失血性休克后的腸淋巴液提高血管通透性的作用*

孫改霞， 郭亞雄， 杜會(huì)博， 張立民， 趙自剛， 劉圣君， 牛春雨

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，河北 張家口 075000)

血管通透性增高是重癥休克患者出現(xiàn)組織水腫、引起毛細(xì)血管滲漏綜合征、進(jìn)而加重組織細(xì)胞缺氧和微循環(huán)障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。因此，探討重癥休克血管通透性增高的發(fā)生機(jī)制，并以此針對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)探求重癥休克的干預(yù)措施，是當(dāng)前防治重癥休克的重點(diǎn)研究課題。研究表明，失血性休克后的腸淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph, PHSML)回流是器官損傷的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]；腸淋巴液在重癥休克血管高通透性中的作用值得關(guān)注。為此，本文目的在于從整體動(dòng)物模型入手，觀察PHSML引流對(duì)失血性休克大鼠肝、腎、心肌、肺、脾、小腸等組織血管通透性的作用；并進(jìn)一步觀察引流至體外的PHSML對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)通透性的作用，闡明PHSML與血管高通透性的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物與分組

健康、SPF級(jí)Wistar雄性大鼠18只(中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后用于本實(shí)驗(yàn)，體重 220～260 g。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、自由飲水，隨機(jī)均分為：假手術(shù)組 (sham)、休克組 (shock)和休克+引流組 (shock+ drainage)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處置方法符合倫理學(xué)規(guī)范。

2 失血性休克模型復(fù)制與腸淋巴液引流

所有大鼠經(jīng)乙醚誘導(dǎo)、戊巴比妥鈉 (50 mg/kg；Merck) 注射全身麻醉后，休克組和休克+引流組大鼠按我室報(bào)道的以股動(dòng)脈勻速放血(10 min)、調(diào)整放血量維持平均動(dòng)脈血壓[(40±2) mmHg, 90 min]的方法，建立失血性休克模型[4]，液體復(fù)蘇(回輸放出血液+等量林格氏液，30 min)后，觀察至6 h；休克+引流組大鼠在液體復(fù)蘇后即刻，按我室常規(guī)方法引流腸淋巴液至6 h[4]，按0～3 h和3～6 h時(shí)間段分為2份，離心去細(xì)胞，冷凍于-80 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；休克組動(dòng)物僅剝離腸淋巴管；假術(shù)組動(dòng)物僅行相同手術(shù)操作，但不放血、不輸液、不引流腸淋巴液，觀察至與其它各組相對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)。

3 注射伊文氏藍(lán)與灌洗

在液體復(fù)蘇后5.5 h，經(jīng)股靜脈注射1%伊文氏藍(lán)(Evans blue，EB; Sigma)溶液(30 mg/kg)，30 min后開胸，立即連有生理鹽水(37 ℃)輸液瓶的鈍性穿刺針穿刺至左心室心尖部深入主動(dòng)脈，同時(shí)在右心耳底部作一切口，沖洗體循環(huán)內(nèi)的EB。然后，將穿刺針插入肺動(dòng)脈，并在左心耳底部作一切口，行肺循環(huán)灌洗。

4 組織留取與外觀顏色觀察

在灌流至無藍(lán)色液體流出為止，立即留取固定位置的心肌(左心室肌)、肝 (左外葉下緣)、脾、腎 (左腎正中縱行切開后縱切面)、小腸 (十二指腸下10 cm處，長(zhǎng)約5 cm)和肺 (左肺下緣)組織，用生理鹽水洗去表面污物，用濾紙吸干表面附著水分，置于平皿中，在解剖鏡(SZ2-ILST，Olympus)下觀察外觀顏色，應(yīng)用數(shù)碼照相機(jī) (Nikon)拍照。

5 組織EB濃度檢測(cè)

