miR-155種子序列的反義寡核苷酸對抗多發(fā)性骨髓瘤的作用*

豐茂曉， 朱容萱， 駱小闖， 古春明， 曾 雪， 費 嘉△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)與分子生物學(xué)系, 2臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是惡性漿細胞克隆性增殖疾病，其發(fā)病機制涉及多個方面，包括染色體數(shù)量異常、易位、基因突變、表觀遺傳學(xué)改變以及骨髓微環(huán)境的改變[1]。多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病呈現(xiàn)多步驟的過程，早期的染色體易位涉及到14號染色體(14q32.33)和4號染色體(4p16.3)，結(jié)果導(dǎo)致4號染色體上相鄰的多發(fā)性骨髓瘤組蛋白(multiple myeloma SET protein，MMSET)基因和成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptors 3，F(xiàn)GFR3)基因發(fā)生分離[2]。隨著疾病的發(fā)展，將再次發(fā)生染色體易位、相關(guān)基因的突變(涉及到K-RAS和N-RAS的激活)、復(fù)雜核型畸變、p53和FGFR3基因的突變以及細胞周期素依賴性激酶抑制劑2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)和細胞周期素依賴性激酶抑制劑2C(cyclin-dependent kinase inhibitor 2C,CDKN2C)基因的失活[2]。這些遺傳畸變將導(dǎo)致惡性漿細胞黏附分子表達的改變，必然引起漿細胞和骨髓基質(zhì)的異常作用[2]，進而引起人骨髓微環(huán)境(human bone marrow microenvironment, huBMM)中的漿細胞發(fā)生多級轉(zhuǎn)變，這些轉(zhuǎn)變對腫瘤細胞生長、存活和耐藥性有著重要的影響[3-5]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)MM細胞中的miRNAs呈顯著的異常表達，并認(rèn)為這些異常表達的miRNAs與漿細胞發(fā)生遺傳學(xué)畸變，特別是與染色體異常有密切的關(guān)聯(lián)[2,6-7]。

Al Masri等[8]的研究發(fā)現(xiàn)在細胞系和病人的骨髓樣本中，惡性的漿細胞miRNA的表達水平出現(xiàn)明顯的差異，其中高表達的miRNAs包括miR-125b、miR-133a、miR-1和miR-124a。Bakkus等[9]也檢測出MM病人以及細胞系中一些高表達的miRNAs(let-7a、miR-16、miR-17-5p和miR-19b)。Picchiorri等[10]還發(fā)現(xiàn)，miRNA-17～92群(miRNA-19a、-19b和-92)和miRNA-106～25 群(miRNA-106b、-93和-25)在MM樣品中也呈現(xiàn)高表達的現(xiàn)象，miRNA-17～92通過靶向負性調(diào)節(jié)凋亡前體蛋白Bim的表達，有助于骨髓瘤的形成。Lane等[11]對MM樣品中異常表達的miRNA 進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miR-19a和miR-19b表達水平升高，并揭示這些miRNAs參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)和白細胞介素 6(interleukin-6, IL-6)的抗凋亡途徑。根據(jù)染色體易位和周期蛋白D (translocation/cyclin D, TC)分類，Lionetti等[6]通過多重分析發(fā)現(xiàn)MM在5個TC組中有26個miRNAs具有顯著表達差異現(xiàn)象，其中值得注意的是在TC5組中有10種miRNAs相比于其它4個TC組有明顯的過表達趨勢。在這10種過表達的miRNAs中，miR-155在MM中高水平表達首次被發(fā)現(xiàn)。 目前已知miR-155在B細胞淋巴瘤中是一個重要的生物標(biāo)志物，有關(guān)miR-155在惡性漿細胞病中的功能還沒有文獻報道。由于漿細胞也是來源于B細胞，因此，miR-155在MM中是否具有類似B細胞淋巴瘤中癌基因功能，這引起我們極大的關(guān)注。

