手性化合物酶法制備中輔酶再生體系的構(gòu)建與應(yīng)用進展

彭益強，張曙偉

（華僑大學工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學校重點實驗室，福建 廈門 361021）

手性化合物是有機合成中不可缺少的重要添加劑，也是制備具有光學活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體，在生理生化、化學合成中具有重要意義。如手性醇是一類重要的手性模塊化合物，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、材料、有機中間體以及環(huán)保等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用價值[1-5]。

近年來，生物法合成手性化合物已成為制備手性中間體的研究熱點，如許多手性醇可以通過氧化還原酶催化潛手性酮的立體選擇性還原得到[6-10]。但是，利用酶催化不對稱還原反應(yīng)的一個瓶頸是需要解決反應(yīng)體系中輔酶供應(yīng)問題[11-12]。氧化還原酶的輔酶大多為煙酰胺類，主要是 NAD+/NADH 和NADP+/NADPH。在工業(yè)生物催化應(yīng)用中，通常需要人為添加外源性輔酶以實現(xiàn)氧化還原酶的連續(xù)多批次催化，而煙酰胺類輔酶價格昂貴、穩(wěn)定性差、難以重復利用，導致反應(yīng)成本高昂。

為了解決手性化合物酶法還原制備反應(yīng)中輔酶需求問題，學者們提出了各種輔酶再生的方法，如酶法再生、電化學法再生和光化學法再生等[13-15]，其中具有較大工業(yè)應(yīng)用潛力的是酶法再生，而酶法再生又可根據(jù)輔酶再生體系形成的環(huán)境分為胞內(nèi)酶催化再生與胞外酶催化再生。本文主要介紹酶法再生中輔酶再生體系構(gòu)建方式進展與應(yīng)用實例，評價各種輔酶再生體系在工業(yè)應(yīng)用中的特點，提出輔酶再生體系應(yīng)用中可能遇到的問題與解決方法，希冀對手性化合物的酶法催化制備提供良好的解決方案。

1 單細胞內(nèi)輔酶再生系統(tǒng)

生物細胞是酶制備與酶催化的最基本體系，細胞體內(nèi)的酶代謝反應(yīng)存在著一定協(xié)同性與可塑性，因此可在細胞內(nèi)利用天然或改造的代謝途徑中的相關(guān)酶實現(xiàn)輔酶在細胞體內(nèi)的自我再生。

1.1 利用內(nèi)源性輔酶再生系統(tǒng)

在細胞的生長代謝中，為了維持還原代謝途徑的還原力的供給，有些細胞本身存在提供還原力的耦合代謝途徑，從而在持續(xù)轉(zhuǎn)化還原酮底物過程中，可從細胞內(nèi)另一氧化途徑中連續(xù)獲得還原力質(zhì)子，從而保證了手性化合物的連續(xù)發(fā)酵制備。

如 Dirk Weuster-Botz[16]利用藍細菌聚球藻（SynechococcusPCC7942）中的脫氫氧化酶還原五氟苯乙酮（2'-3'-4'-5'-6'-pentafluoroacetophenone，PFAP）制備S型的五氟苯乙醇[pentafluoro (phenly-)ethanol，S-PFE]，在無光條件下藍細菌聚球藻可利用胞內(nèi)的葡萄糖氧化脫氫反應(yīng)途徑為S-PFE的制備反應(yīng)提供還原力質(zhì)子，而同時利用胞內(nèi)的葡萄糖代謝途徑很容易實現(xiàn)NADPH的再生，只需外加葡萄糖和ATP，克服了光照條件的限制，可以持續(xù)獲得ee值>99%的立體化合物。又如Gao等[17]應(yīng)用氧化葡萄酸桿菌（Gluconobacter oxydans）經(jīng)兩步（先脫氫成醛再加羥基成羧酸）轉(zhuǎn)化DL型丙二醇（DL-1,2-propanediol）制備 D 型 2-羥基丙酸（2-hydroxypropanic acid），同時利用頻哪酮（3,3-二甲基-2-丁酮）的還原反應(yīng)實現(xiàn)輔酶NAD(P)+的再生（圖 1）。游離細胞通過離心可反復發(fā)酵利用，轉(zhuǎn)化24h后反應(yīng)達到平衡，D型2-羥基丙酸的獲得率提高了36%，ee值達99%。

