硫代磷酸化修飾的反義TGF-β1寡核苷酸抑制血管損傷后內(nèi)膜增殖*

林志鴻, 謝良地, 吳可貴, 李庚山, 藺佩鴻

(福建醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院急診科， 2附屬第一醫(yī)院干部病房, 3福建省高血壓研究所，福建 福州 350005； 4武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430000)

血管損傷后血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的過度增殖及隨后的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積在血管損傷后的再狹窄過程中扮演著至關(guān)重要的作用。血管損傷后，VSMCs許多特征與高血壓時(shí)的VSMCs相似，表現(xiàn)為明顯的生長合成表型、更快的生長速度、異常的生長接觸抑制及加速進(jìn)入S期的細(xì)胞生長周期。同時(shí)對許多生長因子呈現(xiàn)出非特異性的高增殖傾向[1]。既往研究表明，血管損傷后轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達(dá)水平明顯升高，且TGF-β1顯著促進(jìn)了血管損傷后VSMCs的異常增殖，促進(jìn)了ECM的合成及在損傷血管內(nèi)膜的堆積[2-3]。因此抑制損傷血管局部TGF-β1的高表達(dá)，將可能顯著抑制VSMCs的異常增殖及ECM在損傷血管內(nèi)膜的堆積，從而減輕血管損傷后內(nèi)膜的增殖和肥厚。

材 料 和 方 法

1 反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)及合成

應(yīng)用Wilbar-Lipman方法，尋找出大鼠TGF-β1的cDNA序列[4]，在跨過cDNA序列的起始密碼區(qū)ATG范圍內(nèi)，設(shè)計(jì)包含有15個(gè)堿基、無修飾或硫代磷酸化修飾的反義TGF-β1寡核苷酸，同時(shí)設(shè)計(jì)與此反義寡核苷酸相對應(yīng)的、作為對照的正義寡核苷酸(與反義寡核苷酸互補(bǔ))，無修飾的寡核苷酸應(yīng)用于離體的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，而硫代磷酸化修飾的寡核苷酸則用于在體治療實(shí)驗(yàn)。具體如下：反義 TGF-β1(AS TGF-β1): 5’-CGAGGGCGGCATGGG-3’；正義TGF-β1(S TGF-β1): 5’-GCTCCCGCCGTACCC-3’。上述所有的寡核苷酸均采用Model 394 DNA Synthesizer (Applied Biosystems)合成，應(yīng)用OPC column(Applied Biosystems)純化。

2 Sprague-Dawley(SD)大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜球囊損傷

體重約400～500 g的雄性SD大鼠，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，氯氨酮(40 mg/kg)麻醉，無菌操作暴露右頸總動(dòng)脈，分離至動(dòng)脈交叉處，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端及其分支，同時(shí)暫時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈血流。在離動(dòng)脈交叉處遠(yuǎn)心端約0.5～1 cm處切開頸外動(dòng)脈，插入2F的球囊導(dǎo)管(Baxter Healthcare)約2.0 cm，從導(dǎo)管注入0.08 mL生理鹽水?dāng)U張球囊，有明顯阻力感后來回拖拉3次，確定造成血管壁的損傷后退出球囊導(dǎo)管，在靠近動(dòng)脈交叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，同時(shí)開放頸內(nèi)及頸總動(dòng)脈使血流再通后，縫合切口。

3 SD大鼠正常及損傷頸總動(dòng)脈VSMCs的培養(yǎng)

上述大鼠血管球囊損傷術(shù)后1周無菌操作取出正常或損傷的頸總動(dòng)脈約1～1.5 cm，置入含RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Gibco)的無菌培養(yǎng)皿中，采用組織塊翻轉(zhuǎn)干固法，將組織塊均勻貼附于30 mL的螺口培養(yǎng)瓶。從第3天起，用倒置相差顯微鏡(Olympus)觀察細(xì)胞生長情況，應(yīng)用alpha-smooth muscle actin單克隆抗體(DAKO)進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光鑒定。用3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4 VSMCs增殖([3H]-TdR摻入率)的檢測

