miR-125a/TRAF6調(diào)控通路在破骨細(xì)胞分化中的 作用研究

楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

論著·基礎(chǔ)

miR-125a/TRAF6調(diào)控通路在破骨細(xì)胞分化中的 作用研究

楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

目的研究miR-125a在破骨細(xì)胞分化過程中的作用及其作用機(jī)制，方法單核細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配體的受體激活劑(RANKL)誘導(dǎo)CD+14PBMCs向破骨細(xì)胞分化。生物信息學(xué)運(yùn)算預(yù)測miR-125a的靶基因以及結(jié)合于miR-125a啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測miR-125a以及其他相關(guān)基因的表達(dá)。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和抑制試驗(yàn)用于研究miR-125a在破骨細(xì)胞分化中的作用及其與靶基因之間的相互關(guān)系。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-125a與其靶基因之間的結(jié)合。結(jié)果(1)miR-125a表達(dá)在CD+14PBMCs前體細(xì)胞高表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延續(xù)逐漸下降，在誘導(dǎo)第5天開始明顯下降并在第15天達(dá)到最低值,表明miR-125a的表達(dá)在破骨細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)明顯下降趨勢。(2)miR-125a參與調(diào)控RANKL和M-CSF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,過表達(dá)miR-125a明顯抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表達(dá)和CD+14PBMCs向破骨細(xì)胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因腫瘤壞死因子相關(guān)因子6 (TRAF6)，TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)miR-125a降低了TRAF6的蛋白表達(dá)水平，而TRAF6的mRNA水平無明顯改變。結(jié)論miR-125a通過作用于新的TRAF6/NFATC1/miR-125a負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路在破骨細(xì)胞的分化中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，調(diào)控miR-125a的表達(dá)可能成為骨代謝疾病新的治療靶點(diǎn)。

microRNA; 破骨細(xì)胞分化; 轉(zhuǎn)錄因子；靶基因；負(fù)反饋調(diào)節(jié)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要儀器： Nikon 300型自動(dòng)攝像倒置顯微鏡(日本Nikon公司生產(chǎn))，電泳儀、轉(zhuǎn)印儀、紫外交聯(lián)儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio．Rad公司生產(chǎn))，流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司)。

1.1.3 主要試劑： 無酚紅a-MEM培養(yǎng)液、Trizol、及胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-EDTA、膠原酶(美國Gibico公司生產(chǎn))，RANKL(美國Invitrogen公司生產(chǎn))，M-CSF(美國Sigma公司)，TRAP染色試劑盒(美國Sigma公司), 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)試劑盒(Upstate, Charlottesville, VA), anti-miR-125a(GenePharma Co., Ltd), NFATc1 siRNA(OriGene Technologies Inc)。

1.2 方法

誘導(dǎo)液(25 ng/ml重組人類巨噬細(xì)胞集落刺激因子+30 ng/ml RANKL)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRAP)染色法鑒定破骨細(xì)胞的成熟，同時(shí)檢測組織蛋白酶免疫染色并檢測破骨細(xì)胞分化標(biāo)志性基因，如RAP和活化T細(xì)胞核因子磷酸酶依賴因子1的mRNA的表達(dá)水平。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析： 利用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，方法按參考文獻(xiàn)[10]。 miR-125a、U6、TRAF6、NFATc1、TRAP和β-actin的引物見表1、表2， U6和β-actin作為內(nèi)參。

表1 mRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

表2 mRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

注: F. 正向引物; R.反向引物; Acc. No. Genbank公布的準(zhǔn)入號

1.2.3 TRAP染色： 利用TRAP染色試劑盒進(jìn)行染色。在顯微光鏡下(× 200)隨機(jī)挑選10個(gè)視野觀察TRAP染色陽性的細(xì)胞(細(xì)胞核≥3)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 免疫組化: PBMCs的培養(yǎng)方法同前。多聚甲醛固定誘導(dǎo)液下培養(yǎng)于二孔板中的破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞免疫染色方法按參考文獻(xiàn) [11]。

