• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ERK1/2/PPARα/SCAD信號途徑對生理性和病理性心肌肥大的調(diào)控*

    2014-08-09 00:41:18黃秋菊黃金賢羅佳妮劉培慶陳少銳潘雪刁臧林泉周四桂
    中國病理生理雜志 2014年8期
    關(guān)鍵詞:生理性病理性游離

    黃秋菊, 黃金賢, 羅佳妮, 劉培慶, 陳少銳, 潘雪刁, 臧林泉, 周四桂△

    (1廣東藥學院臨床藥學系,廣東 廣州 510006; 2中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室,廣東 廣州 510006)

    心肌是耗能最多的組織之一。哺乳動物胚胎期心臟主要以葡萄糖和乳酸作為能源,出生后則為以脂肪酸氧化為主;但在病理性心肌肥大時脂肪酸氧化降低,糖酵解增加,心肌能量代謝發(fā)生“胚胎型轉(zhuǎn)換”[1]。 長期運動訓練可使心肌能量代謝水平與適應(yīng)能力提高,脂肪酸氧化能力增強[2]。深入探討生理性和病理性心肌肥大2種不同的狀態(tài)下心肌細胞的能量代謝特征,將有助于進一步認識生理性與病理性心肌肥大的區(qū)別。

    短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase,SCAD) 是脂酰輔酶A 脫氫酶家族中的一員,特異性地分解短鏈脂酰輔酶A 底物,是脂肪酸β 氧化的第1個限速步驟,是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[3]。采用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)我們比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組,首次發(fā)現(xiàn)SCAD在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌中的表達顯著降低[4]。我們進一步證實生理性心肌肥大模型中SCAD mRNA 和蛋白表達均明顯上調(diào),而病理性心肌肥大模型中SCAD mRNA和蛋白表達均明顯下調(diào),二者之間的表達具有顯著差異[5],此外,我們采用體外苯腎上腺素(phenylephrine, PE)刺激誘導(dǎo)的病理性心肌細胞肥大模型中,SCAD在蛋白及mRNA水平上均顯著下調(diào),進一步采用RNA干擾技術(shù),觀察到SCADsiRNA干擾心肌細胞引起SCAD表達下調(diào)的同時,心肌細胞表面積明顯增大,心肌肥大標志物心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor, ANF)和腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide, BNP)均明顯上升[6-7],表明SCAD 表達失調(diào)可能與生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

    研究表明,心肌肥大發(fā)展過程中能量代謝底物的轉(zhuǎn)變與心肌過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)表達的下降及失活有關(guān)[8]。PPARα是核受體超家族成員,也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。研究證實,與野生型小鼠相比,PPARα-/-小鼠心肌中SCAD蛋白表達顯著下調(diào),且心肌對脂肪酸攝取、氧化能力下降,表明SCAD基因的表達受PPARα調(diào)控[9]。研究報道,PPARα為ERK1/2的下游作用靶點。PE誘導(dǎo)的心肌細胞病理性肥大模型中,激活的ERK1/2使PPARα的表達下調(diào),轉(zhuǎn)錄活性下降[10]。然而,研究表明,心臟生理性肥大時ERK1/2并無激活,與病理性心肌肥大的變化趨勢不一致[11]。

    目前認為,蛋白激酶C激活Raf-1,進而激活有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase,MAPK),MAPK信號通路(ERK1/2通路是其中之一)在心肌肥大中發(fā)揮著重要作用。然而MAPK信號通路在生理性和病理性心肌肥大中的作用尚未明確。本課題從心肌能量代謝的視角來探討生理性和病理性心肌肥大的發(fā)病機制,揭示生理性和病理性心肌肥大的分子調(diào)控機制的不同,豐富對心肌肥大發(fā)病機制的認識,以期為預(yù)測生理性與病理性心肌肥大及其預(yù)后尋找新的分子標志物,并為病理性心肌肥大的治療尋找新的靶點。

    材 料 和 方 法

    1 主要試劑和乳鼠心肌細胞培養(yǎng)

