種國內(nèi)外比較公認(rèn)的研究癌癥鎮(zhèn)痛藥物的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚2]。有關(guān)此模型的免疫功能變化目前未見有報(bào)道，本文觀察Walker256脛骨癌痛大鼠模型，觀察其T淋巴細(xì)胞增殖功能、T淋巴細(xì)胞及其亞群占脾臟淋巴細(xì)胞的含量變化，致力于明確Walker256腫瘤細(xì)胞是否適合免疫調(diào)節(jié)藥物抗腫瘤作用的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

選用清潔級(jí)雌性健康SD大鼠41只(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016)，體重(160±20)g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，及自由飲水，12 h循環(huán)燈光，恒定濕度，室溫23℃±2℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2013-0184。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 儀器與試劑

RPMI 1640(11875-119，美國Gibco)；特級(jí)胎牛血清(30044184，美國Gibco)；Walker-256腫瘤細(xì)胞(3111C0001CCC000316，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；青霉素-鏈霉素溶液(100X)(C0222，碧云天生物技術(shù)研究所)；青霉素(國藥準(zhǔn)字H36020261，江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司)；CCK-8試劑盒(C0038，碧云天生物技術(shù)研究所)；流式細(xì)胞術(shù)所用試劑均采購自美國eBioscience公司；鹽酸嗎啡注射液(C81004-2，東北制藥集團(tuán)公司沈陽第一制藥廠)，其余試劑均為市售分析純級(jí)。動(dòng)態(tài)足底測量儀(意大利UgoBasile)、足底熱輻射儀(意大利UgoBasile)、全波長酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)、BD FACS Canto ll流式細(xì)胞儀(美國BD公司)、洗板機(jī)(美國Bio-Rad公司、韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)。

1.3 骨癌痛模型制備

脛骨癌痛大鼠模型制備參造Medhurst等[3]的實(shí)驗(yàn)方法，大鼠10%水合氯醛(0.35 mL/100g)腹腔麻醉，仰臥位，左后肢備皮、皮膚消毒，脛骨上段切1 cm口，暴露脛骨頭，9號(hào)針頭于脛骨結(jié)節(jié)下外5 mm處與脛骨呈30℃～45℃角朝尾側(cè)進(jìn)針鉆洞，微量注射器抽取Walker-256腫瘤細(xì)胞懸液10 μL(1×107cells/mL)注入脛骨骨髓腔，保持2 min拔出針頭，無菌骨蠟快速封閉針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，肌內(nèi)注射20萬單位青霉素防感染。

1.4 分組與處理

本次實(shí)驗(yàn)分兩批進(jìn)行，第一批實(shí)驗(yàn)大鼠(共16只)完全隨機(jī)分為PBS組和模型組，用于觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模前(基礎(chǔ))、造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d十個(gè)時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械縮腿閾、熱輻射刺激潛伏期和自發(fā)性疼痛的變化情況。第二批實(shí)驗(yàn)大鼠(共25只)完全隨機(jī)分為空白對(duì)照組、PBS組和模型組，用于觀察造模后20 d大鼠脾臟細(xì)胞T淋巴細(xì)胞增殖功能，T淋巴細(xì)胞及其亞群占脾臟淋巴細(xì)胞的含量。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 行為學(xué)觀察：我們動(dòng)態(tài)觀察了各組大鼠造模前(基礎(chǔ))、造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d十個(gè)時(shí)間點(diǎn)機(jī)械縮腿閾、熱輻射刺激潛伏期和自發(fā)性疼痛。

1.5.1.1 機(jī)械縮腿閾：測量前，將實(shí)驗(yàn)大鼠置于塑料盒內(nèi)，待大鼠安靜后(停止梳理毛發(fā)和探索性活動(dòng))，將類似Von Frey絲的金屬絲(φ0.5mm)置于大鼠患側(cè)足中央，避開足墊，啟動(dòng)“START”按鈕，金屬絲即自動(dòng)上抬，刺激力量以2.5 g/sec的速率遞增(Ramp=20 sec)，直至大鼠縮腿，儀器自動(dòng)記錄當(dāng)時(shí)的刺激力量。連續(xù)測量4次，取其平均值，每次間隔3 min。50 g為最大刺激力量，以免大鼠足爪受損。

