失血性休克后腸淋巴液引流恢復小鼠腎組織ACE/ACE2平衡的作用

失血性休克后腸淋巴液引流恢復小鼠腎組織ACE/ACE2平衡的作用*

劉俊芬，蔣麗娜，張立民，劉桂青，趙自剛，劉圣君△，牛春雨△

(河北北方學院微循環(huán)研究所，河北 張家口 075029)

[摘要]目的： 觀察失血性休克后腸淋巴液(PHSML)引流對失血性休克小鼠腎組織血管緊張素轉換酶(ACE)/ACE2平衡的作用。方法: 復制小鼠失血性休克模型，隨機分為休克組與休克+引流組，行液體復蘇；休克+引流組液體復蘇后，引流腸淋巴液。在液體復蘇后6 h，檢測腎組織ACE、ACE2、血管緊張素II(Ang II)1型受體(AT1R)、Mas相關G蛋白偶聯(lián)受體(MasR)的mRNA表達以及Ang II、Ang (1-7)含量。結果: 失血性休克提高了腎組織ACE mRNA、AT1R mRNA和Ang II水平，降低了ACE2 mRNA、MasR mRNA 和Ang(1-7)水平，PHSML引流抑制了失血性休克對ACE2和AT1R mRNA表達的影響；同時PHSML引流也降低了失血性休克增加ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和AT1R/MasR比值的作用。結論: PHSML引流恢復了失血性休克后腎組織的ACE/ACE2平衡，有利于減輕失血性休克所致的腎損傷。

[關鍵詞]失血性休克； 淋巴液； 引流術； 急性腎損傷； 血管緊張素轉換酶

[中圖分類號]R364.1+4； R331.4[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.028

[文章編號]1000-4718(2015)11-2101-06

[收稿日期]2015-06-05[修回日期] 2015-09-01

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(No.81330007；No.81120108003);廣東省科技計劃國際合作項目(No.2014A050503047)

通訊作者△Tel： 020-83827812-51155； E-mail: yuxycn@aliyun.com

Role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage in restoring balance of ACE/ACE2 in kidney of miceLIU Jun-fen, JIANG Li-na, ZHANG Li-min, LIU Gui-qing, ZHAO Zi-gang, LIU Sheng-jun, NIU Chun-yu

(InstituteofMicrocirculation,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075029,China.E-mail:ncylxf@126.com；lyz19920206@sohu.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) drainage on the balance of angiotensin-converting enzyme (ACE) and ACE2 in the kidney. METHODS: A hemorrhagic shock model was established and then fluid resuscitation was performed to the animals in shock and shock+drainage groups, and the PHMSL was drained in shock+drainage group after fluid resuscitation. After 6 h of resuscitation, the mRNA expression of ACE, ACE2, angiotensin II (Ang II) type 1 receptor (AT1R) and Mas-related G-protein-coupled receptor (MasR), and the levels of Ang II and Ang (1-7) in the renal tissues were observed. RESULTS: Hemorrhagic shock increased the levels of ACE mRNA, AT1R mRNA and Ang II, and decreased the levels of ACE2 mRNA, MasR mRNA and Ang(1-7) in the kidney. PHSML drainage abolished the effect of hemorrhagic shock on ACE2 and AT1R mRNA expression. Meanwhile, PHSML drainage reduced the hemorrhagic shock-induced increases in the ratios of ACE/ACE2, Ang II/Ang(1-7) and AT1R/MasR. CONCLUSION: The PHSML drainage restores the balance of ACE/ACE2, which is beneficial to alleviate acute kidney injury following hemorrhagic shock in the mice.

[KEY WORDS]Hemorrhagic shock; Lymph fluid; Drainage; Acute kidney injury; Angiotensin-converting enzyme

重度失血性休克后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)引起的內環(huán)境紊亂與多器官衰竭(multiple organ failure，MOF)的發(fā)生和患者的死亡率相關[1]。證據(jù)表明，失血性休克后腸淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph，PHSML)回流與MOF有關[2]，結扎腸淋巴管可以減輕失血性休克后腎臟的功能障礙與氧化應激程度[3]，但其詳細機制還需深入研究。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是人體內重要的體液調節(jié)系統(tǒng)，維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[4]。研究表明，RAS的2條關鍵軸血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)-血管緊張素(angiotensin，Ang)II-Ang II 1型受體(Ang II 1 receptor，AT1R)、ACE2-Ang(1-7)-Mas相關G蛋白偶聯(lián)受體(Mas-related G-protein-coupled receptor，MasR)失衡參與了止血帶性休克再灌注后引起的AKI，即：止血帶性休克引起AKI的同時，ACE表達上調，ACE2表達下調；敲除ACE2基因的小鼠發(fā)生AKI的程度降低[5-6]。但在失血性休克后AKI的發(fā)生過程中，腎組織ACE和ACE2的平衡狀態(tài)如何？PHSML引流對腎組織ACE和ACE2的平衡有何作用？尚未見報道。為此，本研究觀察了PHSML引流對失血性休克小鼠腎組織RAS這2條關鍵軸的作用，為補充失血性休克引起AKI的腸淋巴機制提供新的實驗資料。