    RT-PCR測定試劑盒(DRR420A)、TRIzol(9108)和SYBR Green(DRR420S)購于TaKaRa;BCA蛋白定量試劑盒(23225)、Western blotting發(fā)光液(34080)購于Thermo;細胞SCAD活性比色法定量檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;游離脂肪酸測定試劑盒(A042)購于南京建成生物研究所;IGF-1(SRP4121)、PE(P6126)、 單克隆鼠抗PPARα和單克隆鼠抗α-tubulin購于Sigma;單克隆兔抗SCAD購于Abcam;單克隆兔抗p-ERK1/2和單克隆兔抗ERK1/2購于Cell Signaling Technology。

    采用本實驗室已建立的乳鼠心肌細胞改良法分離并培養(yǎng)心細胞,取2~3 d SD 乳鼠(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心) 用胰蛋白酶(Sigma) 冰上消化20 min 后,37 ℃水浴多次消化將乳鼠心臟消化成為單細胞懸液,在差速貼壁分離后,調(diào)節(jié)細胞密度種于培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并加入0.1 mmol/L BrdU(Sigma) 抑制成纖維細胞生長。按照上述方法分離制備的心肌細胞,經(jīng)α-actin 抗體的免疫細胞化學染色,純度可達95%以上,符合實驗要求。實驗分為:(1)對照組:正常培養(yǎng)心肌細胞;(2)IGF-1組:加入IGF-1(10 nmol/L)作用24 h;(3)PE組:加入PE(10 μmol/L)作用24 h。

    2 方法

    2.1心肌細胞表面積的檢測 按照實驗分組處理細胞,收獲細胞后用德國Zeiss(AX10)倒置熒光顯微鏡200倍攝像,各處理組隨機選取3次實驗的10個視野,每個視野約包含10個左右心肌細胞,測量100個心肌細胞的面積,以ImageJ圖像分析軟件分析結(jié)果。

    2.2Real-time PCR檢測mRNA的表達 按照TRIzol(TaKaRa)說明書步驟提取細胞或組織總RNA,采用紫外分光光度計檢測RNA樣品的260 nm、280 nm波長下的A值,檢測純度并計算出RNA的濃度。參照TaKaRa有限公司RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),將反應(yīng)管放置于PCR儀(Thermo) 中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。兩步法進行PCR擴增反應(yīng),按照說明書加入熒光染料(TaKaRa)、序列和RT 產(chǎn)物后在real-time PCR儀(Bio-Rad IQ5)中進行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù): 37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ (1個循環(huán))。具體引物序列見表1[由生工生物工程(上海)有限公司合成]。

    表1 Real-time PCR擴增產(chǎn)物引物序列

    2.3Western blotting法檢測蛋白表達 提取各組心肌細胞總蛋白,BCA 試劑(Thermo)檢測細胞蛋白含量后調(diào)整上樣量,分裝、變性,配置10% SDS 分離膠和5% 濃縮膠進行電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(Bio-Rad),室溫封閉1 h 后加入Ⅰ抗(SCAD,1 ∶1 000;PPARα,1∶1 000;p-ERK1/2,1∶1 000;ERK1/2,1∶1 000;α-tubulin,1∶10 000),過夜。漂洗后加入Ⅱ抗,室溫孵育1 h,化學發(fā)光試劑增強反應(yīng),X 線壓片曝光、顯影、定影,結(jié)果采用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

    2.4SCAD活性檢測 按照實驗分組處理細胞,收獲細胞后置于冰上裂解30 min,取上清液用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。酶活性檢測是基于2,6-二氯靛酚鈉(2,6-dichlorophenol indophenol, DCPIP)作為人工電子受體,替代黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD),在SCAD的作用下,由短鏈脂酰輔酶A提供電子,經(jīng)過硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate, PMS)的傳遞,被還原為無色產(chǎn)物,通過分光光度儀的峰值變化(600 nm 波長),來定量分析SCAD的活性。嚴格按照說明書采用酶標儀法進行檢測。

    2.5心肌細胞游離脂肪酸含量測定 游離脂肪酸含量檢測原理是游離脂肪酸能與銅離子結(jié)合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中,其含量與游離脂肪酸含量成正比,用銅試劑測定其中銅離子的含量,即可推算出游離脂肪酸的含量。按照實驗分組處理細胞,收獲細胞后于冰上用手動勻漿器破碎細胞,取上清BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。嚴格按照游離脂肪酸測定試劑盒(A042)說明書進行檢測,根據(jù)吸光率計算游離脂肪酸含量[nmol/(g protein)]。