圖1 葡萄桿菌（Gluconobacter oxydans）中利用胞內(nèi)酶催化實現(xiàn)輔酶NAD（P）+再生

利用細胞自身代謝反應(yīng)實現(xiàn)酶催化的耦合進行輔酶再生，這種方法簡便易行，操作簡單且可以實現(xiàn)多批次發(fā)酵轉(zhuǎn)化反應(yīng)。存在的問題是菌株的選擇面較窄，雖然大多數(shù)菌株存有輔酶代謝的反應(yīng)路徑，但其本身不一定是為了滿足人為設(shè)置的催化途徑所需的氧化還原力要求。另外，這種利用細胞內(nèi)部代謝路徑進行催化反應(yīng)與輔酶再生的方法，由于細胞中存在其他眾多代謝途徑，因此往往代謝副產(chǎn)物較多，目的產(chǎn)物的手性純度不高。

1.2 利用代謝工程技術(shù)

微生物細胞中輔酶的生成與降解是處于一個動態(tài)的平衡過程，因此可以對微生物細胞內(nèi)本身存在的 NAD(P)合成途徑和補救途徑加以改造，通過直接調(diào)控內(nèi)源性輔酶量的方法來解決手性化合物制備過程中輔酶供應(yīng)問題[13]。如Liang等[18]在野生型的大腸桿菌（E.coliW1485）中過量表達尼克酸磷酸核糖酰基轉(zhuǎn)移酶（nicotinic acid phosphoribosyltransferase，NAPRTase）構(gòu)建代謝工程菌E.coliNZN111，可調(diào)控 NADH池的大小與NADH/NAD+的比例從而提高代謝終產(chǎn)物琥珀酸的產(chǎn)量，該課題組同時也在E.coli中的NADH合成路徑中過量表達尼克酸磷酸核糖?；D(zhuǎn)移酶（NAPRTase）同時敲除ldhA和pflB基因片段，也可降低了 NAD(H)池中 NADH/NAD+的比例，一樣提高了還原代謝途徑終端代謝產(chǎn)物琥珀酸的產(chǎn)量[19]。

上述方法是直接調(diào)控輔酶的量，有時針對性并不是很強。Schroer等[20]通過在巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）的甲醇代謝途徑中過量表達甲醛脫氫酶（Formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)LD），既抑制了甲醛向二羥基丙酮方向代謝又克服了整個代謝途徑中輔酶再生的瓶頸，加速了NADH的再生速度，而此代謝途徑與3-羥基丁醇（acetoin）加氫還原生成2,3-丁二醇（2,3-butanediol）的反應(yīng)相耦合，為 2,3-丁二醇的生產(chǎn)制備提供了充足的還原力（圖2）。

圖2 巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）中通過代謝調(diào)控加速輔酶NAD+再生

1.3 利用基因工程技術(shù)

利用基因重組技術(shù)直接在宿主細胞中表達主催化酶與輔酶再生酶，從而構(gòu)建同時具有催化轉(zhuǎn)化功能與輔酶再生能力的工程細胞。這種方法針對性極強，融合了理論設(shè)計的酶耦合催化優(yōu)勢和細胞發(fā)酵催化轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢，使微生物的改造從隨機突變發(fā)展到定向設(shè)計階段。實踐當中也有許多構(gòu)建成功的例子[21-24]。但重組菌要應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)還存在著諸如底物濃度較低（底物在菌液中溶解度有限，高濃度底物對重組菌的毒性）、輔助底物及昂貴誘導物IPTG的添加問題等幾個困難[25]。