首先，準(zhǔn)確稱取1 mg EB、0.2 g牛血清白蛋白，溶于5 mL 0.9%生理鹽水中作為儲(chǔ)備液。采取倍比稀釋法配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，在波長(zhǎng)620 nm處，檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.088x+ 0.005x2+0.000254x3，R2=0.9963。然后，取固定位置的心肌(左心室肌下緣)、肝(左外葉下半部分)、脾(下半部分)、腎(左腎正中縱行切開的一半)、小腸(十二指腸下15 cm處，長(zhǎng)約5 cm)和肺(肺左葉)組織，約0.1～0.3 g，剪碎為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，按100 mg待測(cè)組織加入1 mL甲酰胺 (Sigma)，置于50 ℃水浴孵育24 h，3 000 r/min離心10 min，取上清分別測(cè)定620 nm、740 nm波長(zhǎng)處的吸光度，結(jié)合文獻(xiàn)[5-6]，代入公式：校正A620=實(shí)際測(cè)量A620-1.426A740-0.03,計(jì)算校正吸光度值，代入方程，計(jì)算EB濃度。將組織塊沉渣放入80 ℃恒溫箱烤24 h至恒定，稱干重，作為組織EB濃度的標(biāo)準(zhǔn)化處理，即：EB濃度/組織干重(μg/g)。

6 組織干濕重比值檢測(cè)

取固定位置的心肌 (左心室肌外緣)、肝 (左外葉上半部分)、脾 (上半部分)、腎 (左腎正中縱行切開的一半)、小腸 (十二指腸下10 cm處，長(zhǎng)約5 cm)和肺 (右肺中葉)組織，用濾紙吸干表面附著水分；應(yīng)用分析天平準(zhǔn)確測(cè)量，并記錄組織的濕重 (wet weight, W)；然后于80 ℃恒溫箱烤72 h至組織干重恒定，稱干重 (dry weight, D)，計(jì)算D/W比值。

7 HUVECs形態(tài)學(xué)觀察

將新購自上海嚴(yán)謹(jǐn)生物公司的HUVECs，按常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代，制備5×108/L左右的細(xì)胞懸液，移入96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，將96孔板放置于37℃、5%CO2孵育箱(Thermo)中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層融合至70%～80%時(shí)，按下述處理因素分為7組：DMEM組(DMEM培養(yǎng)基，Gibco)、DMEM+胎牛血清 (fatal bovine serum,FBS)組(DMEM培養(yǎng)基含10% FBS)、脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS; Sigma)組 (含10 mg/L LPS的DMEM培養(yǎng)基)、4% 休克復(fù)蘇后0～3 h腸淋巴液組(含4%休克復(fù)蘇后0～3 h腸淋巴液的DMEM培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱4% PHMSL 0～3 h組)、10% PHMSL 0～3 h組、4% PHMSL 3～6 h組和10% PHMSL 3～6 h組。待各種因素與HUVECs作用6 h后，倒置顯微鏡(Leika)下觀察不同處理因素對(duì)HUVECs形態(tài)的影響。

8 HUVECs活性觀察

待各種處理因素與HUVECs (設(shè)6個(gè)復(fù)孔) 作用6 h后，每孔中加入10 μL MTT(Amresco，5 g/L)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO(Fisher)，置于搖床上振蕩10 min，充分溶解；使用M3型酶標(biāo)儀(MD)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量各孔A值，以此反映細(xì)胞活性。

9 單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性測(cè)定

首先，將Transwell小室 (上室；Corning)放在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (下室)上，在上室中加入DMEM培養(yǎng)液，37℃預(yù)孵育24 h；將濃度為2.4×107/L HUVECs懸液100 μL接種于上室，下室加入600 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育；24 h后，待細(xì)胞融合生長(zhǎng)形成致密的單層細(xì)胞；按前述處理因素，更換上室中培養(yǎng)液；更換下室培養(yǎng)液為無血清DMEM培養(yǎng)基，作用6 h后，應(yīng)用EVOM2型跨上皮電阻測(cè)量?jī)x (WPI)，測(cè)量跨細(xì)胞電阻 (trans-endothelial electrical resistance，TEER)。然后，吸去上室中的培養(yǎng)液，加入100 μL含有FITC-Albumin(1 g/L，Sigma)的DMEM培養(yǎng)基，避光孵育45 min，收集上、下室液體100 μL，移入96孔板(其中上室液體稀釋50倍)，采用酶標(biāo)儀的熒光強(qiáng)度測(cè)量模塊讀取熒光強(qiáng)度 (激發(fā)波長(zhǎng)：485 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：525 nm)，同時(shí)測(cè)量底室液體量。結(jié)合文獻(xiàn)[7-10]計(jì)算單層血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)白蛋白的通透系數(shù)(Pa)：Pa= ([A]/t) × (1/A) × (V/[L])。其中，[A]為下室熒光吸光度；t為作用時(shí)間，以秒計(jì)算；A是濾膜面積，以cm2計(jì)算；V為下室液體量，以mL計(jì)算；[L]為上室熒光吸光度。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P>0.10)的資料多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊(P≤0.10)的資料采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PHSML引流對(duì)失血性休克大鼠各組織EB滲出情況的影響