1.5.1.2 熱輻射刺激潛伏期：操作方法與測量機(jī)械縮腿閾相似。測量前，將大鼠置于透明塑料盒中。待大鼠安靜后(停止梳理毛發(fā)和探索性活動(dòng))，將聚焦的紅外熱源置于大鼠患側(cè)足中央，避開足墊，啟動(dòng)“START”按鈕對(duì)足底進(jìn)行熱刺激，儀器自動(dòng)記錄大鼠縮足反應(yīng)時(shí)的潛伏期。連續(xù)測量3次，每次間隔5 min。20 s是熱輻射刺激時(shí)間最上限，30 s為最大熱輻射強(qiáng)度。

1.5.1.3 自發(fā)性疼痛評(píng)價(jià)：根據(jù)大鼠自由活動(dòng)時(shí)后肢使用以及跛行程度，分別給予0-3級(jí)評(píng)分。0分：正常行走；1分：后肢跛行，但不是很顯著，使用正常；2分：介于1和2分之間；3分：后肢行走時(shí)不著地。

1.5.2 生化指標(biāo)：

1.5.2.1 脾臟淋巴細(xì)胞提?。涸炷：?0 d，各組實(shí)驗(yàn)大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mL/100g)，75%酒精擦拭腹部皮膚，取出脾臟，稱重后置于抗生素生理鹽水(青霉素G 10000 U/mL、鏈霉素10000 μg/mL)中浸泡20 min，將脾臟置于200目不銹鋼網(wǎng)篩上，剪碎脾臟后進(jìn)行研磨，期間加PBS(滅菌)濕潤。獲得的細(xì)胞懸液加入3～5倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液(碧云天)，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min，1 000 r/min離心5 min，去上清液。獲得的細(xì)胞懸液加5倍體積RPMI 1640(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U /mL霉素)，輕輕混合，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復(fù)兩次。清洗后的細(xì)胞加RPMI 1640(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U /mL鏈霉素)完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液待用。

1.5.2.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增值能力:取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，四周加200 μL PBS(滅菌)以防液體揮發(fā)，各孔加入180 μL細(xì)胞懸液(大約2×105個(gè))，并給予20 μL ConA刺激(終濃度10 μg/mL)作為反應(yīng)孔，以相同體積不加ConA刺激的細(xì)胞懸液為空白孔，以200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液為control，分別做3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。各孔加入20 μL 2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST-8)溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用全波長酶標(biāo)儀在450 nm、650nm波長下檢測其A值。細(xì)胞活性%=反應(yīng)孔 A值/空白孔A值*100。

1.5.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+的含量:收集、洗滌細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1～5×106cell/mL，取100 μL細(xì)胞加入標(biāo)記的一抗(1 μL CD3 FITC，1.25 μL CD4 APC，0.625 μL CD8 PE)，4℃孵育30 min(避光)。加100 μL 1%多聚甲醛，4℃孵育15 min(避光)。1 mL冰冷PBS重懸細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)3次。加500 μL冰冷PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式檢測。control管：細(xì)胞+同等劑量PBS，不加一抗，其余步驟相同。同型對(duì)照管：細(xì)胞+熒光標(biāo)記的同型IgG，其余步驟相同。單陽對(duì)照管：細(xì)胞+一種熒光標(biāo)記的抗體，其余步驟相同。BD FACS Canto ll流式細(xì)胞儀檢測和分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨癌痛大鼠機(jī)械縮腿閾變化情況

我們采用足底動(dòng)態(tài)測量儀檢測各組大鼠患側(cè)足跖造模前(基礎(chǔ))、造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d的機(jī)械縮腿閾。從表1中可以看到，造模前，PBS組和模型組大鼠基礎(chǔ)機(jī)械縮腿閾比較差異無顯著(P>0.05)。造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d各時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠機(jī)械縮腿閾明顯小于PBS組大鼠(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組大鼠機(jī)械縮腿閾變化情況

表2 各組大鼠熱輻射刺激潛伏期變化情況

表3 各組大鼠自發(fā)性疼痛變化情況

表4 各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞及其亞群含量變化情況

2.2 骨癌痛大鼠熱輻射刺激潛伏期變化情況

我們還采用熱輻射法檢測了各組大鼠患側(cè)足跖造模前(基礎(chǔ))，造模后4、6、8、10、12、14、16、18、20 d的熱輻射刺激潛伏期，結(jié)果如表2 所示。造模前，PBS組和模型組大鼠的基礎(chǔ)熱輻射刺激潛伏期比較差異無顯著意義(P>0.05)。造模后4 d和6 d，模型組大鼠熱輻射刺激潛伏期有一定的下降，但與PBS組大鼠比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。至造模后8 d和10 d，模型組大鼠熱輻射刺激潛伏期明顯小于PBS組大鼠(P<0.05)。到造模后12 d至整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束(造模后20 d)，模型組大鼠熱輻射刺激潛伏期和PBS組比較均差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 骨癌痛大鼠自發(fā)性疼痛變化情況