miRNA是一類內(nèi)源性，約22個核苷酸長度的非編碼小RNA，通過轉(zhuǎn)錄后負性調(diào)控機制在細胞過程中起著重要的作用。成熟的miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’UTR)配對，從而抑制翻譯過程或降解靶mRNA。這些小分子RNA也可能在腫瘤形成過程中起重要作用[12]，類似癌基因(oncomiRs)功能，因此oncomiRs被當(dāng)作為癌癥治療新的靶點[13]。另一方面，在miRNA的5’端具有7～8個高度保守序列，被稱為種子序列。種子序列通過與其靶基因mRNA的3’UTR進行堿基完全互補配對，促進靶基因mRNA降解或抑制mRNA翻譯，從而對靶基因的表達水平進行轉(zhuǎn)錄后的負性調(diào)控[14-16]。針對miRNA種子序列反義核酸可以干擾miRNA與靶基因的配對，從而阻止miRNA發(fā)揮功能。相對于成熟miRNA而言，針對種子序列的反義核酸具有分子量小、特異性強、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，因而開始受到關(guān)注[17]。

為了闡述miR-155在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的作用，本研究針對miR-155的種子序列合成miR-155的微小反義核酸(tiny antimiR-155, t-antimiR-155)，靶向作用于多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8266中的miR-155，探究t-antimiR-155對多發(fā)性骨髓瘤細胞的抑制效應(yīng)，為腫瘤基因治療尋找新的方法，同時也為針對miRNA種子序列的反義核酸藥物開發(fā)創(chuàng)造有利條件。

材 料 和 方 法

1 反義寡核苷酸的設(shè)計與合成

從microRNA Families數(shù)據(jù)庫中獲取人miR-155的種子序列，根據(jù)序列互補原理設(shè)計針對種子序列的反義寡核苷酸序列(t-antimiR-155)，并采用BLAST軟件分析確定其反義寡核苷酸序列及隨機對照序列，見圖1。

Figure 1. The sequences of miR-155 and t-antimiR-155.

2 主要試劑

MTT和DMSO購自Sigma；胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；LipofectamineTM2000購自Invitrogen。反義寡核苷酸序列(t-antimiR-155)：5’-AGCATTAA-3’；隨機序列(scrambled sequence，SCR)：5’-TCATACTA-3’，均由上海生物工程有限公司合成，全硫代修飾，高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)純化。

3 主要方法

3.1細胞培養(yǎng) 將RPMI-8266細胞(多發(fā)性骨髓瘤細胞，南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院惠贈)接種于含10%胎牛血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2～3 d換液傳代。實驗選用對數(shù)生長期、0.2%臺盼藍拒染率>95%的細胞。

3.2MTT法篩選反義寡核苷酸的最佳作用濃度 本實驗分t-antimiR-155組、SCR組和空白對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔。t-antimiR-155組中t-antimiR-155的核酸終濃度為0.2、0.3、0.4 和0.5 μmol/L，SCR組中隨機序列的核酸終濃度為0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L。取對數(shù)生長期的RPMI-8266細胞，各組細胞以1×108cells/L的密度接種于96孔板，每孔50 μL，轉(zhuǎn)染終體積100 μL(轉(zhuǎn)染方法參照Invitrogen公司LipofectamineTM2000說明書)，空白對照組加入50 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6 h后，每孔加入100 μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，使每孔終體積為200 μL。48 h后每孔加入MTT液20 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在多功能酶標(biāo)儀上測定吸光度A570。實驗重復(fù)3次，計算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

3.3甲基纖維素細胞集落培養(yǎng)實驗觀察細胞集落形成情況 實驗分組同前，根據(jù)文獻改進[11]，取對數(shù)生長期的RPMI-8266細胞，按1×103cells/well接種于含20%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、5 μmol/L β-疏基乙醇和0.9%甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)7 d。倒置顯微鏡下計數(shù)集落數(shù)和觀察集落形態(tài)，以大于40個細胞的細胞團為1個集落。實驗重復(fù)3次，計算相對集落形成率=(實驗組/空白對照組)×100%。