材料和方法

1實驗動物與分組

24只雄性BALB/c小鼠(20～28 g)，購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，實驗動物許可證號為SCXK(軍) 2011-004，經適應性飼養(yǎng)后用于本實驗。小鼠在實驗前1 d禁食12 h，自由飲水；然后隨機均分為：正常對照(control)組、假手術(sham)組、休克(shock)組和休克+引流(shock+drainage)組。實驗過程中動物的處置方法符合動物倫理學規(guī)范。

2實驗方法

2.1失血性休克小鼠模型的復制小鼠經腹腔注射1%戊巴比妥鈉(70 mg/kg)麻醉后，參照我室大鼠失血性休克模型的建立方法[7]，進行了部分調整，建立失血性休克模型。具體過程為鈍性分離右側股動脈，用自制玻璃針經股動脈注射肝素鈉(1 mL/kg，500 U/kg)用于全身抗凝，連接生物信號采集系統(tǒng)，用于連續(xù)監(jiān)測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP)；鈍性分離左股側動脈，然后連接1 mL注射器固定于程控式抽注機(New Era Pump Systems Inc.)，用于放血和輸液；腹部正中線做一個3 cm左右的切口，分離腸淋巴管及其伴行的腸系膜上動脈，用于腸淋巴液引流或假引流；待所有手術完成、穩(wěn)定30 min后，經左股動脈、應用抽注機勻速放血，10 min內將MAP降至40 mmHg，實驗過程中通過推注機調整放血量維持MAP在40 mmHg水平；維持低血壓60 min后，將放出的全血與林格氏液按1∶1混勻，結合文獻報道的方法[8-10]，經左側股動脈輸液復蘇，30 min完成。休克組觀察至液體復蘇結束后6 h；休克+引流組在液體復蘇結束后，引流休克腸淋巴液至6 h；假手術組動物僅進行相同的手術操作，但不放血、不輸液，觀察至與休克小鼠相對應的時間；正常對照組麻醉后直接取材。

2.2腎組織取樣在上述各組動物實驗結束后的相應時間，在深麻醉狀態(tài)下，留取腎組織。其中，左腎直接冷凍于-75 ℃冰箱，用于組織勻漿制備、檢測Ang II和Ang(1-7)含量；右腎保存于RNA保護液中，冷凍于-75 ℃冰箱，用于檢測ACE、ACE2、AT1R和MasR的mRNA表達。

2.3實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應取右腎組織，按TRIzol試劑(碧云天生物技術研究所)操作說明提取腎組織總RNA，應用紫外分光光度計檢測總RNA濃度，A260/A280在1.8～2.0范圍為合格；按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說明逆轉錄反應合成cDNA；取1 μg cDNA作為反應模板進行PCR擴增。PCR反應條件均為95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。PCR引物(上海生物工程股份有限公司合成)序列、產生長度及循環(huán)次數(shù)見表1；GAPDH作為內參照。

表1　引物序列

2.4酶聯(lián)免疫吸附實驗取冷凍保存的左腎組織，分析天平稱重后，按1∶9比例，加入4 ℃的生理鹽水，應用玻璃研磨器研碎；3 000 r/min、4 ℃離心20 min，留取上清，制備10%組織勻漿。應用ELISA試劑盒檢測小鼠腎組織Ang II和Ang (1-7) 水平(R&D)。腎組織勻漿蛋白定量采用BCA法(BCA試劑盒由碧云天生物技術研究所提供)。

3統(tǒng)計學處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包，多組間比較應用單因素方差分析。首先進行齊性檢驗，方差齊的數(shù)據(jù)各組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗，方差不齊的數(shù)據(jù)采用Tamhame’s T2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1腸淋巴液引流對失血性休克小鼠腎組織ACE和ACE2 mRNA表達的作用

與正常對照組與假手術組相比，休克組與休克+引流組小鼠腎組織ACE的mRNA表達增高，ACE2的mRNA表達顯著降低，休克組小鼠腎組織ACE/ACE2比值顯著增高(P<0.05)；與休克組相比，休克+引流組小鼠腎組織ACE2的mRNA表達顯著增高，ACE/ACE2比值顯著降低(P<0.05)。此外，假手術組小鼠腎組織中ACE2的mRNA表達顯著低于正常對照組(P<0.05)，ACE的mRNA表達和ACE/ACE2比值與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1.Effects of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage on the mRNA expression of angiotensin- converting enzyme (ACE) and ACE2, and the ratio of ACE/ACE2 in the kidney of the mice following hemorrhagic shock. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssham group;▲P<0.05vsshock group.