1.2.5 miR-125a靶基因預(yù)測： 目前有大量miRNA靶基因預(yù)測軟件，其各有特點(diǎn)。TargetScan軟件是一個(gè)常用的預(yù)測軟件。在本研究中利用TargetScan預(yù)測并使用RNA22-HSA進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染： 質(zhì)粒構(gòu)建方法按參考文獻(xiàn)[12]，構(gòu)建包含所預(yù)測miR-125a結(jié)合位點(diǎn)的WT-pGL3-TRAF6-3′UTR。引物如下，F(xiàn)：5′-GGCTCTAGACTAATAGGGAGATGATTT-3′，R：5′-GGCCGGCCGCATTACCAGACAACTTTA-3′。MUT-pGL3-TRAF6-3′UTR. 突變引物如下，F(xiàn)：5′-TATCGTGGAATCTAGTTCTCCG CGAGACCCGCAACTAGTATAAG-3′，R：5′-GCTTATACTAGTTGCGGGTCTCGCGGAGAACTAGATTCCA CGATA-3′miR-125a 特異性抑制劑2′-O-甲基反義寡核苷酸(anti-miR-125a)和脂質(zhì)體復(fù)合體嚴(yán)格按說明書直接和細(xì)胞混合。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)： 外周血單核細(xì)胞與野生型或突變型 pGL3-TRAF6-3′UTR和miR-125a 或 miR-C共培養(yǎng)48 h?？罩|(zhì)體作為陰性對照。

雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(Promega)和光度計(jì)用以熒光信號定量。每個(gè)熒光素酶值通過海腎熒光素酶值進(jìn)行校正。

2 結(jié) 果

圖3 miR-125a抑制破骨細(xì)胞分化的標(biāo)志性基因NFATC1的表達(dá)

2.3 miR-125a直接作用于靶基因腫瘤壞死因子相關(guān)因子6 (TRAF6) 利用TargetScan軟件預(yù)測miR-125a的靶基因。在TRAF6的3′UTR區(qū)存在miR-125a的堿基互補(bǔ)序列(圖4A)。TRAF6是破骨細(xì)胞分化中的重要調(diào)控因子。

我們檢測了調(diào)控破骨細(xì)胞分化的一些重要基因如c-Fos、Mitf和NF-κB基因在轉(zhuǎn)染pre-miR-125a或miR-C以及anti-miR-125a或anti-C前后的表達(dá)情況。結(jié)果示，miR-125對c-Fos和Mitf基因的表達(dá)沒有影響，過表達(dá)miR-125a促進(jìn)NF-κB的蛋白表達(dá)，反之則抑制其表達(dá)(圖4E)。而NF-κB不是miR-125a的靶基因。

注：A.圖示標(biāo)明了在TRAF6的3’UTR端存在有miR-125a的結(jié)合位點(diǎn)。并且標(biāo)注了與miR-125a結(jié)合序列結(jié)合的野生型(WT)TRAF6- 3’UTR以及突變型(MUT)TRAF6- 3’UTR

B，C.miR-125a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF6的表達(dá)。過表達(dá)或抑制miR-125a的表達(dá)可以降低或提高TRAF6的蛋白表達(dá)水平而不影響其mRNA表達(dá)水平。與對照組比較，aP<0.05

D.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)示：共轉(zhuǎn)染pre-miR-125a可以降低野生型(WT)TRAF6- 3’UTR的熒光素酶活性而不影響突變型(MUT)TRAF6- 3’UTR的熒光素酶活性。與對照組比較，aP<0.05

E.過表達(dá)或下調(diào)miR-125a的表達(dá)可抑制或升高NF-κB蛋白水平卻對破骨細(xì)胞分化相關(guān)的其他一些關(guān)鍵基因無直接作用

圖4 miR-125a直接作用于其靶基因TRAF6

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-125a抑制了TRAP+多核巨細(xì)胞的生成同時(shí)也抑制了TRAP 和NFATc1的基因表達(dá)。反之則結(jié)果相反。表明miR-125a在破骨細(xì)胞的分化過程中起到了重要的調(diào)控作用。

