正交試驗優(yōu)化羊肌腱中Ⅰ型膠原蛋白提取工藝

王月宏+莎麗娜

摘?要：以羊肌腱為實驗材料，經(jīng)脫脂、脫鈣、除雜蛋白后，用鹽酸胍去除蛋白多糖，經(jīng)胃蛋白酶酶解、氯化鈉鹽析、透析后對其進(jìn)行提取工藝的研究與鑒定。結(jié)果表明，單因素試驗及正交試驗確定最佳工藝條件為酶解時間60?h、酶添加量4%、0.1mol/L檸檬酸溶液添加量5mL/g進(jìn)行羊肌腱提取。紫外光譜分析結(jié)果顯示：所提膠原最大吸收峰220?nm，證明提取物為膠原蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明：羊肌腱中存在的蛋白主要是Ⅰ型膠原蛋白。經(jīng)紅外光譜分析，進(jìn)一步證明提取的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白且結(jié)構(gòu)完整。

關(guān)鍵詞：Ⅰ型膠原蛋白；提取工藝；鑒定

Extraction of Type Ⅰ Collagen from Sheep Tendon

WANG Yue-hong, SHA Li-na*

(College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Abstract: Type Ⅰ collagen from sheep tendon was prepared by the following sequential steps: degreasing and decalcification of the starting raw material, removal of impurity proteins, removal of proteoglycans by extraction with guanidinium hydrochloride, pepsin-catalyzed hydrolysis, salting out with sodium chloride and dialysis. The optimal conditions for enzymatic hydrolysis were determined by single-factor experiments and orthogonal array design experiment as hydrolysis at an enzyme concentration of 4% for 60 h in 0.1 mol/L citric acid with a solvent to substrate ratio of 5:1 mL/g. UV spectral analysis of the resultant extract showed maximum absorption at approximately 220 nm, confirming it to be collagen. The protein composition of sheep tendon was dominated by type I collagen, as demonstrated by SDS-PAGE analysis. The extract was further confirmed by infrared spectral analysis to be type Ⅰ collagen with intact structure.

Key words: type Ⅰ collagen; extraction process; identification

中圖分類號：TS251 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）01-0008-04

膠原(collagen)是由動物細(xì)胞合成的一種生物高分子，具有保護(hù)機(jī)體功能的作用。動物的鍵、角、韌帶、骨、血管等，主要成分都是膠原，在生物體內(nèi)起著重要的作用。膠原蛋白資源豐富并含有豐富的氨基酸，口感柔和、易于消化，被用在許多保健性食品和營養(yǎng)性食品中[1-2]。膠原經(jīng)過適當(dāng)處理具有良好的生物降解性、生物可吸收性和生物相容性[3]，因此，可成為一種理想的生物新材料以期應(yīng)用于組織的修復(fù)和器官重建研究中。Ⅰ型膠原蛋白呈組織特異性分布，存在于多種結(jié)締組織中，屬于成纖維膠原[4]。目前，至少有19?種不同類型的膠原被發(fā)現(xiàn)通過單克隆抗體及基因工程技術(shù)已發(fā)現(xiàn)了，最常見的是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，其中Ⅰ型膠原占總膠原80%以上，含量最高[5]。目前，關(guān)于膠原蛋白提取工藝的研究報道很多[6-7]，為了提高原料利用，本實驗以羊肌腱為原料進(jìn)行膠原蛋白的提取，并研究不同酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時間以及檸檬酸添加量對羊肌腱中膠原蛋白得率的影響，為羊肌腱高效利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肌腱 市售。

胃蛋白酶（1∶10000）、標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原蛋白 美國Sigma公司；鹽酸胍 美國Amresco公司；MD34透析袋 (8000～14000ku) 北京Solarbio公司；氯仿、甲醇、檸檬酸、乙酸、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-25C壓蓋型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；IRAffinity-1型紅外光譜儀 日本島津公司；BG-Power600電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；H2500R-2高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肌腱預(yù)處理

將羊肌腱從羊蹄中取出，去除肌腱膜，在―20?℃冰箱冷凍過夜硬化后取出，再用手術(shù)刀仔細(xì)刮去肌腱表面的殘余筋膜，用生理鹽水沖洗幾遍后放入―20?℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.2 羊肌腱脫脂及除多糖

參照焦坤等[8]和李振飛等[9]的方法略做改動。將預(yù)處理好的羊肌腱從冰箱中取出，用手術(shù)刀切成2～3mm的碎片，然后稱質(zhì)量。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的NaCl溶液在常溫下攪拌48h，用蒸餾水充分洗滌后，按照1∶20（g/mL）的比例在羊肌腱中添加脫脂液（氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8（V/V）），