為了克服有機底物在水相中溶解度較低問題，可以將能有效溶解有機底物的較溫和的溶劑，如水溶性離子液體與細胞所處的水相反應(yīng)體系相結(jié)合構(gòu)建雙相反應(yīng)體系。這種方法既保證了細胞催化酶的活性同時又加大了底物的溶解度，提高了基因工程細胞的轉(zhuǎn)化能效果。Bratigama 等[26]從12種離子液體中經(jīng)篩選得到最適合底物溶解的離子液體[HMPL][NTF]，同時將共表達來源于短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，LB-ADH）和源于博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）的甲酸脫氫酶（formate dehydrogenas，CB-FDH）的基因工程菌[E.coliBL21（DE3）]在水相中進行催化轉(zhuǎn)化各輔酶再生，催化辛酮合成辛醇，既可以克服底物辛酮低溶解度問題，又可以利用不同相的差別構(gòu)建了底物儲存和產(chǎn)物原位提取的集成過程（圖 3）。在進行了一個批次的轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，菌株轉(zhuǎn)化的空時收率達 180g/(L·d)，化學收率為95%，ee值達99.7%。

圖3 構(gòu)建有輔酶再生體系的基因工程菌E.coli 在離子液體-緩沖液雙相體系中的催化

另外，為了解決高濃度底物的問題，也可以在生產(chǎn)工藝過程中采取底物批次添加策略。Ni等[27]在E.coli中共表達源于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）的羰基還原酶（carbonyl reductase，CR）和葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase，GDH），構(gòu)建了雙酶共表達體系，應(yīng)用此工程菌轉(zhuǎn)化底物乙烷-4-氯-3-氧橋丁酸（ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate）制備乙烷-(R)-4-氯-3-羥基丁酸[ethyl-(R)-4-chloro-3-hydroxy butanoate]，底物采取批式流加方式，最終底物量達到 215g/L（1.3mol/L），轉(zhuǎn)化一批次后產(chǎn)物的產(chǎn)率達91.7%，ee值達99.6%。

2 雙細胞耦合的輔酶再生系統(tǒng)

圖4 滲透性細胞耦合構(gòu)建輔酶再生體系

上述的單細胞轉(zhuǎn)化制備手性化合物技術(shù)特點是利用細胞固有或人為設(shè)計的方式將酶催化轉(zhuǎn)化與輔酶再生酶的催化反應(yīng)集成在同一細胞內(nèi)進行，也有學者通過對含有相關(guān)耦合酶的細胞進行處理，在不將酶提取出胞外的情況下，直接耦合這兩種細胞進行催化轉(zhuǎn)化與輔酶再生反應(yīng)，即通過再生輔酶在雙細胞間來回滲入進出來構(gòu)建雙細胞胞內(nèi)酶耦合催化體系[28-29]。如Zhang等[30]將兩種滲透性細胞A和細胞B耦合，實現(xiàn)NAD(P)H的再生與持續(xù)利用（圖4）。其基本過程是將表達NADPH依賴型的酮基還原酶（keto reductase，KR）的短小芽胞桿菌（Bacillus pumilusPhe-C3）與表達葡萄糖脫氫酶（GDH）的枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilisBGSC 1A1）進行透性化處理后將兩細胞耦合培養(yǎng)同時胞外添加一定量的輔酶轉(zhuǎn)化乙烷-3-酮基-4,4,4-三氟醚丁酸（ethyl 3-keto-4,4,4-trifluorobutyrate）生成相應(yīng)的R型醇鹽。在幾批次的轉(zhuǎn)化中均表現(xiàn)出了較好的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，最終輔酶總轉(zhuǎn)化數(shù)（total turn number，TTN）達1620，產(chǎn)物收率與ee值均要優(yōu)于相應(yīng)的全細胞催化結(jié)果。這種細胞共培養(yǎng)進行轉(zhuǎn)化的方法較簡單，耦合條件優(yōu)化好后也有利于工業(yè)化的應(yīng)用。