研究已發(fā)現(xiàn)miRNAs通過與靶基因的3’UTR結(jié)合來抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性。我們利用TargetScan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)RANKL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子腫瘤壞死因子相關(guān)因子6 (TRAF6)是我們所預(yù)測的靶基因之一。結(jié)果提示miR-125a通過與TRAF6 mRNA的3’UTR結(jié)合來調(diào)控破骨細(xì)胞的分化。

TRAF6是NF-κB受體活化因子(RANK)的重要的銜接分子，在破骨細(xì)胞膜與RANK結(jié)合并激發(fā)了TRAF6的募集并進(jìn)一步激活NF- κB和NFATc1促使破骨細(xì)胞的形成[15，16]。TRAF6是TRAF超家族和白介素-1/Toll樣受體超家族的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。研究報(bào)道TRAF6和RANK的耦聯(lián)對于破骨細(xì)胞的骨吸收功能的維持至關(guān)重要。因此，TRAF6在破骨細(xì)胞分化和成熟過程中其重要的調(diào)控作用[17]。

本研究證實(shí)miR-125a通過作用于靶基因TRAF6調(diào)控破骨細(xì)胞分化。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示過表達(dá)miR-125a可抑制野生型TRAF6熒光素酶報(bào)告基因活性，而突變型TRAF6熒光素酶報(bào)告基因載體可取消該作用。另外，過表達(dá)和抑制試驗(yàn)表明miR-125a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF6的表達(dá)水平。而對其他一些可能對破骨細(xì)胞分化起調(diào)控作用的基因例如：c-Fos、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Mitf)和NF-κB的表達(dá)沒有影響。這些結(jié)果提示miR-125a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF6基因的表達(dá)。

本研究數(shù)據(jù)可以得出miR-125a的作用模式。破骨細(xì)胞分化信號在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞激活TRAF6/NFATc1轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，miR-125a表達(dá)的下降維持了TRAF6的蛋白表達(dá)并維持了破骨細(xì)胞分化過程。因此，一個(gè)新的miR-125a/TRAF6調(diào)控通路被挖掘出來。

綜上所述，本研究證實(shí)了miR-125a通過一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控通路參與破骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)。我們的研究為miRNA在破骨細(xì)胞分化中的作用提供了新的認(rèn)識(shí)，揭示了miR-125a在破骨細(xì)胞分化過程中的重要作用并使miR-125a表達(dá)的調(diào)控,可能成為治療骨代謝疾病的新的手段。

1 Taylor A,Rogers MJ,Tosh D,et al.A novel method for efficient Generation of transfected human osteoclasts[J].Calcif Tissue Int,2007,80(2):132-136.

2 Graves P1,Zeng Y. Biogenesis of mammalian microRNAs: a global view Genomics[J].Proteomics Bioinformatics，2012，10(5):239-245.

3 Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature,2004，431：350-355.

4 Kim SW,Ramasamy K,Bouamar H,et al.MicroRNAs miR-125a and miR-125b constitutively activate the NF-κB pathway by targeting the tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 (TNFAIP3, A20)[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(20):7865-7870.

5 Li Z,Hassan MQ,Volinia S,et al.A microRNA signature for a BMP2-induced osteoblast lineage commitment program[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(37):13906-13911.

6 Mizuno Y,Yagi K,Tokuzawa Y,et al.miR-125b inhibits osteoblastic differentiation by down-regulation of cell proliferation[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,368(2):267-272.

7 Hu R,Liu W,Li H,et al.A Runx2/miR-3960/miR-2861 regulatory feedback loop during mouse osteoblast differentiation[J].J Biol Chem,2011,286(14):12328-12339.

8 Yang L,Cheng P,Chen C,et al.miR-93/Sp7 function loop mediates osteoblast mineralization[J].J Bone Miner Res,2012,27(7):1598-1606.

9 Feige U,Overwien B,Sorg C.Purificmion of human blood monocytes by hypotonic density gradient centrifugation in Percoll[J].J Immunol Methods,1982，54(3):309-315.