如圖1所示，休克組大鼠肺、心、腎、肝、脾和小腸組織表面的藍(lán)色較假手術(shù)組深，休克+引流組大鼠的這些組織表面的藍(lán)色較休克組淺；通過甲酰胺萃取EB、定量分析檢測(cè)表明：休克組大鼠肺、心、腎、肝、脾和小腸組織EB滲出量均顯著高于假手術(shù)組 (P<0.05)，休克+引流組大鼠肺、心、腎、肝、脾、腸組織EB滲出量均顯著低于休克組 (P<0.05)，且心和腎組織EB滲出量高于假手術(shù)組 (P<0.05)。

2 PHSML引流對(duì)失血性休克大鼠各組織干濕比值的影響

在液體復(fù)蘇結(jié)束后6 h，休克組大鼠心肌、肝、脾、腎、小腸和肺組織的D/W比顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)；休克+引流組大鼠心肌、肝、脾、腎、小腸和肺組織的D/W比顯著高于休克組(P<0.05)，且與假手術(shù)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

3 PHSML腸淋巴液對(duì)HUVECs形態(tài)的影響

各種因素處理HUVECs 6 h后，倒置顯微鏡下觀察可見：DMEM和DMEM+FBS組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈鵝卵石樣貼壁，2組細(xì)胞的形態(tài)無明顯差別(圖2A、2B)；4% 0～3 h PHSML處理后，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞間連接消失，胞體發(fā)生不規(guī)則收縮，部分細(xì)胞懸浮甚至脫落(圖2C)，PHSML濃度加大到10%時(shí)，細(xì)胞胞膜邊緣進(jìn)一步模糊，失去完整性，細(xì)胞碎片增多，胞內(nèi)顆粒密集，呈現(xiàn)典型拉網(wǎng)現(xiàn)象 (圖2D)；4% 3～6 h PHSML處理后，細(xì)胞間隙開始逐步拉大，胞體發(fā)生小范圍收縮，部分細(xì)胞懸浮(圖2E)，PHSML濃度加大到10%時(shí)，細(xì)胞胞體失去完整性，胞膜邊緣模糊不清，有細(xì)胞碎片，胞內(nèi)顆粒增加 (圖2F)；LPS處理后，細(xì)胞失去了典型的鵝卵石樣形態(tài)，細(xì)胞收縮變形，結(jié)構(gòu)發(fā)生不規(guī)則改變，較多細(xì)胞懸浮甚至脫落(圖2G)。

4 PHSML對(duì)HUVECs細(xì)胞活性的影響

DMEM組與FBS+DMEM組細(xì)胞活性無顯著差異(P>0.05)；4%和10% 0～3 h、4%和10% 3～6 h的PHSML以及LPS均降低了HUVECs的活性，與DMEM組和FBS+DMEM組均有顯著差異(P<0.05)；在4個(gè)PHSML作用組中，以10% 0～3 h PHSML降低HUVECs活性的作用最強(qiáng)，均顯著低于其它3組(P<0.05)；4% 3～6 h PHSML的作用顯著弱于LPS組(P<0.05)，其它3個(gè)PHSML組與LPS組無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

表1 腸淋巴液引流對(duì)失血性休克大鼠各組織干濕重比值的影響

Figure 2. Effect of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) on the cellular morphology of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 6 h after incubation(×200).A: DMEM group; B: FBS+DMEM group; C: 4% PHSML 0～3 h group; D: 10% PHSML 0～3 h group; E: 4% PHSML 3～6 h group; F: 10% PHSML 3～6 h group; G: LPS group.