    3 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD) 表示,采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理,組間比較應(yīng)用單因素方差分析。

    結(jié) 果

    1 各組心肌細胞表面積的變化

    由圖1可見,與對照組相比,分別用PE和IGF-1刺激心肌細胞后,心肌細胞的表面積均顯著增大,表明PE和IGF-1都能誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生明顯肥大。

    Figure 1. Surface area of neonatal rat cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

    2 各組心肌細胞mRNA表達的變化

    由圖2可見,與對照組相比,肥大標志物ANF和BNP都明顯升高,病理性肥大標志物α-骨骼肌肌動蛋白(α-skeletal actin, α-SkA)在PE刺激下明顯升高,而IGF-1刺激無明顯變化,與研究報道的結(jié)果一致[12-14],這說明PE誘導(dǎo)的病理性肥大模型和IGF-1誘導(dǎo)的生理性肥大模型建立成功。與對照組相比,在PE刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD mRNA表達均顯著下調(diào),而IGF-1刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD mRNA表達均顯著上調(diào)。PPARα和SCAD mRNA表達在2種不同心肌肥大模型中表現(xiàn)出明顯的不一致,表明生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展可能與PPARα和SCAD的表達失調(diào)有密切關(guān)系。

    3 各組心肌細胞蛋白表達的變化

    由圖3可見,與對照組相比,PE刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD蛋白的表達顯著下降,IGF-1刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD蛋白的表達顯著上升,這一變化與PPARα和SCAD mRNA的表達變化一致。然而,與對照組相比,p-ERK1/2蛋白的表達在PE刺激的心肌細胞中顯著增加,在IGF-1刺激的心肌細胞中顯著下降。這表明PE可能通過刺激ERK1/2磷酸化激活抑制PPARα表達,從而抑制下游SCAD表達,引發(fā)病理性心肌肥大的發(fā)生;而IGF-1刺激可能通過引起ERK1/2磷酸化受抑制,使PPARα表達上調(diào),從而促進SCAD表達增加引發(fā)生理性心肌肥大。

    Figure 2. Relative mRNA expression of ANF, BNP, α-SkA, PPARα and SCAD in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

    Figure 3. The protein expression of PPARα, SCAD and p-ERK1/2 in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.*P<0. 05, **P<0. 01 vs control.

    4 各組心肌細胞SCAD的酶活性變化

    由圖4可見,與對照組相比,PE刺激的心肌細胞SCAD活性顯著減弱,而IGF-1刺激的心肌細胞SCAD活性顯著增強。各組心肌細胞的SCAD活性與其SCAD mRNA和蛋白表達變化趨勢一致。表明在2種不同的心肌肥大中,SCAD不僅在表達量上有不一致的變化,而且酶活性也存在不一致的結(jié)果。

    5 各組心肌細胞游離脂肪酸含量的變化

    由圖5可見,與對照組相比,PE刺激的心肌細胞中游離脂肪酸含量顯著升高,而IGF-1刺激的心肌細胞中游離脂肪酸含量顯著降低。這表明PE刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性減低導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力降低,從而使心肌細胞中游離脂肪酸含量增加;而IGF-1刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性增加導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強,從而使心肌細胞中游離脂肪酸含量下降。

    Figure 4. The activity of SCAD in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

    Figure 5. The content of free fatty acid in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

    討 論

    運動性心肌肥大本質(zhì)上是心臟對身體負荷的代償性機制, 是對運動訓練的良好適應(yīng)性反應(yīng),身體訓練對于心臟的負荷作用遠遠小于因持續(xù)性和進行性容量或壓力負荷過重等病理負荷對心臟的影響[15]。高血壓引起的病理性心肌肥大是心臟對急、慢性血流動力學超負荷的一種適應(yīng)性反應(yīng),是心臟為適應(yīng)長期的壓力或容量負荷而產(chǎn)生的代償性改變,是心力衰竭的前驅(qū)病變。越來越多的研究表明,病理性心肌肥大是臨床上多種心血管疾病發(fā)生率和死亡率增高的一個獨立危險因素[16]。因此,探討生理性與病理性心肌肥大的本質(zhì)區(qū)別,尋找防治病理性心肌肥大的潛在靶點,改善心臟功能,延緩其向心衰發(fā)展,對臨床心血管疾病治療有重要意義。