另外，我們還觀察了造模前(基礎(chǔ))、造模后4、6、8、10、12、14、16、18 d和20 d十個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠患側(cè)足跖自發(fā)性疼痛的變化。如表3所示，造模前，PBS組和模型組大鼠患側(cè)足跖無自發(fā)性疼痛。造模后4 d至14 d，PBS組和模型組大鼠患側(cè)足跖出現(xiàn)自發(fā)性疼痛，模型組大鼠的自發(fā)性疼痛明顯高于PBS組(P<0.01)。造模后16 d，PBS組大鼠患側(cè)足跖已恢復(fù)正常，無自發(fā)性疼痛行為；模型組大鼠患側(cè)足跖仍具有自發(fā)性疼痛，明顯高于PBS組大鼠(P<0.01)。

2.4 骨癌痛大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力變化情況

模型組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力(104.03±7.47)明顯低于空白對(duì)照組(124.87±10.74)和PBS組(125.57±7.07)大鼠(P<0.05)。

2.5 骨癌痛大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞及其亞群含量變化情況

注：圖A-I分別是空白對(duì)組CD3含量、PBS組CD3含量、模型組CD3含量、空白對(duì)組CD4含量、PBS組CD4含量、模型組CD4含量、空白對(duì)組CD8含量、PBS組CD8含量、模型組CD8含量

如表4,圖1所示，模型組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞(CD3)、及其亞群(CD4和CD8)的含量均少于空白對(duì)照組和PBS組大鼠，但僅CD8的含量明顯少于空白對(duì)照組大鼠(P<0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所采用的脛骨內(nèi)注射Walker-256腫瘤細(xì)胞建立的脛骨癌痛模型是國內(nèi)外的用于研究骨癌痛機(jī)制的常見模型之一[4, 5]。Mao-Ying等[4]比較兩種濃度(4×105和4×103)的Walker-256腫瘤細(xì)胞脛骨內(nèi)注射制備的骨癌痛中觀察到，不同濃度的Walker-256腫瘤細(xì)胞脛骨內(nèi)注射均能導(dǎo)致模型大鼠雙側(cè)足跖機(jī)械痛覺異常和自發(fā)性疼痛的產(chǎn)生，但未觀察到明顯的熱痛覺異常；同時(shí)4×105組比4×103組先出現(xiàn)機(jī)械痛覺異常，于造模后4 d即觀察到雙側(cè)機(jī)械痛閾明顯下降。我們的結(jié)果與Mao-Yin相似，造模后4 d，模型組大鼠患側(cè)機(jī)械痛閾明顯下降、出現(xiàn)顯著的自發(fā)疼痛現(xiàn)象；并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠的機(jī)械痛閾和自發(fā)性疼痛評(píng)分均顯著低于空白對(duì)照組和PBS組。有關(guān)熱痛覺異常方面，我們的結(jié)果與Mao-Yin不一致，我們觀察到，模型組在造模后8、10、12 d這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，其熱輻射刺激潛伏期明顯低于空白對(duì)照組和PBS組；其他各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熱輻射刺激潛伏期與空白對(duì)照組和PBS組比較無顯著差異。另有學(xué)者[5]采用脛骨內(nèi)注射4×104個(gè)Walker-256腫瘤細(xì)胞觀察期熱痛閾變化情況中發(fā)現(xiàn)，骨癌痛模型的熱痛閾于造模后12 d顯著下降，并且在于造模后15 d、18 d和21 d時(shí)模型組的熱痛閾均顯著小于PBS組。