?ali? 等[31]在微反應(yīng)器中固定化滲透化酵母細胞，利用酵母細胞中的 NADH依賴型醇脫氫酶（ADH）還原醛反應(yīng)實現(xiàn)外源添加的輔酶NAD+的再生與持續(xù)供給。這是利用滲透化細胞構(gòu)建普適性的輔酶再生系統(tǒng)，可以與相當多的輔酶依賴型催化酶的催化反應(yīng)相耦合，應(yīng)用于諸如手性化合物的酶催化制備中。在隨后的6天測試中，滲透性細胞中的輔酶再生體系表現(xiàn)出了較好的催化穩(wěn)定性。實驗結(jié)果證明滲透性細胞在給酶催化提供穩(wěn)定與可反復多批次利用的氧化還原力方面具有良好的應(yīng)用可行性。

3 胞外酶耦合輔酶再生系統(tǒng)

胞外酶經(jīng)提取從細胞內(nèi)分離出來后再進行催化轉(zhuǎn)化制備手性化合物，同時從另一培養(yǎng)的細胞中提取分離專一性較強的輔酶再生酶與之相耦合在胞外實現(xiàn)催化反應(yīng)的連續(xù)進行。這種胞外酶直接耦合方法具有專一、無副產(chǎn)物、合成效率高、產(chǎn)物純度高等特點。

3.1 胞外純酶耦合

大部分的胞外酶一般需經(jīng)純化后再進行耦合催化生產(chǎn)，這種體系的優(yōu)勢是反應(yīng)專一性強、反應(yīng)機理清楚。根據(jù)輔酶再生酶的催化情況分為底物耦合法（一種酶催化兩種底物）和雙酶耦合法（兩種酶分別催化兩種底物）[12]。輔酶胞外酶法再生己有許多實驗室規(guī)模應(yīng)用的實際例子[32-35]。在工業(yè)應(yīng)用中的一個瓶頸是由于輔酶的小分子特性，輔酶極易從酶耦合體系中泄露出去，因此胞外酶耦合再生方法需解決再生輔酶的留存與反復多批次利用問題。

Rocha-Martín等[36]應(yīng)用共價固定法將源于極端嗜熱菌（Thermus thermophilus）的NAD+專一性再生酶NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）通過其N末端共價固定于帶有CNBr的瓊脂糖上與同樣源于Thermus thermophilus的次級醇脫氫酶（TtADH）相耦合，在固相介質(zhì)上進行動力學拆分rac-1-苯基乙醇（rac-1-phenylethanol）的反應(yīng)，共價固定化的NOX持續(xù)氧化拆分反應(yīng)生成的NADH使之不斷再生成氧化型輔酶 NAD+，持續(xù)為拆分反應(yīng)提供所需的還原力。這個過程與 NOX的非共價結(jié)合相比較能夠?qū)崿F(xiàn)反應(yīng)的多批次進行。

除了將液相中的催化改變?yōu)楣滔啻呋瘉斫鉀Q再生輔酶反復多批次利用外，Li 等[37]通過將小分子輔酶與納米粒子相連接的方法增大輔酶的質(zhì)量與體積，也可實現(xiàn)雙酶耦合催化中再生輔酶反復多批次利用。通過對硅納米顆粒進行活化帶上活性羰基基團制備了納米顆粒固定化的輔酶 NAD+并將其應(yīng)用于酮基還原酶/甲酸脫氫酶耦合反應(yīng)中轉(zhuǎn)化丙酮酸生成相應(yīng)的L型乳酸（圖5）。由于輔酶與納米顆粒固定化相連，除了輔酶具備了納米顆粒運動特性可加速反應(yīng)進行外，再生輔酶也可很容易通過離心或過濾等方法回收進行下一批次的利用。實驗結(jié)果測定納米顆粒輔酶載量是73mg/g，耦合體系反應(yīng)6批次后催化活性還能保留60%。