在4℃攪拌48h，用蒸餾水洗3～5遍。沖洗干凈后按照1∶10（g/mL）的比例在羊肌腱中添加4mol/L的鹽酸胍溶液，在4℃攪拌48h后，12000×g離心30min，沉淀用0.1mol/L檸檬酸充分洗滌3～5遍，得到脫脂及除多糖后羊肌腱，以此為試材進(jìn)行以下實驗。但添加胃蛋白酶及檸檬酸仍以未脫脂除糖羊肌腱計。

1.3.3 提取工藝單因素及正交試驗

在每克羊肌腱中分別加入一定量的胃蛋白酶和檸檬酸溶液，并酶解一定時間，采用單因素試驗結(jié)合正交試驗確定酶添加量、檸檬酸添加量、酶解時間對Ⅰ型膠原蛋白得率的影響。具體單因素試驗水平如下：胃蛋白酶添加量為2%、4%、6%、8%，0.1mol/L的檸檬酸添加量為5、10、15、20mL/g，酶解時間分別為36、48、60、72h。在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，確定最佳提取條件。每組試驗重復(fù)5次取平均值。

1.3.4 Ⅰ型膠原蛋白的鑒定

1.3.4.1 紫外吸收光譜的鑒定

將提取的羊肌腱膠原蛋白溶于0.5mol/L乙酸溶液中，乙酸溶解液作為空白對照，進(jìn)行紫外吸收光譜的測定在190～390?nm的波長范圍內(nèi)[10]。

1.3.4.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

濃縮膠3.5%（pH6.8），分離膠7.5%（pH8.8），電泳電壓100 V，直到分離膠下邊緣1?cm時停止電泳。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用蒸餾水漂洗1次，然后用脫色液脫色直到蛋白條帶清晰為止[11]。

1.3.4.3 傅里葉變換紅外圖譜

25?℃條件下研缽中放入少量膠原蛋白樣品，再加入適量KBr利用壓片機(jī)壓成薄片。紅外光譜對膠原蛋白KBr壓片進(jìn)行掃描，掃描范圍500～4000?cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗

2.1.1 酶添加量對膠原蛋白得率的影響

檸檬酸添加量10?mL/g，酶解時間48h。

圖 1 酶添加量對得率的影響

Fig.1 Effect of enzyme concentration on the yield of type Ⅰ collagen

由圖1可知，羊肌腱Ⅰ型膠原蛋白得率隨著酶添加量增加，先增大后減小，在4%時得率達(dá)到最大，為36.4%。當(dāng)酶的用量增加時促進(jìn)了膠原蛋白水解，得率下降。

2.1.2 檸檬酸添加量對膠原蛋白得率的影響

酶添加量2%，酶解時間48h。

圖 2 檸檬酸添加量對得率的影響

Fig.2 Effect of solvent to substrate ratio on the yield of type Ⅰ collagen

由圖2可知，羊肌腱Ⅰ型膠原蛋白得率隨著檸檬酸用量的增加而減小，檸檬酸添加量為5mL/g時得率最大，為29.6%，當(dāng)添加檸檬酸的量繼續(xù)增大時，首先導(dǎo)致酶與底物濃度變小，反應(yīng)不徹底；其次會使膠原蛋白水解，故檸檬酸添加量繼續(xù)增大，得率反而下降。但添加量小于5mL/g時，無法使羊肌腱溶解，所以本實驗從檸檬酸添加量5mL/g開始研究其對得率的影響。

2.1.3 酶解時間對膠原蛋白得率的影響

由圖3可知，羊肌腱Ⅰ型膠原蛋白得率隨著時間的增加而增大。在48?h之前增加的速率最大，48?h之后變慢。因為在48h基本反應(yīng)完全，48h后底物與酶的濃度很低，導(dǎo)致膠原蛋白得率漲幅很小。

酶添加量2%，檸檬酸添加量10mL/g。

圖 3 酶解時間對得率的影響

Fig.3 Effect of hydrolysis time on the yield of type I collagen

2.2 提取工藝正交試驗

表 1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

Table 1 Orthogonal array design and resulds

試驗號 A酶添加量/% B檸檬酸添加量/（mL/g） C酶解時間/h 膠原蛋白得率/%

1 2 5 48 29.6

2 2 10 60 28.3

3 2 15 72 20.2

4 4 5 60 39.5

5 4 10 72 36.8

6 4 15 48 21.3

7 6 5 72 25.5

8 6 10 48 23

9 6 15 60 17.4

K1 26.033 31.533 24.633

K2 32.533 29.367 28.400

K3 21.967 19.633 27.500

R 10.566 11.900 0.900

由表1可知，各因素主次順序為B＞A＞C，即各因素對膠原蛋白得率影響最大為檸檬酸添加量，其次是酶添加量，最后是酶解時間，故最優(yōu)組合為A2B1C2，即添加酶添加量4%、檸檬酸添加量5mL/g、酶解時間60h，在此優(yōu)化水平下進(jìn)行驗證實驗，膠原蛋白得率為39.5%。