5 PHSML對(duì)HUVECs單細(xì)胞通透性的影響

如圖4所示，各種因素與HUVECs孵育6 h后，結(jié)果顯示：DMEM組與FBS+DMEM組細(xì)胞TEER值、Pa值無顯著差異(P>0.05)；4%和10%休克復(fù)蘇后0～3 h、4%和10%休克復(fù)蘇后3～6 h PHSML以及LPS均降低了TEER，提高了Pa值，與DMEM組和FBS+DMEM組均有顯著差異(P<0.05)。在4個(gè)PHSML作用組中，以10%休克復(fù)蘇后0～3 h PHSML組HUVECs的TEER值最低，均顯著低于其它3組(P<0.05)，且低于LPS陽性對(duì)照組(P<0.05)；以4%休克復(fù)蘇后3～6 h PHSML作用的HUVECs的TEER值最高，均顯著高于其它3個(gè)淋巴液作用組與LPS組 (P<0.05)。同時(shí)，在4個(gè)PHSML作用組中，以4%休克復(fù)蘇后3～6 h PHSML組HUVECs的Pa值最低，均顯著低于其它3組 (P<0.05)；LPS作用于HUVECs后，Pa值最高，均顯著高于4個(gè)PHSML組(P<0.05)。

Figure 3. Effect of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) on the viability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 6 h after incubation.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs DMEM or FBS+DMEM group; #P<0.05 vs 4% PHSML 0～3 h group; △P<0.05 vs 4% PHSML 3～6 h group.

討 論

目前，國內(nèi)外學(xué)者一般從整體動(dòng)物模型、離體灌流器官或組織模型、單層內(nèi)皮細(xì)胞模型等3個(gè)層次研究血管通透性[11]。在整體動(dòng)物模型上，人們一般從靜脈注射EB、[125I]白蛋白或熒光標(biāo)記的白蛋白，然后測(cè)定組織中EB含量、放射性強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度，來反映組織的通透性[11]。為了全面探討、了解休克腸淋巴液回流在重癥休克引起血管通透性增高這一過程中的作用，本研究首先應(yīng)用靜脈注射EB、再行全身灌洗、甲酰胺萃取的方法，觀察了PHSML引流對(duì)失血性休克大鼠肺、肝、腎、心肌、脾、小腸等組織中EB含量滲出的影響。

研究表明，PHSML引流均可降低失血性休克大鼠各組織EB含量，從灌洗的各組織器官表面的顏色變化也佐證了這一結(jié)果。研究結(jié)果提示，失血性休克引起的血管高通透性在各組織器官均有所表現(xiàn)，且PHSML引流的作用具有普遍性。應(yīng)當(dāng)指出，在這一實(shí)驗(yàn)中，全身灌洗是影響實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵技術(shù)。一方面，灌洗不完全，會(huì)直接影響組織中EB的結(jié)果；另一方面，灌洗壓力過高，可能會(huì)引起肺循環(huán)壓力過高，引起肺水腫，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。為此，在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[6, 12]報(bào)道，建立了先行體循環(huán)灌洗、再行肺循環(huán)灌洗的方法，避免了由于灌洗導(dǎo)致的肺水腫發(fā)生；并結(jié)合灌洗過程中重要器官肝、肺表面顏色的變化判斷灌洗是否完全，同時(shí)，考慮到可能存在灌洗不足的因素，又結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，去除了與血紅蛋白結(jié)合的伊文氏藍(lán)引起吸光度的影響，應(yīng)用校正公式進(jìn)行伊文氏藍(lán)濃度的計(jì)算。國外的一些研究，也應(yīng)用靜脈注射EB，行支氣管肺泡灌洗，將獲得的支氣管肺泡灌洗液與血漿EB濃度的百分比作為肺血管通透性指標(biāo)，證明了失血性休克、燒傷后肺組織血管通透性增高，也發(fā)現(xiàn)了阻斷PHSML回流降低了肺組織的血管通透性[13-15]。但這些研究均集中在肺損傷的研究，而本文結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PHSML回流是導(dǎo)致失血性休克后各組織器官血管通透性的重要因素。

Figure 4. Effects of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) on the permeability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 6 h after incubation.A: changes of trans-endothelial electrical resistance (TEER) in HUVECs; B: changes of monolayer permeability to of HUVECs FITC-labeled albumin. Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs DMEM or FBS+DMEM group; #P<0.05 vs 4% PHSML 0～3 h group; ■P<0.05 vs 10% PHSML 0～3 h group; □P<0.05 vs 4% PHSML 3～6 h group; ▲P<0.05 vs 10% PHSML 3～6 h group.