3.2 無細胞抽提液中內(nèi)源性輔酶再生系統(tǒng)的利用

圖5 納米顆粒固定化輔酶耦合催化體系

上述胞外酶催化輔酶再生法的設(shè)計具有很強的針對性，可以利用專一性的輔酶再生酶進行輔酶的再生反應(yīng)，如氧化型輔酶 NAD(P)+專一性再生酶NAD(P)H氧化酶[38-40]，還原型輔酶NAD(P)H專一性再生酶甲酸脫氫酶等[41-43]。但這種酶法再生輔酶在耦合反應(yīng)過程及工業(yè)化應(yīng)用過程中卻可能存在著輔酶再生酶與主反應(yīng)催化酶酶學反應(yīng)特性不相適應(yīng)等問題，大大降低了耦合反應(yīng)效率。另外，上述胞外酶耦合催化反應(yīng)一般是用電泳級純化酶進行構(gòu)建，在工業(yè)應(yīng)用過程中無疑增加了成本，而且據(jù)有些學者研究，純化后的酶耦合催化效率反而會出現(xiàn)降低的現(xiàn)象[44]。

Yan等[45]利用表達羰基還原酶的重組E.coli的無細胞抽提液轉(zhuǎn)化多種酮基化合物，在此無細胞抽提液加入葡萄糖后發(fā)現(xiàn)此體系出現(xiàn)了輔酶 NADPH再生的現(xiàn)象，經(jīng)分析是無細胞抽提液中含有E.coli細胞內(nèi)源性表達的NADPH再生系統(tǒng)。這個結(jié)果揭示了容易被大多數(shù)學者所忽略的無細胞抽提液中本身存在的細胞內(nèi)源性輔酶再生酶的應(yīng)用價值。進一步研究發(fā)現(xiàn)此無細胞抽提液中還含有不止一種輔酶再生系統(tǒng)，加入海藻糖、果糖、乳糖和芽糖等均有輔酶再生現(xiàn)象，其中加入葡萄糖和海藻糖的耦合催化效率最高。這種利用細胞內(nèi)源性輔酶再生系統(tǒng)進行輔酶再生實現(xiàn)手性化合物連續(xù)轉(zhuǎn)化的方法有時可獲得比全細胞催化更高效的反應(yīng)催化效率，而且與游離純化酶耦合體系相比較也具有方法簡便、不需外加輔酶再生酶等優(yōu)勢。Yang等[46]在利用薔薇色酵母（Rhodotorulasp.AS2.2241）轉(zhuǎn)化乙酰吡啶和芳香族酮化合物合成相應(yīng)手性醇化合物過程中也是利用了細胞內(nèi)源性耦合酶催化系統(tǒng)在胞外實現(xiàn)了手性化合物的生成與輔酶 NADPH的再生，TTN值達4220，手性醇化合物純度達96%～99%。

4 總結(jié)與展望

生物酶催化法制備手性化合物（手性醇或手性胺等）較化學法等具有專一性強，反應(yīng)效率高，過程簡單與環(huán)保等突出特點，但大多數(shù)需要昂貴的、穩(wěn)定性差的煙酰胺類小分子輔酶起到傳遞電子和質(zhì)子等作用，因此小分子輔酶在酶催化反應(yīng)中的穩(wěn)定持續(xù)供給反應(yīng)所需的氧化還原力是手性化合物工業(yè)化生產(chǎn)需要重點解決的問題。

上述的輔酶再生工程中采取了代謝調(diào)控、基因工程設(shè)計或純酶、無細胞抽提液耦合等方法，以不同的形式解決輔酶的供應(yīng)問題。這類方法的核心是輔酶本身的存在與再生。若能采取更直接的方式，如篩選或設(shè)計能直接利用水分子或氫氣做為電子供體的氧化還原酶，將有可能根本上解決輔酶問題[13]。在目前的條件下，則需更加注重輔酶供給體系的構(gòu)建，其中關(guān)鍵點是再生輔酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定留存問題，尤其是胞外酶耦合催化方法，應(yīng)采取合適的工藝過程提高再生輔酶的反復與多批次利用的能力，這對輔酶依賴型酶催化的最終反應(yīng)效率具有重要影響，由此才可真正實現(xiàn)包括手性化合物在內(nèi)的大批重要化學品的綠色工業(yè)化生產(chǎn)過程。

[1]Liu J Y，Lin Y P，Qiu H，et al.Substituted phenyl groups improve the pharmacokinetic profile and anti-inflammatory effect of urea-based soluble epoxide hydrolase inhibitors in murine models[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences， 2013，48（4-5）：619-627.