2.3 羊肌腱膠原蛋白鑒定

2.3.1 紫外可見光光譜分析

圖 4 羊肌腱Ⅰ型膠原蛋白的紫外吸收光譜

Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of type Ⅰ collagen

from sheep tendon

由圖4可知，由于膠原蛋白只含有較少的色氨酸和酪氨酸，在280?nm處無明顯的吸收峰，在220?nm處有最大吸收峰且無雜峰，符合膠原蛋白的特性。因此，通過紫外圖譜可以初步判定有較高純度的膠原蛋白存在[12]。

2.3.2 電泳分析

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物；1.為實驗室自提Ⅰ型膠原蛋白。

圖 5 羊肌腱Ⅰ型膠原蛋白電泳圖

Fig.5 Electrophoretogram?of?type?Ⅰ?collagen?from sheep?tendon

由圖5可知，實驗室自提膠原蛋白符合Ⅰ型膠原蛋白的特征，具有明顯的α、β、γ結(jié)構(gòu)。高于200kD帶是Ⅰ型膠原的γ鏈，為α鏈三聚體；在200kD附近的帶是Ⅰ型膠原的β鏈，為α鏈二聚體，在116kD附近出現(xiàn)了Ⅰ型膠原的α1和α2鏈。提取的Ⅰ型膠原蛋白沒有多余條帶，說明提取的膠原蛋白保證了完整結(jié)構(gòu)，并未水解成小分子片段[13]，可以確定提取物為Ⅰ型膠原蛋白。

2.3.3 紅外光譜分析

圖 6 SigmaⅠ型膠原蛋白與羊肌腱提取的Ⅰ型膠原蛋白紅外圖譜

Fig.6 Infrared spectra of type?Ⅰ?collagen standard (Sigma) and type?Ⅰ?collagen?from sheep?tendon

由圖6可知，所提膠原蛋白與Ⅰ型膠原蛋白紅外圖譜基本一致。圖中3317?cm-1是酰胺A帶N—H伸縮振動（氫鍵）峰，表明存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。在1664?cm-1出現(xiàn)的強(qiáng)峰是酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮振動，也是α螺旋的COO-反對稱收縮振動峰，在1543?cm-1出現(xiàn)的峰是酰胺Ⅱ帶的N—H彎曲振動，在1454～1236?cm-1出現(xiàn)的吸收峰表明膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)完整[14-15]，在1080?cm-1附近為酰胺Ⅳ帶的N—H伸縮振動或是C—N伸縮振動。紅外特征圖譜進(jìn)一步表明，本實驗所提取的羊肌腱膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，且結(jié)構(gòu)完整。

3 討?論

羊肌腱中含有大量Ⅰ型膠原蛋白，是提?、裥湍z原蛋白的理想材料?，F(xiàn)有研究大多采用豬皮和魚皮為原料[16-17]。由于內(nèi)蒙古羊肉資源豐富，羊肌腱獲取容易且價格低廉，鑒于以上情況，實驗選用酸溶液-胃蛋白酶體系，在酸性條件下用胃蛋白酶處理，不僅保持了膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整性，而且可切斷膠原分子N及C端的非膠原性肽[18-20]，從而使更多不溶性膠原蛋白成為可溶性并保持膠原分子的完整性。這種做法克服了單一提取的缺陷，同時增加了提取效率。李衛(wèi)林等[21]指出膠原多肽的融化溫度在20～45?℃的范圍內(nèi)。本實驗改進(jìn)了刁雪洋[22]豬皮膠原蛋白提取方法，更嚴(yán)格的控制了提取條件，防止膠原分子在提取中變性。因此本實驗均在4?℃進(jìn)行。

4 結(jié)?論

單因素結(jié)合正交試驗優(yōu)化結(jié)果可知，最優(yōu)提取條件為胃蛋白酶添加量2%、檸檬酸添加量5mL/g、酶解時間60h，在此條件下從羊肌腱中提取的膠原蛋白得率為39.5%。

羊肌腱中提取物通過紫外光譜分析結(jié)果顯示按上述條件所提物質(zhì)為膠原蛋白。傅里葉紅外光譜和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步表明膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，結(jié)構(gòu)完整且純度較高，為動物性膠原蛋白提取提供理論依據(jù)。

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