    IGF-1作為一種媒介,參與心臟發(fā)育、心肌肥厚以及對肌肉體積、力量、身體成分的維持和營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)的重要作用。越來越多的證據(jù)表明,IGF-1在心血管系統(tǒng)中具有特殊作用。它可以促進心肌生長,提高心肌收縮力、心輸出量、心室容積并且可以通過刺激收縮和抑制細胞凋亡來維持心臟功能[17]。在誘導(dǎo)心肌細胞肥大的因素中, 神經(jīng)體液因素是一類常見的原因, 其中腎上腺素受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是心肌細胞肥大的一個重要因素。本研究中,IGF-1和PE刺激的心肌細胞表面積與對照組相比均顯著增大。同時,在mRNA表達變化研究中,肥大標志物ANF和BNP都明顯升高,而病理性肥大標志物α-SkA在PE刺激下升高,而IGF-1刺激無明顯變化,與研究報道的結(jié)果一致[12-14]。這表明PE誘導(dǎo)的病理性心肌細胞肥大模型和IGF-1誘導(dǎo)的生理性心肌細胞肥大模型都建立成功。

    SCAD是脂酰輔酶A 脫氫酶家族中的一員,是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[3]。本研究中,IGF-1刺激的心肌細胞SCAD mRNA和蛋白表達均顯著上調(diào),而PE刺激的心肌細胞SCAD mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào),兩者之間存在顯著差異,與蛋白質(zhì)組學的研究結(jié)果一致[4]。這表明SCAD的表達失調(diào)可能與生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)系。同時,IGF-1刺激的心肌細胞SCAD活性明顯增強,游離脂肪酸含量顯著下降,表明IGF-1刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性增加可能導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強,促進了心肌細胞游離脂肪酸代謝,使心肌細胞中游離脂肪酸含量下降,從而達到心肌細胞能量代謝和功能增強的作用。而PE刺激的心肌細胞SCAD活性明顯減弱,游離脂肪酸含量顯著增高,表明PE刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性下降可能導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力減弱,使得心肌細胞對游離脂肪酸利用減少,使心肌細胞中游離脂肪酸含量增加,這種變化引起了心肌細胞能量代謝紊亂和結(jié)構(gòu)改變以及功能的降低。綜上所述,SCAD在2種不同的心肌肥大中具有顯著差異,提示SCAD可能成為區(qū)別生理性和病理性心肌肥大的分子標志物,并且有可能成為病理性心肌肥大的潛在治療靶點。

    心肌肥大發(fā)展過程中能量代謝底物的轉(zhuǎn)變與心肌PPARα表達的下降及失活有關(guān)[8]。PPARα是核受體超家族成員,也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。本研究中,IGF-1刺激的心肌細胞PPARα mRNA和蛋白表達均顯著上調(diào),而PE刺激的心肌細胞PPARα mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào),與SCAD mRNA和蛋白表達變化趨勢相一致。表明PPARα可能調(diào)控SCAD的表達,并且這種表達調(diào)控呈正相關(guān)性。有研究報道,PPARα為ERK1/2的下游作用靶點。同時,在本研究中,p-ERK1/2蛋白的表達在IGF-1刺激的心肌細胞中顯著下降,在PE刺激的心肌細胞中顯著增高,而總ERK1/2在各組間無明顯變化。這表明ERK1/2可能在磷酸化激活后調(diào)控PPARα的表達,并且這種表達調(diào)控呈負相關(guān)性。

    綜上所述, IGF-1可能通過刺激心肌細胞中ERK1/2磷酸化受抑制,從而使PPARα表達增加,進一步使SCAD表達和酶活性增加,促使心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強,導(dǎo)致生理性心肌肥大;而PE可能通過刺激心肌細胞中ERK1/2磷酸化激活后,從而抑制PPARα表達,進一步使SCAD表達和酶活性降低,導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力減弱,引發(fā)病理性心肌肥大的發(fā)生。本研究揭示了生理性和病理性心肌肥大的分子機制調(diào)控的不同,豐富了對心肌肥大機制的認識。然而,SCAD作為生理性和病理性心肌肥大的分子標志物和病理性心肌肥大的作用靶點的可能仍需要更深入的研究。

    [參 考 文 獻]

    [1] Kolwicz SC Jr, Tian R. Glucose metabolism and cardiac hypertrophy[J]. Cardiovasc Res,2011, 90(2):194-201.