傳代培養(yǎng)的VSMCs進(jìn)行反義寡核苷酸的干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將反義及正義的TGF-β1用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋后，加入處于同步化狀態(tài)的無血清的VSMCs，使干預(yù)寡核苷酸的最終濃度分別為0、0.01、0.1和1 μmol/L。在干預(yù)藥物加入時(shí)，同時(shí)加入3.7×107Bq/L[3H]-胸腺嘧啶核苷酸([3H]-thymidine，[3H]-TdR;中國原子能科學(xué)研究院)，共育24 h后，0.25%胰酶消化，在0.45 μm微孔濾膜上負(fù)壓抽濾，生理鹽水和10%三氯醋酸沖洗濾膜，室溫涼干后置入閃爍杯中，加入2,5-二苯基噁唑/1,4-雙[2-(5-苯基)噁唑基)苯(PPO/POPOP)/二甲苯閃爍液4 mL，靜置過夜后，在液體閃爍計(jì)數(shù)器(Tri-Carb 2300;PerkinElmer) 上進(jìn)行放射性強(qiáng)度的測定。

5 RT-PCR檢測VSMCs TGF-β1 、纖維連結(jié)蛋白(fibronectin, FN) 及平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α, SM22α)、基質(zhì)Gla蛋白(matrix Gla)及骨橋蛋白(osteopontin)mRNA的表達(dá)

將1×108cells/L VSMs接種于24孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h貼壁后，換用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞處于同步化狀態(tài)。加入AS TGF-β1干預(yù)24 h后，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (TaKaRa Biochemicals)。各引物序列根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及應(yīng)用Primer 3軟件設(shè)計(jì)合成。采用18S rRNA作為內(nèi)參照，進(jìn)行產(chǎn)物電泳條帶強(qiáng)度的半定量分析。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1 引物序列

6 Western blotting檢測VSMCs TGF-β1蛋白的表達(dá)

將4～6代VSMCs接種于6孔板貼壁后，換用無血清的RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞同步化后加入AS TGF-β1及S TGF-β1。干預(yù)24 h后提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，煮沸變性10 min，按每孔5 μg蛋白質(zhì)及20 μL樣本緩沖液，在8% SDS-PAGE上樣電泳約3 h，后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，應(yīng)用TGF-β1單克隆抗體(Santa Cruz)檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)，以α-tubulin(Sigma)作為內(nèi)參照。

7 SD大鼠頸動(dòng)脈球囊導(dǎo)管損傷及AS TGF-β1的干預(yù)治療

將雄性SD大鼠分為4組，每組4只，血管內(nèi)膜球囊導(dǎo)管損傷方法同前及本實(shí)驗(yàn)室以前發(fā)表的文章[5]。第1組為假手術(shù)組(僅進(jìn)行頸動(dòng)脈的暴露和分離，沒有血管球囊損傷)，第2組為手術(shù)損傷血管后僅給予生理鹽水2.5 μL/h, 第3組為手術(shù)損傷后給予硫代磷酸化修飾的S TGF-β1(90 g·kg-1·d-1)，最后1組為手術(shù)損傷后給予硫代磷酸化修飾的AS TGF-β1(90 μg·kg-1·d-1)。所有給藥途徑均采用ALZET 泵從皮下注射，連續(xù)給藥28 d，每7 d根據(jù)體重的變化調(diào)整藥物用量。術(shù)后28 d迅速取出損傷或未損傷的頸總動(dòng)脈約1 cm，去除血液及周圍結(jié)締組織后置于4%甲醛中，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切成6～10 μm的薄片，HE染色。應(yīng)用圖像分析儀(CMIAS-B型多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)，北京航空航天大學(xué)圖像中心)攝像求積法測定血管的內(nèi)膜與中膜的面積比(intima/media，I/M)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間差異比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

各種濃度(0.01～1 μmol/L)的AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs TGF-β1mRNA表達(dá)并無明顯作用，表明AS TGF-β1的作用環(huán)節(jié)并不在轉(zhuǎn)錄水平上，因?yàn)樗⒉挥绊慣GF-β1mRNA的生成,見圖1。

Figure 1. Effects of AS TGF-β1 on the expression of TGF-β1 mRNA in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4.

2 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果表明，AS TGF-β1呈濃度依賴性地抑制損傷VSMCs TGF-β1蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而S TGF-β1對損傷后VSMCs過度表達(dá)的TGF-β1蛋白并無抑制作用(P>0.05)。這表明AS TGF-β1的作用機(jī)制是抑制了TGF-β1mRNA的翻譯過程，從而抑制了TGF-β1蛋白在損傷VSMCs的過度表達(dá)，見圖2。

Figure 2. Effects of S TGF-β1 and AS TGF-β1 on the expression of TGF-β1 protein in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

3 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs 增殖的影響

AS TGF-β1呈濃度依賴性地抑制血管損傷后VSMCs DNA的合成，S TGF-β1對VSMCs [3H]-TdR的摻入率并無明顯作用；不管是反義、還是正義的TGF-β1寡核苷酸對非損傷血管的VSMCs DNA的合成均無明顯的量效作用，見圖3。