血管通透性增加的后果，就是引起組織液生成超過回流，導(dǎo)致組織水腫的發(fā)生。為此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組織器官的D/W值。結(jié)果顯示，失血性休克組大鼠的肺、肝、腎、心肌、脾、腸等組織的D/W值均顯著降低，出現(xiàn)了組織水腫；PHSML引流提高了休克大鼠各組織的D/W值，表明減輕了組織水腫的程度，這與降低過高的血管通透性有關(guān)。研究結(jié)果從另一個(gè)側(cè)面，進(jìn)一步驗(yàn)證了PHSML引流降低血管高通透性的作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性以及它們之間的連接是維持血管內(nèi)皮屏障以及血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的重要結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)[16]。生理?xiàng)l件下，血管通透性的調(diào)節(jié)涉及跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑[16]。跨細(xì)胞途徑，即穿過內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)周圍組織[17]；一般情況下，蛋白質(zhì)及脂質(zhì)主要是通過該途徑來實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)外的物質(zhì)交換與平衡[18]。細(xì)胞旁途徑，是指一些物質(zhì)從內(nèi)皮細(xì)胞間隙穿過血管到達(dá)周圍組織[19]?？缂?xì)胞途徑功能的實(shí)現(xiàn)與內(nèi)皮細(xì)胞的骨架蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)，細(xì)胞旁路途徑功能的實(shí)現(xiàn)主要依靠細(xì)胞間黏附或連接分子的表達(dá)有關(guān)[19]。為了進(jìn)一步探討PHSML對(duì)血管通透性的作用，觀察了將引流至體外的PHSML對(duì)HUVECs通透性的影響，并以LPS作為陽性對(duì)照。

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，不同濃度、不同時(shí)間的PHSML作用于HUVECs 6 h后，均引起了HUVECs結(jié)構(gòu)學(xué)損傷，破壞了完整性，從血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的跨細(xì)胞途徑這一方面解釋PHSML引起血管通透性增高的細(xì)胞機(jī)制；同時(shí)，細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞間連接消失，表明PHSML可能引起了HUVECs間的連接狀態(tài)，這可能從血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的細(xì)胞旁途徑這一方面解釋休克腸淋巴液引起血管通透性增高的細(xì)胞機(jī)制?？梢姡琍HSML增加HUVECs通透性的作用可能與2種途徑均有一定關(guān)系。

為了進(jìn)一步明確PHSML對(duì)HUVECs結(jié)構(gòu)與完整性的損傷作用，本文應(yīng)用MTT法檢測(cè)了PHSML對(duì)HUVECs生長(zhǎng)活性的影響。結(jié)果顯示，不同濃度、不同時(shí)間的PHSML作用6 h均降低了HUVECs生長(zhǎng)活力，使HUVECs存活數(shù)減少；這些結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果是一致的，從另一個(gè)角度證明了PHSML對(duì)HUVECs的損傷作用。結(jié)果也說明PHSML增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用是通過破壞血管內(nèi)皮屏障的跨細(xì)胞途徑實(shí)現(xiàn)的，而PHSML對(duì)與跨細(xì)胞途徑功能密切相關(guān)的骨架蛋白的表達(dá)，還有待進(jìn)一步觀察。

TEER檢測(cè)與單層細(xì)胞對(duì)白蛋白的通透系數(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞通透性的檢測(cè)；一般來說，單層細(xì)胞的TEER值越大，說明單層細(xì)胞越致密，通透性越小，單層細(xì)胞對(duì)白蛋白的通透系數(shù)越大，表明單層細(xì)胞通透性越高。本實(shí)驗(yàn)關(guān)于TEER與單層細(xì)胞對(duì)白蛋白的通透系數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度、不同時(shí)間的PHSML降低了HUVECs的TEER，提高了Pa值，說明PHSML增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用與破壞細(xì)胞間的致密結(jié)構(gòu)是相關(guān)的，也說明PHSML的作用是通過破壞細(xì)胞間黏附或連接分子實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然，PHSML對(duì)HUVECs黏附連接或緊密連接蛋白的作用還有待進(jìn)一步研究。

在上述研究中也發(fā)現(xiàn)，10%的失血性休克液體復(fù)蘇的0～3 h腸淋巴液的損傷作用最強(qiáng)，細(xì)胞活性接近LPS的作用，降低TEER的作用則明顯強(qiáng)于LPS對(duì)照組，這也與我們前期觀察到腸淋巴液中有高濃度內(nèi)毒素的結(jié)果是一致的。這也表明，在失血性休克液體復(fù)蘇的0～3 h內(nèi)，腸淋巴液的毒性作用最強(qiáng)，提示應(yīng)關(guān)注在這一時(shí)段腸淋巴液的病理學(xué)作用。