    [2] Foryst-Ludwig A, Kreissl MC, Sprang C, et al. Sex differences in physiological cardiac hypertrophy are asso-ciated with exercise-mediated changes in energy substrate availability[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 301(1):H115-H122.

    [3] Pena L, Angle B, Burton B, et al. Follow-up of patients with short-chain acyl-CoA dehydrogenase and isobutyryl-CoA dehydrogenase deficiencies identified through newborn screening: one center’s experience[J]. Genet Med, 2012, 14(3):342-347.

    [4] Zhou SG, Zhou SF, Huang HQ, et al. Proteomic analysis of hypertrophied myocardial protein patterns in renovascularly hypertensive and spontaneously hypertensive rats[J].J Proteome Res, 2006, 5(11):2901-2908.

    [5] 周四桂,王 平,路 遙,等. 短鏈?;o酶A脫氫酶在大鼠生理性和病理性心肌肥大中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(11):1921-1927.

    [6] 羅佳妮,周四桂,陳少銳,等. 短鏈脂酰輔酶A脫氫酶與心肌肥大關(guān)系的初步探索[J].中國藥理學通報, 2013, 29(5):673-642.

    [7] 黃金賢,羅佳妮,劉培慶,等. AMPK/PPARα/SCAD信號途徑對心肌肥大的調(diào)控研究[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(5):769-778.

    [8] Smeets PJ, Teunissen BE, Willemsen PH, et al. Cardiac hypertrophy is enhanced in PPARα-/-mice in response to chronic pressure overload[J]. Cardiovasc Res, 2008, 78(1):79-89.

    [9] Watanabe K, Fujii H, Takahashi T, et al. Constitutive regulation of cardiac fatty acid metabolism through peroxisome proliferator-activated receptor alpha associated with age-dependent cardiac toxicity[J]. J Biol Chem, 2000, 275(29):22293-22299.

    [10] Meng R, Pei Z, Zhang A, et al. AMPK activation enhances PPARα activity to inhibit cardiac hypertrophy via ERK1/2 MAPK signaling pathway[J]. Arch Biochem Biophys, 2011, 511(1-2):1-7.

    [11] Gosslesin H, Béliveau L, Burelle Y, et al. Disparate regulation of signaling proteins after exercise and myocardial infarction[J]. Med Sci Sports Exercise, 2006, 38(3):455-462.

    [12] Arantes LA, Aguiar CJ, Amaya MJ, et al. Nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate is a necessary and conserved signal for the induction of both pathological and physiological cardiomyocyte hypertrophy[J]. J Mol Cell Cardiol, 2012, 53(4):475-486.

    [13] Bhavsar PK, Brand NJ, Felkin LE, et al. Clenbuterol induces cardiac myocyte hypertrophy via paracrine signalling and fibroblast-derived IGF-1[J]. J Cardiovasc Transl Res, 2010, 3(6):688-695.

    [14] Kong SW, Bodyak N, Yue P, et al. Genetic expression profiles during physiological and pathological cardiac hypertrophy and heart failure in rats[J]. Physiol Genomics, 2005, 21(1):34-42.

    [15] 常 蕓. 運動性與病理性心肌肥大[J]. 中國運動醫(yī)學雜志, 1989, 8(1):35-37.

    [16] Takasaki K,Miyata M,Imamura M,et al. Left ventricular dysfunction assessed by cardiac time interval analysis among different geometric patterns in untreated hypertension[J]. Circ J, 2012, 76(6):1409-1414.

    [17] Sell C, Baserga R, Rubin R. Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and the IGF-1 receptor prevent etoposide-ieduced apoptosis[J]. Cancer Res, 1995, 55(2):303-306.