4 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs合成ECM的影響

AS TGF-β1顯著抑制了血管損傷后VSMCs FN的合成，且AS TGF-β1的抑制作用呈濃度依賴性，見圖4。表明血管損傷后VSMCs合成ECM增多，而AS TGF-β1有抑制VSMCs合成和分泌ECM的作用，從而降低血管損傷后ECM的沉積，抑制血管新生內(nèi)膜的形成。

5 AS TGF-β1對血管損傷后VSMCs表型的作用

AS TGF-β1對代表收縮表型的SM22α mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用；而對合成表型標(biāo)志物的基質(zhì)Gla蛋白和骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平則呈現(xiàn)顯著的抑制作用，這兩種相反的作用均在0.01及0.1 μmol/L劑量最為明顯，見圖5。

6 AS TGF-β1及S TGF-β1對血管損傷后新生內(nèi)膜形成的作用

血管損傷后，內(nèi)膜明顯增厚，管腔狹小，而中膜并無顯著變化，I/M較血管未損傷組明顯增加(0.19±0.03vs1.76±0.16,P<0.01)；AS TGF-β1治療4周顯著抑制了血管損傷后新生內(nèi)膜的形成，增加了管腔面積，降低了I/M，為損傷組的32%(1.76±0.16vs0.56±0.08,P<0.01)；S TGF-β1對血管損傷后新生內(nèi)膜的肥厚并無顯著影響，I/M與損傷組無明顯差別(1.55±0.11vs1.76±0.16,P>0.05),見圖6。

Figure 3. Effects of S TGF-β1 and AS TGF-β1 on the DNA synthesis in VSMCs with (A)or wihtout (B) vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

Figure 4. Effects of AS TGF-β1 on the expression of FN mRNA in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

討 論

反義寡核苷酸是一種未修飾或經(jīng)過化學(xué)修飾的單鏈DNA分子，一般由13～25個(gè)核苷酸組成，通過細(xì)胞內(nèi)化作用，短寡核苷酸可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入胞內(nèi)的反義寡核苷酸與其目標(biāo)mRNA特異性結(jié)合，阻斷了目的mRNA的翻譯，從而抑制該蛋白質(zhì)表達(dá)，影響了細(xì)胞相應(yīng)的功能[6]。這種特異性的結(jié)合，使得反義寡核苷酸技術(shù)在有選擇性地調(diào)整和改變某些與疾病病理過程有關(guān)的基因方面，變得越來越具有吸引力。

我們的研究結(jié)果也證實(shí)AS TGF-β1呈濃度依賴性抑制了血管損傷后VSMCs TGF-β1蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，但并不影響轉(zhuǎn)錄水平上TGF-β1mRNA的生成，而S TGF-β1并不影響TGF-β1蛋白質(zhì)的表達(dá)。表明我們所設(shè)計(jì)的反義TGF-β1寡核苷酸能夠特異性地制VSMC TGF-β1的表達(dá)水平，而且這種作用主要表現(xiàn)在翻譯水平上。

已有研究發(fā)現(xiàn)，損傷血管內(nèi)膜TGF-β1的表達(dá)明顯升高，且顯著促進(jìn)了損傷血管VSMCs的異常增殖、ECM的合成及在損傷血管內(nèi)膜的堆積[7]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AS TGF-β1呈濃度依賴性地抑制了血管損傷后VSMCs DNA的合成，減少VSMCs合成和分泌ECM-FN，但對未損傷血管的VSMCs并無明顯作用。在血管損傷后初期對VSMCs的抑制作用，也許足于減少血管壁ECM的堆積，及至抑制血管損傷后內(nèi)膜肥厚的最終形成。有研究表明在損傷后2周，TGF-β1mRNA的表達(dá)水平可達(dá)到正常的5～7倍，因此若能在損傷早期抑制TGF-β1的過度表達(dá)，則可明顯降低ECM的堆積，減輕內(nèi)膜肥厚的形成[8]。

Figure 5. Effects of AS TGF-β1 on the expression of SM22α (A)， osteopontin (B) and matrix Gla (C) mRNA in VSMCs after vascular injury. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

Figure 6. Effects of S and AS TGF-β1 on the intimal formation after vascular injury in SD rats (HE staining,×80). Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs non-injury group; △△P<0.01 vs AS TGF-β1.