圖1腸淋巴液引流對失血性休克小鼠腎組織ACE和ACE2 mRNA表達以及ACE/ACE2比值的影響

2腸淋巴液引流對失血性休克小鼠腎組織Ang II和Ang(1-7)含量的作用

休克組小鼠腎組織Ang II含量和Ang II/Ang(1-7) 比值顯著高于正常對照組與假手術組，Ang (1-7)含量顯著低于正常對照組(P<0.05)，休克+引流組小鼠腎組織的上述指標與正常對照組與假手術組差異無統(tǒng)計學意義；與休克組相比，休克+引流組小鼠腎組織Ang II/Ang(1-7) 比值顯著降低(P<0.05)，Ang II與Ang(1-7)含量未見顯著差異；此外，正常對照組與假手術組小鼠腎組織的Ang II和Ang(1-7)含量以及Ang II/Ang(1-7) 比值均無顯著差異，見圖2。

Figure 2.Effects of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage on the levels of angiotensin II (Ang II) and Ang(1-7), and the ratio of Ang II/Ang(1-7) in the kidney of the mice following hemorrhagic shock. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssham group;▲P<0.05vsshock group.

圖2腸淋巴液引流對失血性休克小鼠腎組織Ang II和Ang(1-7) mRNA表達以及Ang II/Ang(1-7)比值的影響

3腸淋巴液引流對失血性休克小鼠腎組織AT1R和MasR mRNA表達的作用

與正常對照組與假手術組相比，休克組和休克+引流組小鼠腎組織AT1R mRNA表達顯著增高，MasR的mRNA表達顯著降低，ATR/MasR比值顯著增高(P<0.05)；與休克組相比，休克+引流組小鼠腎組織ATR的mRNA表達與AT1R/MasR比值顯著降低(P<0.05)，MasR的mRNA表達與休克組差異無統(tǒng)計學意義；此外，正常對照組與假手術組小鼠腎組織的AT1R和MasR mRNA表達以及AT1R/MasR比值均無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 3.Role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage on the mRNA expressions of angiotensin II type 1 receptor (AT1R) and Mas-related G-protein-coupled receptor (MasR), and the ratio of AT1R/MasR in the kidney of the mice following hemorrhagic shock. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssham group;▲P<0.05vsshock group.

圖3腸淋巴液引流對失血性休克小鼠腎組織AT1R和MasR mRNA表達以及ATR/MasR比值的影響

討論

腎組織是RAS的2個關鍵酶ACE與ACE2存在的關鍵位置。最近文獻報道，ACE與ACE2失衡參與了多種應激狀態(tài)下AKI的發(fā)生[11-12]。本研究在項目組前期發(fā)現(xiàn)腸淋巴管結扎或PHSML引流，均可顯著減輕失血性休克大鼠AKI的基礎上，建立了小鼠失血性休克模型，發(fā)現(xiàn)失血性休克上調了腎組織ACE-Ang II-AT1R軸表達，下調了ACE2-Ang(1-7)-MasR軸表達，引起了ACE/ACE2失衡；而這種負性作用部分則被PHSML引流抑制，從而使ACE/ACE2向平衡的方向發(fā)展。

ACE是RAS的核心酶，其作用產物Ang II是RAS發(fā)揮效應的最重要組成部分；失血性休克后，受急性失血的影響，交感神經興奮，RAS活化，Ang II分泌增多，通過AT1R，引起腹部器官以及骨骼肌血管收縮，導致血液重新分布，這對于恢復回心血量、保證心腦的血液灌注發(fā)揮了重要的作用。但是，長期、持續(xù)的RAS系統(tǒng)活化、Ang II過度分泌和AT1R高表達，則會加重局部器官缺血從而出現(xiàn)缺血性壞死，也會引起心腦血管收縮導致缺血性損傷。因此，如何避免ACE-Ang II-AT1R軸的過度上調，對于防治休克具有積極的意義。為此，本研究首先觀察了PHSML引流對失血性休克小鼠腎組織ACE-Ang II-AT1R軸的作用。研究發(fā)現(xiàn)，休克引起了小鼠腎組織ACE、AT1R的mRNA表達與Ang II水平均顯著升高，而PHSML引流顯著降低了休克組小鼠腎組織的AT1R mRNA表達水平，對ACE mRNA表達以及Ang II水平也有降低的作用。這說明過度活化的ACE-Ang II-AT1R與失血性休克后腎組織缺血及其帶來的AKI有關，該實驗結果與止血帶休克、腎缺血再灌注后引起的AKI是相一致的[5-6, 11]；考慮到AT1R是Ang II發(fā)揮作用的關鍵受體，故可以認為PHSML引流減輕AKI的作用是通過抑制ACE-Ang II-AT1R過度活化實現(xiàn)的，從PHSML引流降低ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和ATR/MasR比值的作用也能進一步體現(xiàn)出來。已有的實驗觀察發(fā)現(xiàn)，PHSML中含有高濃度的毒素，經腸淋巴途徑回流至全身后引起炎癥反應與器官損傷[13]，結合內毒素休克后大鼠腎組織ACE和AngⅡ表達增高的事實[14]，故推測PHSML引流降低腎組織ACE表達的機制可能與經PHSML回流至全身的毒素減少引起對機體的不良刺激減輕有關，但具體機制還需要進一步研究。