    猜你喜歡
    生理性病理性游離
    黃瓜15種生理性病害
    股骨中上段慢性骨髓炎合并病理性骨折患者術(shù)中頑固性低血壓1例
    小針刀療法在病理性疼痛中的研究進展
    磷脂酶Cε1在1型糖尿病大鼠病理性神經(jīng)痛中的作用初探
    莫須有、蜿蜒、夜游離
    牛貝諾孢子蟲病的發(fā)生、病理性診斷及防治
    生理性海水在鼻內(nèi)鏡術(shù)后的臨床分析應(yīng)用
    超薄游離股前外側(cè)皮瓣修復(fù)足背軟組織缺損
    生理性缺血訓練對急性腦梗死患者運動功能恢復(fù)的影響
    游離血紅蛋白室內(nèi)質(zhì)控物的制備及應(yīng)用
    国产xxxxx性猛交| 黑丝袜美女国产一区| 国产欧美日韩一区二区三| 在线观看免费视频网站a站| 午夜福利欧美成人| 午夜福利一区二区在线看| 色在线成人网| 国产精品影院久久| 精品电影一区二区在线| 亚洲三区欧美一区| av免费在线观看网站| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久国产成人免费| 久久性视频一级片| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品,欧美在线| 好男人电影高清在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av免费在线观看网站| av免费在线观看网站| 精品国产亚洲在线| 黄色 视频免费看| 999久久久国产精品视频| 日本五十路高清| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜福利18| 91成人精品电影| 亚洲成人精品中文字幕电影| 91成人精品电影| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 婷婷六月久久综合丁香| 深夜精品福利| 午夜福利一区二区在线看| 国产一区二区在线av高清观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品国产乱码久久久久久男人| 制服丝袜大香蕉在线| 国产成人精品无人区| 免费看十八禁软件| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美乱妇无乱码| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩欧美免费精品| 国产免费av片在线观看野外av| 精品国产亚洲在线| 国产乱人伦免费视频| 757午夜福利合集在线观看| 欧美日本视频| 美女国产高潮福利片在线看| 精品福利观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产午夜福利久久久久久| 国产99白浆流出| 男人舔女人的私密视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲av片天天在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 黄片播放在线免费| 人人澡人人妻人| 窝窝影院91人妻| 亚洲国产欧美网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久这里只有精品19| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 极品人妻少妇av视频| 亚洲一区高清亚洲精品| www.精华液| 91老司机精品| 看片在线看免费视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 九色亚洲精品在线播放| 一区二区三区激情视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品一区av在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲成a人片在线一区二区| 操美女的视频在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久电影中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 一级毛片女人18水好多| 9热在线视频观看99| 妹子高潮喷水视频| 国产野战对白在线观看| 丁香欧美五月| 免费在线观看完整版高清| 免费高清视频大片| 涩涩av久久男人的天堂| 免费在线观看影片大全网站| 国内精品久久久久精免费| 亚洲国产中文字幕在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 日本a在线网址| av网站免费在线观看视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩视频一区二区在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜两性在线视频| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲美女黄片视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品乱码久久久久久99久播| 精品国产美女av久久久久小说| 天堂动漫精品| 国产一区二区激情短视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久精品国产综合久久久| 91精品国产国语对白视频| 亚洲av片天天在线观看| 无限看片的www在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩精品中文字幕看吧| 成年版毛片免费区| 国产视频一区二区在线看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲七黄色美女视频| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 黄频高清免费视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费看美女性在线毛片视频| 变态另类丝袜制服| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲午夜理论影院| 曰老女人黄片| 国产精品一区二区免费欧美| 制服诱惑二区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 操美女的视频在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜久久久在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲av成人一区二区三| 九色亚洲精品在线播放| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲视频免费观看视频| 国产成人精品久久二区二区91| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美久久黑人一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 999精品在线视频| 欧美在线黄色| 丝袜美腿诱惑在线| 国产av精品麻豆| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美成狂野欧美在线观看| 性欧美人与动物交配| www.熟女人妻精品国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 搞女人的毛片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲最大成人中文| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美午夜高清在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 中亚洲国语对白在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 国产亚洲欧美精品永久| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧美激情在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99热只有精品国产| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美色视频一区免费| 大码成人一级视频| 成人欧美大片| 色哟哟哟哟哟哟| 一进一出好大好爽视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜日韩欧美国产| 又紧又爽又黄一区二区| 国产欧美日韩一区二区三| 久久亚洲真实| www.