我們的研究結(jié)果也證實(shí)頸動(dòng)脈損傷后，血管中膜并無顯著變化，但血管內(nèi)膜明顯增厚，管腔變小。應(yīng)用硫代磷酸化修飾的AS TGF-β1經(jīng)皮下連續(xù)給藥28 d后，顯著抑制了血管損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增生，管腔擴(kuò)大，I/M比值下降，而S TGF-β1對血管損傷后新生內(nèi)膜的增生并無明顯作用。表明了AS TGF-β1由于抑制了血管損傷后VSMCs的增殖、ECM的合成和分泌，減少了ECM在血管內(nèi)膜中的沉積，從而減輕了血管損傷后內(nèi)膜的肥厚。以前的研究也證實(shí)了局部給予AS TGF-β1也能顯著抑制血管損傷后內(nèi)膜的增殖[9]。

研究發(fā)現(xiàn)血管損傷后，VSMCs的表型由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?，而合成表型的VSMCs可能合成更多的生長因子、細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)等[10]。同時(shí)VSMCs對各種生長因子和血管活性物質(zhì)，包括對TGF-β1的反應(yīng)性也發(fā)生了變化，使TGF-β1由原來的抑制VSMCs增殖轉(zhuǎn)而變?yōu)榇龠M(jìn)VSMCs的增殖。AS TGF-β1抑制血管損傷后VSMCs的異常增殖可能與其逆轉(zhuǎn)血管損傷后VSMCs的表型轉(zhuǎn)變有關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用AS TGF-β1后，VSMCs收縮表型標(biāo)志物SM22α的mRNA表達(dá)水平明顯增加，而代表合成表型標(biāo)記物的基質(zhì)Gla蛋白及骨橋蛋白的mRNA的表達(dá)水平卻受到顯著抑制。因此，由于AS TGF-β1使VSMCs的表型由血管損傷后的合成型恢復(fù)為未損傷時(shí)的收縮型，減少各種促生長因子、細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)等的分泌，從而抑制了VSMCs的增殖，減少了ECM的合成和分泌，減輕了血管損傷后再狹窄的發(fā)生和發(fā)展。

總之我們所設(shè)計(jì)的AS TGF-β1能夠特異性地抑制血管損傷后TGF-β1蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了VSMCs在損傷后表型的轉(zhuǎn)變，從而顯著抑制了血管損傷后VSMCs DNA的合成和細(xì)胞增殖，減少了ECM的合成和分泌，減輕了血管損傷后內(nèi)膜的增殖。因此，AS TGF-β1有望為抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的形成，減輕PTCA術(shù)后再狹窄提供新的治療方法和手段。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Rudijanto A. The role of vascular smooth muscle cells on the pathogenesis of atherosclerosis [J]. Acta Med Indones,2007,39(2):86-93.

[2] Khan R, Agrotis A, Bobik A. Understanding the role of transforming growth factor-β1in intimal thickening after vascular injury[J]. Cardiovasc Res，2007,74(2): 223-234.

[3] Yao EH, Fukuda N, Ueno T, et al. A pyle-imidazole polyamide targeting transforming growth factor-beta1 inhibits restenosis and preserves endothelialization in the injured artery[J]. Cardiovasc Res，2009,81(4):797-804.

[4] Yang Y, Mumy M, Romeo D, et al. Identification of the start sites for the 1.9- and 1.4-kb rat transforming growth factor-beta1 transcripts and their effect on translational efficiency[J]. Gene, 1998, 219(1-2): 81-89.

[5] 林志鴻，吳可貴，李庚山,等.氟伐他汀抑制球囊損傷后兔的血管內(nèi)膜增殖[J].中國病理生理雜志，2005，21(1)：99-103.

[6] Inouye M. Antisense RNA: its function and application in gene regulation - a review [J]. Gene, 1988, 72(1-2): 25-34.

[7] Bobik A. Transforming growth factor-βs and vascular disorders [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(8):1712-1720.

[8] Merrilees M, Beaumout B, Scott L, et al. Effect of TGF-β1antisenseS-oligonucleotide on synthesis and accumulation of matrix proteoglycans in balloon catheter-injured of rabbit carotid arteries[J]. J Vasc Res, 2000, 37(1):50-60.

[9] Sun DX, Liu Z, Tan XD, et al. Nanoparticle-mediated local delivery of an antisense TGF-β1 construct inhibits intimal hyperplasia in autogenous vein grafts in rats[J]. PLoS One,2012, 7(7): e41857.

[10] Chaabane C, Otsuka F, Virmani R, et al. Biological responses in stented arteries[J]. Cardiovasc Res, 2013, 99(2):353-363.