10 Li H,Xie H,Liu W,et al.A novel microRNA targeting HDAC5 regulates osteoblast differentiation in mice and contributes to primary osteoporosis in humans[J].J Clin Invest,2009,119(12):3666-3677.

11 Wang L,Zhao R,Shi X,et al.Substance P stimulates bone marrow stromal cell osteogenic activity, osteoclast differentiation, and resorption activity in vitro[J].Bone,2009,45(2):309-320.

12 Nakamura T,Scorilas A,Stephan C,et al.Quantitative analysis of macrophage inhibitory cytokine-1(MIC-1)gene expression in human prostatic tissues[J].Br J cancer,2003，88(7):1101-1104.

13 Marson A,Levine SS,Cole MF,et al.Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells[J].Cell，2008，734(3):521-533.

14 Cheng P,Chen C,He HB,et al.miR-148a regulates osteoclastogenesis by targeting v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B[J].J Bone Miner Res,2013,28(5):1180-1190.

15 Zhou XY,Zhou ZG,Ding JL,et al.TRAF6 as the key adaptor of TLR4 signaling pathway is involved in acute pancreatitis[J].Pancreas,2010,39(3):359-366.

16 Chen H,Wu Y,Zhang Y,et al.Hsp70 inhibits lipopolysaccharide-induced NF-kappaB activation by interacting with TRAF6 and inhibiting its ubiquitination[J].FEBS Lett,2006,580(13):3145-3152.

17 Chen H,Li M,Campbell RA,et al.Interference with nuclear factor kappa B and c-Jun NH2-terminal kinase signaling by TRAF6C small interfering RNA inhibits myeloma cell proliferation and enhances apoptosis[J].Oncogene,2006，25(49):6520-6527.

EffectofmiR-125a/TRAF6/NFATC1loopmediatesonosteoclastogenesis

YANGLi*,ZHAOXinlan,LEIDandan,LIAOBin,QINAiping.

*DepartmentofEndocrinology,HunanProvinceMawangduiGeriatricHospital,Changsha410016,China

QINAiping,E-mail:qinaip@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of miR-125a in the process of osteoclast.MethodsMonocyte colony stimulating factor (M-CSF) and nuclear factor kappa B ligand / receptor activator (RANKL) induced CD+14PBMCs to osteoclast. The target gene bioinformatics arithmetic predictive miR-125a and miR-125a binding to initiate transcription factor sub region. To detect the expression of miR-125a using real-time quantitative PCR and other related genes. Overexpression experiments and inhibition test were used to investigate the relationship between effect of miR-125a in osteoclast differentiation and target gene. Used the luciferase reporter gene experiments to verify the combination between miR-125a and its target gene.Results(1) miR-125a expression in CD+14PBMCs precursor cells showed high expression level, with a continuation of the induction time, the expression decreased gradually, and reached the lowest value at fifteenth days, which showed that the expression of miR-125a revealed a clear downward trend in osteoclast differentiation process. (2) miR-125a are involved in the regulation of RANKL and M / CSF induced osteoclast differentiation, over expression of miR-125a significantly inhibited the expression of mRNA and CD+14PBMCs TRAP and NFATc1 to differentiate into osteoclasts. (3) miR-125a direct effect on target gene expression of tumor necrosis factor related factor 6 (TRAF6), TRAF6 is a transcription factor of the RANKL/RANK/NFATc1 signaling pathway, overexpression of miR-125a decreased the protein expression level of TRAF6, but no significant change of TRAF6 mRNA level were found.ConclusionIt proved that the miR-125a played an important role in the regulation of osteoclast differentiation by acting on the new TRAF6/NFATC1/miR-125a negative feedback control loop, expression and

regulation of miR-125a may become a new therapeutic target for metabolic bone diseases.

microRNA; Osteoclast; Transcription factor; Target gene; Negative feedback

湖南省自然科學(xué)基金(No.13JJ4119)

410016 長沙，湖南省馬王堆醫(yī)院老年內(nèi)分泌科(楊麗、趙新蘭、廖斌、秦愛平)； 410010 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 內(nèi)分泌科(雷丹丹)

秦愛平，E-mail:qinaip@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.11.019

2014-08-12)