精华液| 一二三四在线观看免费中文在| 在线永久观看黄色视频| av在线天堂中文字幕| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产免费av片在线观看野外av| 国产av精品麻豆| 两性夫妻黄色片| 久久影院123| 亚洲av成人av| 我的亚洲天堂| 在线观看免费午夜福利视频| 老司机福利观看| 9191精品国产免费久久| 999精品在线视频| 国产成人欧美| 黄色a级毛片大全视频| 日本 欧美在线| 中文字幕av电影在线播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 最好的美女福利视频网| 久久久久久国产a免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 成人特级黄色片久久久久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 91字幕亚洲| 国产欧美日韩一区二区三| 91精品三级在线观看| 大型av网站在线播放| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 美国免费a级毛片| 国产精品国产高清国产av| 激情在线观看视频在线高清| 国产男靠女视频免费网站| 久热这里只有精品99| 男女下面插进去视频免费观看| av片东京热男人的天堂| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 97人妻天天添夜夜摸| 乱人伦中国视频| 免费在线观看完整版高清| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 91在线观看av| 久久人人精品亚洲av| 欧美日韩乱码在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲av成人一区二区三| 一进一出抽搐gif免费好疼| 岛国视频午夜一区免费看| 麻豆av在线久日| 精品久久久久久成人av| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲中文字幕日韩| 此物有八面人人有两片| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 此物有八面人人有两片| 99国产精品免费福利视频| 国产成人精品在线电影| 亚洲精华国产精华精| 欧美一级毛片孕妇| 久久青草综合色| 757午夜福利合集在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 大香蕉久久成人网| 午夜成年电影在线免费观看| 黑人操中国人逼视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产精品野战在线观看| 激情视频va一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品福利观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 狠狠狠狠99中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 91老司机精品| 成人av一区二区三区在线看| 久久久国产精品麻豆| 久久久国产成人精品二区| 欧美日韩精品网址| 亚洲av第一区精品v没综合| 99国产精品99久久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产激情久久老熟女| 亚洲中文字幕日韩| 午夜福利,免费看| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美日韩黄片免| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品无人区乱码1区二区| 一本综合久久免费| 国产野战对白在线观看| 亚洲无线在线观看| 两性夫妻黄色片| 日日夜夜操网爽| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费不卡黄色视频| 日韩视频一区二区在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 午夜视频精品福利| 久久香蕉激情| 黄色 视频免费看| 视频在线观看一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 性色av乱码一区二区三区2| 色综合婷婷激情| 久久精品影院6| 午夜久久久久精精品| av在线播放免费不卡| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 欧美成人午夜精品| 亚洲黑人精品在线| 精品福利观看| 亚洲精华国产精华精| 又黄又爽又免费观看的视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 热re99久久国产66热| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美大码av| 国产免费av片在线观看野外av| 老司机福利观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 狂野欧美激情性xxxx| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费不卡黄色视频| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久久久久人人人人人| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲 国产 在线| 99香蕉大伊视频| 在线观看www视频免费| 日韩高清综合在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 黄片大片在线免费观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 一本久久中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日韩大码丰满熟妇| 成人特级黄色片久久久久久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 女性被躁到高潮视频| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美乱色亚洲激情| 日韩欧美免费精品| 757午夜福利合集在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲av电影在线进入| 麻豆一二三区av精品| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩大尺度精品在线看网址 | 黄色毛片三级朝国网站| 国产一区在线观看成人免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美中文综合在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产私拍福利视频在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 老司机福利观看| 999精品在线视频| 免费高清视频大片| 久久久国产成人精品二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本 av在线| 美女 人体艺术 gogo| 久热爱精品视频在线9| 露出奶头的视频| 一级毛片女人18水好多| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲无线在线观看| 美国免费a级毛片| 日韩欧美免费精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日本 欧美在线| 一级a爱视频在线免费观看| 中国美女看黄片| 国产精品亚洲一级av第二区| 后天国语完整版免费观看| 动漫黄色视频在线观看| 国产av又大| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线观看日韩欧美| 日本五十路高清| 国产97色在线日韩免费| 精品国产一区二区三区四区第35| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 丁香欧美五月| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲熟妇熟女久久| netflix在线观看网站| 亚洲九九香蕉| 国产成+人综合+亚洲专区| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩精品中文字幕看吧| 