3.4流式細胞儀計量分析RPMI-8266細胞凋亡情況 實驗分組同前，各組細胞以5×107cells/L的密度接種于24孔板，每孔400 μL，轉(zhuǎn)染終體積500 μL，空白對照組加入與實驗組同體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。6 h后加入500 μL 含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反義寡核苷酸組和隨機對照組的核酸終濃度為0.4 μmol/L。48 h后離心收集細胞，采用Annexin V/PI二重染色，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析法(one-way AVONA)分析各組數(shù)據(jù)差異的顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法篩選反義寡核苷酸最佳作用濃度

t-antimiR-155在0.2 μmol/L和0.4 μmol/L之間有效抑制RPMI-8266細胞增殖活性，其最佳作用濃度為0.4 μmol/L，與SCR組相比差異顯著(P<0.05)。t-antimiR-155在0.5 μmol/L的濃度顯示出非特異性作用，見圖2。

Figure 2. Inhibition rate of RPMI-8266 cells after transfected with t-antimiR-155.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR group.

2 反義寡核苷酸對細胞集落形成的影響

采用甲基纖維素為支持物的集落形成法(colony forming method)檢測RPMI-8266細胞的自我更新和增殖能力。7 d后，與SCR組相比，0.4 μmol/L反義寡核苷酸作用于RPMI-8266細胞后，細胞集落形成能力較弱,集落形成抑制率較高，差異顯著(P<0.05),見圖3。

3 反義寡核苷酸對細胞凋亡的影響

0.4 μmol/L反義寡核苷酸作用于RPMI-8266細胞48 h后，經(jīng)Annexin V/PI二重染色，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率為7.56%。與SCR組相比，其凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖4。以上實驗結(jié)果表明t-antimiR-155作用于RPMI-8266細胞后，細胞生長受到抑制，細胞凋亡明顯增加。

Figure 3. Cell colony formation assay of RPMI-8266 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR.

Figure 4. Flow cytometry analysis of the apoptosis of RPMI-8266 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR.

討 論

多發(fā)性骨髓瘤是起源于漿細胞的惡性克隆增殖性疾病，以血清或尿液中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白以及多器官功能損害為特征，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%。常規(guī)化療緩解率低，迄今難以治愈[18-19]，因此，需要尋找新的治療手段。

miR-155位于21號染色體上，參與人體造血、炎癥和免疫等功能[6]。作為一個類似癌基因， miR-155在多個腫瘤中高水平表達[20]，與白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌的形成過程都有密切的關(guān)系[21]。在華氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom macroglobulinemia，WM)中，失調(diào)的miR-155通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt和核因子κB信號通路，影響WM細胞生存和生長[22]；通過敲除miR-155，導(dǎo)致位于G1期的WM細胞明顯降低，同時導(dǎo)致細胞周期依賴激酶和細胞周期蛋白D下調(diào)并刺激p53蛋白過表達。這意味著miR-155在WM細胞中通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白導(dǎo)致G1期阻滯[22]。雖然WM和MM一樣，也是漿細胞病的一種，但miR-155在MM中確切的功能還不清楚。

基于文獻報道m(xù)iR-155在MM中的高水平表達[6]，可能具有類似癌基因的作用，本研究針對miR-155的種子序列合成反義寡核苷酸t(yī)-antimiR-155，研究其在多發(fā)性骨髓瘤中的抑制作用。我們的數(shù)據(jù)顯示t-antimiR-155經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，顯著抑制RPMI-8266細胞的增殖，其最佳作用濃度為0.4 μmol/L(圖2)。其他的研究揭示乳腺癌中miR-155靶基因編碼的蛋白是轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a(forkhead box O3a)，涉及細胞的存活[23]。同時，Linnstaedt等[24]也證實在大細胞淋巴瘤和彌散性大B細胞淋巴性淋巴瘤中，抑制miR-155的水平也可以抑制細胞的生長，與我們的結(jié)果一致。本研究首次采用了克隆形成實驗來研究t-antimiR-155對RPMI-8266細胞惡性程度的影響，數(shù)據(jù)顯示t-antimiR-155可以降低RPMI-8266細胞集落形成的能力(圖3)，有效抑制RPMI-8266細胞的惡性進展。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示t-antimiR-155可以明顯促進RPMI-8266細胞的凋亡(圖4)。