總之，減少PHSML回流，有利于降低休克引起各組織器官過高的血管通透性；PHSML引起了HUVECs的形態(tài)學(xué)損傷、降低了生長(zhǎng)活性、降低了TEER、提高了對(duì)FITC標(biāo)記白蛋白的通透系數(shù)，提示PHSML回流提高血管通透性的機(jī)制與破壞內(nèi)皮細(xì)胞的通透性有關(guān)，其機(jī)制涉及細(xì)胞通透性的跨細(xì)胞途徑與細(xì)胞旁途徑，相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Sawant DA, Tharakan B, Tobin RP, et al. Inhibition of Fas-Fas ligand interaction attenuates microvascular hyperpermeability following hemorrhagic shock [J]. Shock, 2013, 39(2): 161-167.

[2] Deitch EA. Gut lymph and lymphatics: a source of factors leading to organ injury and dysfunction [J]. Ann N Y Acad Sci, 2010, 1207(Suppl 1): E103-E111.

[3] Deitch EA. Gut-origin sepsis: evolution of a concept [J]. Surgeon, 2012, 10(6): 350-356.

[4] 韓 波,張立民,陳立峰,等. 硫化氫在休克腸淋巴液致肝損傷中的作用與機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(7): 1307-1312.

[5] Wallace KL, Linden J. Adenosine A2A receptors induced on iNKT and NK cells reduce pulmonary inflammation and injury in mice with sickle cell disease [J]. Blood, 2010, 116(23): 5010-5020.

[6] Niessen F, Furlan-Freguia C, Fernández JA, et al. Endogenous EPCR/aPC- PAR1 signaling prevents inflammation-induced vascular leakage and lethality [J]. Blood, 2009, 113(12): 2859-2866.

[7] You QH, Sun GY, Wang N, et al. Interleukin-17F-induced pulmonary microvascular endothelial monolayer hyperpermeability via the protein kinase C pathway [J]. J Surg Res, 2010, 162(1): 110-121.

[8] Tinsley JH, Wu MH, Ma W, et al. Activated neutrophils induce hyperpermeability and phosphorylation of adherens junction proteins in coronary vascular endothelial cells [J]. J Biol Chem, 1999, 274(35): 24930-24934.

[9] Tinsley JH, Teasdale NR, Yuan SY. Myosin light chain phosphorylation and pulmonary endothelial cell hyperpermeability in burns [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004, 286(4): L841-L847.

[10] Tinsley JH, Breslin JW, Teasdale NR, et al. PKC-dependent, burn-induced adherens junction reorganization and barrier dysfunction in pulmonary microvascular endothelial cells [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 289(2): L217-L223.

[11] 王述昀,趙克森. 血管通透性的調(diào)節(jié)和游離微血管技術(shù)在其研究中的應(yīng)用[J]. 中國病理生理雜志, 2005, 21(1): 203-208.

[12] Yano K, Liaw PC, Mullington JM, et al. Vascular endothelial growth factor is an important determinant of sepsis morbidity and mortality [J]. J Exp Med, 2006, 203(6): 1447-1458.

[13] Magnotti LJ, Upperman JS, Xu DZ, et al. Gut-derived mesenteric lymph but not portal blood increases endothelial cell permeability and potentiates lung injury following hemorrhagic shock [J]. Ann Surg, 1998, 228(4): 518-527.

[14] Deitch EA, Xu D, Kaise VL. Role of the gut in the development of injury- and shock induced SIRS and MODS: the gut-lymph hypothesis, a review [J]. Front Biosci, 2006, 11: 520-528.

[15] Magnotti LJ, Xu DZ, Lu Q, et al. Gut-derived mesenteric lymph: a link between burn and lung injury [J]. Arch Surg, 1999, 134(12): 1333-1341.

[16] 趙克森,黃巧冰. 血管通透性增高的基本機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志, 2003, 19(4): 549-553.

[17] Dejana E, Tournier-Lasserve E, Weinstein BM. The control of vascular integrity by endothelial cell junctions: molecular basis and pathological implications [J]. Dev Cell, 2009,16(2): 209-221.

[18] Mehta D, Malik AB. Signaling mechanisms regulating endothelial permeability [J]. Physiol Rev, 2006, 86(1): 279-367.

[19] Wallez Y, Huber P. Endothelial adherens and tight junctions in vascular homeostasis, inflammation and angiogenesis [J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1778(3): 794-809.