大型av网站在线播放| 色综合婷婷激情| 一级a爱片免费观看的视频| 一进一出抽搐动态| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲人成电影观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲欧美激情综合另类| 国产xxxxx性猛交| 午夜成年电影在线免费观看| 88av欧美| 国产成人免费无遮挡视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成人永久免费在线观看视频| 免费搜索国产男女视频| 激情视频va一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区精品| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久性视频一级片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久这里只有精品19| 亚洲美女黄片视频| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 波多野结衣巨乳人妻| 丝袜美腿诱惑在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产成人影院久久av| 妹子高潮喷水视频| 精品国产一区二区久久| 亚洲第一av免费看| av天堂久久9| www.999成人在线观看| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品1区2区在线观看.| 一区二区三区精品91| ponron亚洲| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 制服人妻中文乱码| 亚洲中文av在线| 看黄色毛片网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 免费搜索国产男女视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产野战对白在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产片内射在线| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲精品美女久久av网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久狼人影院| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲成人久久性| 久久亚洲真实| 老司机在亚洲福利影院| 啪啪无遮挡十八禁网站| 香蕉久久夜色| 在线天堂中文资源库| 国产精品一区二区在线不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 99久久精品国产亚洲精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 99国产综合亚洲精品| 欧美不卡视频在线免费观看 | 91精品三级在线观看| 亚洲午夜理论影院| 色播亚洲综合网| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品 国内视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美黄色淫秽网站| av视频免费观看在线观看| 伦理电影免费视频| 国产午夜精品久久久久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲全国av大片| 老司机福利观看| 午夜福利,免费看| 亚洲午夜理论影院| 亚洲五月天丁香| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产欧美日韩一区二区三| 一级毛片精品| 久久久久久久精品吃奶| 黄色 视频免费看| 女警被强在线播放| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费搜索国产男女视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 长腿黑丝高跟| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲美女黄片视频| av福利片在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美成人性av电影在线观看| 成人欧美大片| 国产免费av片在线观看野外av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品98久久久久久宅男小说| 女性生殖器流出的白浆| 天堂影院成人在线观看| 色在线成人网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| av免费在线观看网站| 久久中文字幕一级| 午夜福利成人在线免费观看| ponron亚洲| 久久久国产成人免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲情色 制服丝袜| 深夜精品福利| 久久影院123| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美国产日韩亚洲一区| 免费av毛片视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲,欧美精品.| 欧美一级a爱片免费观看看 | 热re99久久国产66热| av欧美777| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 天堂影院成人在线观看| 午夜福利,免费看| 精品一区二区三区av网在线观看| 天堂动漫精品| 91精品国产国语对白视频| 淫秽高清视频在线观看| 脱女人内裤的视频| 1024香蕉在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 1024香蕉在线观看| 成人三级做爰电影| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 老司机午夜十八禁免费视频| av天堂在线播放| 18禁黄网站禁片午夜丰满| www.自偷自拍.com| 很黄的视频免费| 日韩精品青青久久久久久| aaaaa片日本免费| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久这里只有精品19| 久久精品国产清高在天天线| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人系列免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| av超薄肉色丝袜交足视频| 波多野结衣高清无吗| 制服人妻中文乱码| 日韩欧美免费精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产亚洲欧美98| 国产精品一区二区三区四区久久 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 少妇的丰满在线观看| 在线天堂中文资源库| 精品福利观看| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产精华一区二区三区| 啦啦啦免费观看视频1| 久久 成人 亚洲| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 级片在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久精品91蜜桃| 人妻久久中文字幕网| videosex国产| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美成人免费av一区二区三区| 色综合站精品国产| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久国产成人精品二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 一二三四在线观看免费中文在| 最新在线观看一区二区三区| АⅤ资源中文在线天堂| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美激情 高清一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | www.自偷自拍.com| 两个人看的免费小视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久人妻av系列| cao死你这个sao货| 免费看a级黄色片| 精品国内亚洲2022精品成人|