在體內(nèi)和體外實驗中，針對于mRNA的反義核苷酸已經(jīng)被廣泛用于評價靶基因的功能[25]，同時有些反義核酸治療方法已經(jīng)用于臨床實驗[25-26]，反義核苷酸藥物具有安全性高、易合成、直接抑制靶基因表達等優(yōu)點。miRNA反義核苷酸也是根據(jù)堿基互補配對原理，化學(xué)或生物合成與特定的miRNA初級轉(zhuǎn)錄物、miRNA前體或成熟的miRNA互補的DNA或RNA序列。在細胞中miRNA反義DNA與靶miRNA形成miRNA-DNA雜化鏈，激活RNA酶H，引起miRNA的降解，從而達到基因控制和治療的目的。由于成熟miRNA只有19～24個核苷酸，目前認(rèn)為用反義核苷酸抑制它們的功能是最好、也可能是唯一的方法[27]。

反義核苷酸技術(shù)在實際應(yīng)用中也存在一些不容忽視的問題，比如高濃度藥物也有一定的毒副作用，與靶序列的親和力低，特別是藥物在體內(nèi)易被降解以及向靶器官傳遞效果不佳等制約了反義藥物開發(fā)的進程等。對反義寡核苷酸進行一系列的化學(xué)修飾，可以增加反義寡核苷酸的親和力，提高其抗性和在體內(nèi)的輸送效率。提高反義寡核苷酸與靶RNA親和力的修飾涉及糖環(huán)部分，常用的修飾方法有鎖核苷酸(locked nucleic acid, LNA)修飾、2′-O-甲基(2′-O-methyl)修飾、2′-O-甲氧乙基(2′-O-methoxyethyl)修飾、2′-氟代(2′-fluoro)修飾，而在這些修飾中提升與互補RNA親和性最佳的為LNA修飾，可使雙聯(lián)熔解溫度(Tm)上升2～8 ℃[28]。另一方面，通過對反義寡核苷酸骨架的硫代修飾和嗎啉代修飾，可以提高反義寡核苷酸抗性和體內(nèi)的輸送效率[28]。我們設(shè)計合成的miR-155種子序列的反義寡核苷酸進行了全硫代修飾，本文中缺少對miR-155沉默的直接實驗驗證，這是本文章的不足之處，將作為我們今后進一步研究的內(nèi)容。

目前，有關(guān)于miR-155的反義寡核苷酸經(jīng)過LNA修飾可以沉默miR-155的報道。他們選用miR-155的多個靶基因做成熒光報告基因，用來檢測miR-155是否被沉默。檢測的結(jié)果顯示，經(jīng)過LNA修飾的antimiR-155可以使miR-155的多個靶基因(SOCS1、SMAD5、CEBPβ、MAFB、SHANK2和SH3PXD2A)的表達量明顯增加[29]。由于全硫代修飾的t-antimiR-155的序列和t-LNA-155的序列相同，從理論上看，他們的生物學(xué)功能應(yīng)當(dāng)是相似的。

我們雖然沒有通過檢測miR-155的靶基因來獲得全硫代修飾的t-antimiR-155沉默miR-155的直接實驗證據(jù)，但在我們以前的研究中，將miR-21的靶基因程序性細胞死亡4(programmed cell death 4,PDCD4)做成熒光報告基因，轉(zhuǎn)染硫代修飾的anti-miR-21后，PDCD4的熒光活力明顯比SCR和空白組要高[30]。此結(jié)果可以證明經(jīng)過全硫代修飾的反義寡核苷酸同樣也可以使靶miRNA沉默。

本研究顯示miR-155在多發(fā)性骨髓瘤中具有重要的類似癌基因的作用，針對種子序列的t-antimiR-155顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤的進展，可用于腫瘤的實驗治療研究，有一定的藥物開發(fā)前景。

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