ACE2是RAS的一個新成員，是ACE的同源物，但卻抑制ACE活性，具有與ACE相反的作用。ACE2通過催化Ang II轉化成Ang(1-7)、促進Ang (1-7)與其受體MasR結合，從而發(fā)揮擴張血管、減少細胞增殖等作用[15-17]，對于恢復腎組織的血液灌注具有重要作用[18]。為此，本研究觀察了PHSML引流對失血性休克小鼠腎組織ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的作用。結果發(fā)現(xiàn)，失血性休克顯著降低了小鼠腎組織ACE2、MasR mRNA表達與Ang(1-7)含量，出現(xiàn)了與止血帶性休克后相似的變化[5-6]；說明ACE2-Ang(1-7)-MasR軸受抑制參與了休克后AKI的發(fā)生；其機制可能為，通過降低Ang(1-7)含量，下調血管舒張功能，從而加重腎缺血，引起缺血性損傷。更為重要的是，本研究也發(fā)現(xiàn)，PHSML引流提高了休克小鼠腎組織ACE2表達以及Ang (1-7)含量，說明PHSML引流減輕AKI的作用可能是通過增加ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的活性來實現(xiàn)的，但這種作用的長期效果如何，有待進一步研究。

一般來說，生理條件下，RAS的2條關鍵軸ACE-Ang II-AT1R和ACE2-Ang(1-7)-MasR是平衡的，二者的平衡決定了血管的舒縮狀態(tài)與血液的灌注狀態(tài)，從而影響預后[19-20]。為此，本研究中觀察了PHSML引流對小鼠腎組織ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和 AT1R/MasR比值的影響，以了解二者的平衡狀態(tài)。結果發(fā)現(xiàn)，休克組小鼠腎組織ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和ATR/MasR比值均顯著增加；PHSML引流顯著降低了這些比值，使之恢復或接近平衡狀態(tài)。尤其是，PHSML引流盡管只是出現(xiàn)了增加MasR表達的趨勢，卻使AT1R/MasR比值下調，更進一步表明了失血性休克引起AKI的機制與ACE和ACE2軸失衡有關，減少PHSML回流有利于恢復二者平衡。同時，也應該看到，PHSML引流組小鼠腎組織的ACE和AT1R mRNA表達仍高于、ACE2和MasR mRNA表達仍低于對照組和假手術組，說明引起腎ACE-Ang II-AT1R上調、ACE2-Ang(1-7)-MasR下調的因素除了PHSML回流的作用外，還有其它因素參與。

此外，盡管在實驗過程中，盡量減少了手術創(chuàng)傷對小鼠的影響，但在研究中也觀察到了一個現(xiàn)象，行假手術的小鼠腎組織ACE2 mRNA表達較對照組顯著降低，這可能是由于手術創(chuàng)傷引起的；也說明ACE2可能較其它指標更為敏感，這需要在將來進一步探討。應當指出，本研究采用小鼠這一小型動物作為觀察對象，故股部、腹部手術均在手術顯微鏡下操作；由于小鼠的股動脈、股靜脈毗鄰很近，鈍性分離二者容易造成某一血管的破裂，因此本文的實驗中并未實施將動、靜脈鈍性分離手術，這也是本實驗中通過股動脈進行肝素注射抗凝和液體復蘇的原因。當然，本實驗方法是參考了相關文獻[8-10]報道來實施的。應當指出，本文僅從mRNA水平觀察了腎組織ACE、ACE2、AT1R和MasR的變化，初步顯示了ACE與ACE2的平衡狀態(tài)；今后應進一步從蛋白水平上進行相關的檢測分析，將更有利于分析失血性休克后腎組織ACE與ACE2的平衡情況以及PHSML引流的作用。

總之，失血性休克后腎組織ACE-Ang II-AT1R軸上調，ACE2-Ang(1-7)-MasR軸下調；PHSML引流調節(jié)了失血性休克小鼠腎組織ACE/ACE2的平衡。研究結果也提示，探討減少PHSML回流的治療措施，關注改善ACE/ACE2平衡的治療手段，有利于防治失血性休克后的AKI。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

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