T淋巴細(xì)胞簡稱T細(xì)胞，來源于骨髓中的淋巴樣前祖細(xì)胞，在胸腺中發(fā)育成熟。成熟的T細(xì)胞只能表達(dá)CD4或CD8分子，即CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞。CD4和CD8分子的主要功能是輔助TCR識(shí)別抗原和參與T細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能彼此不同。CD4+T細(xì)胞細(xì)胞識(shí)別由13～17個(gè)殘基組成的外源性抗原肽，受自身MHC II類分子的限制?；罨螅只男?yīng)細(xì)胞主要為Th細(xì)胞，但也有少數(shù)CD4+效應(yīng)T細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用和免疫抑制作用。而CD8+T細(xì)胞識(shí)別8～10個(gè)殘基組成的內(nèi)源性抗原肽，受自身MHC I類分子的限制?；罨螅只男?yīng)細(xì)胞為Tc(CTL)細(xì)胞，具有細(xì)胞毒作用，可特異性殺傷靶細(xì)胞。盡管仍有爭議，但是越來越多的研究表明免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和消除初期腫瘤， CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是重要的免疫監(jiān)視介質(zhì)[6]。由于腫瘤細(xì)胞較少表達(dá)NHC II類分子，傳統(tǒng)認(rèn)為CD8+T細(xì)胞被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的主要T細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞在腫瘤免疫中的主要作用為輔助CD8+T細(xì)胞的活化[7-9]。但是，也有文獻(xiàn)報(bào)道，CD4+T細(xì)胞可直接對(duì)腫瘤產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[10, 11]，且在無CD8+T細(xì)胞參與的情況下，CD4+T細(xì)胞也具有抑制腫瘤的作用的能力[12]。在CD4+T細(xì)胞缺失的情況下，CD8+細(xì)胞的抗腫瘤作用受限制[13, 14]。亦有研究報(bào)道，MHC I類限制性轉(zhuǎn)基因小鼠，CD4+T細(xì)胞缺失的情況下，CD8+T細(xì)胞仍能保持抗腫瘤作用[15]。

我們本次的實(shí)驗(yàn)中，觀察到Walker-256腫瘤細(xì)胞可以降低外周脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力，減少T淋巴細(xì)胞及其亞群的含量，尤以CD8+T淋巴細(xì)胞含量的減少為甚。CD8+T細(xì)胞作為抗腫瘤的主要細(xì)胞之一，所以我們認(rèn)為，Walker-256致骨癌痛模型可以抗腫瘤免疫藥物研究的模型之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] 文亞平, 高麗華, 黎明.腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用及腫瘤免疫治療新策略[J]. 中國腫瘤, 2011, 2:103-107.

[2] 李曉青, 孫玉明, 黃章翔,等. Walker256乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建大鼠脛骨骨癌痛模型[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2008, 15: 41-45.

[3] Medhurst S, Walker K, Bowes M, et al. A rat model of bone cancer pain[J]. Pain, 2002, 96:129-140.

[4] Mao-Ying QL, Zhao J,Dong ZQ, et al.A rat model of bone cancer pain induced by intra-tibia inoculation of Walker 256 mammary gland carcinoma cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345:1292-1298.

[5] 嚴(yán)繼貴, 童曄玲,何國濃, 等.應(yīng)用 walker-256 細(xì)胞建立大鼠骨癌痛模型[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2007, 25:1128-1130.

[6] Koebel CM, Vermi W, Swann JB, et al. Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state[J]. Nature, 2007, 450:903-907.

[7] Antony PA, Piccirillo CA, Akpinarli A, et al. CD8+T cell immunity against a tumor/self-antigen is augmented by CD4+T helper cells and hindered by naturally occurring T regulatory cells[J].J Immunol, 2005, 174:2591-2601.

[8] Fujii H, Arakawa A, Utsumi D, et al. CD8(+) tumor-infiltrating lymphocytes at primary sites as a possible prognostic factor of cutaneous angiosarcoma[J]. Int J Cancer, 2014, 134:2393-2402.

[9] Chen Y, Ayaru L, Mathew S, et al.Expansion of anti-mesothelin specific CD4+and CD8+T cell responses in patients with pancreatic carcinoma[J]. PLoS One, 2014, 9:e88133.

[10] Noyan F, Lieke T, Taubert R, et al. Naive tumor-specific CD4(+)T cells were efficiently primed in acute lymphoblastic leukemia[J]. Scand J Immunol, 2014, 80: 161-168.

[11] Snook AE, Magee MS, Schulz S, et al. Selective antigen-specific CD4(+)T-cell, but not CD8(+) T- or B-cell, tolerance corrupts cancer immunotherapy[J]. Eur J Immunol, 2014, 44:1956-1966.

[12] Segal BM, Glass DD, Shevach EM. Cutting edge: Il-10-producing CD4+T cells mediate tumor rejection[J]. J Immunol, 2002, 168:1-4.

[13] Haabeth OA, Tveita AA, Fauskanger M, et al. How do CD4(+) T cells detect and eliminate tumor cells that either lack or express MHC class Ⅱmolecules?[J]. Front Immunol, 2014, 5:174.

[14] Boon T, Coulie PG, Van den Eynde BJ, et al. Human T cell responses against melanoma[J]. Annu Rev Immunol, 2006, 24:175-208.

[15] Hanson HL, Donermeyer DL, Ikeda H, et al. Eradication of established tumors by CD8+T cell adoptive immunotherapy[J]. Immunity, 2000, 13:265-276.