[2]Cauda V，Schlossbauer A，Bein T.Bio-degradation study of colloidal mesoporous silica nanoparticles：Effect of surface functionalization with organo-silanes and poly(ethylene glycol)[J].Microporous and Mesoporous Materials，2010，132（9）：60-71.

[3]聶堯，徐巖，王海燕，等.重組大腸桿菌不對稱還原 2-羥基苯乙酮合成（R）-苯基乙二醇[J].化工進展，2006，25（10）：1231-1236.

[4]Patel R N.Microbial-enzymatic synthesis of chiral intermediates for pharmaceuticals[J].Enzyme and Microbial Technology，2002，31：804-826.

[5]Chena B，Dingerdissenb U，Krauterc J G E，et al.New developments in hydrogenation catalysis particularly in synthesis of fine and intermediate chemicals[J].Applied Catalysis A：General，2005，280（1）：17-46.

[6]Liu X，Wang Y，Gao H Y，et al.Asymmetric reduction ofα-hydroxy aromatic ketones to chiral aryl vicinal diols using carrot enzymes system[J].Chinese Chemical Letters，2012，23：635-638.

[7]Wang L J，Li C X，Ni Y，et al.Highly efficient synthesis of chiral alcohols with a novel NADH-dependent reductase fromStreptomyces coelicolor[J].Bioresource Technology，2011，102（4）：7023-7028.

[8]Alanvert E，Doherty C，Moody T S，et al.Highly stereoselective biocatalytic reduction of alpha-halo ketones[J].Tetrahedron：Asymmetry，2009，20（9）：2462-2466.

[9]Ye Q，Yan M，Xu L，et al.A novel carbonyl reductase fromPichia stipitisfor the production of ethyl(S)-4-chloro- 3-hydroxybutanoate[J].Biotechnol.Lett.，2009，31（1）：537-542.

[10]羊明，徐巖，穆曉清，等.一種新的高立體選擇性羰基還原酶的性質(zhì)及分離[J].化工進展，2006，25（9）：1082-1088.

[11]Zhao H M，van der Donk W A.Regeneration of cofactors for use in biocatalysis[J].Current Opinion in Biotechnology，2003，14：583-589

[12]張翀，邢新會.輔酶再生體系的研究進展[J].生物工程學報，2004，20（6）：811-816.

[13]江金鵬，吳旭日，陳依軍.解決氧化還原酶反應(yīng)體系中輔酶問題的策略及其應(yīng)用[J].生物工程學報，2012，28（4）：410-419.

[14]Liu W F，Wang P.Cofactor regeneration for sustainable enzymatic biosynthesis[J].Biotechnology Advances，2007，25：369-384.

[15]van der Donk W A，Zhao H M.Recent developments in pyridine nucleotide regeneration[J].Current Opinion in Biotechnology，2003，14：421-426.

[16]Dirk Weuster-Botz H J.Cofactor regeneration in phototrophic cyanobacteria applied for asymmetric reduction of ketones[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.，2007，75（5）：1031-1037.

[17]Gao K，Song Q X，Wei D Z.Coupling of enantioselective biooxidation of dl-1,2-propanediol and bioreduction of pinacoloneviaregeneration cycle of coenzyme[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.，2006，71：819-823.

[18]Liang Liya，Liu Rongming，Chen Xu，et al.Effects of over expression of NAPRTase，NAMNAT，and NAD synthetase in the NAD(H)biosynthetic pathways on the NAD（H）pool，NADH/NAD+ratio and succinic acid production with different carbon sources by metabolically engineeredEscherichiacoli[J].Biochemical Engineering Journal，2013，81：90-96.

[19]Liang Liya，Liu Rongming，Wang Guangming，et al.Regulation of NAD（H）pool and NADH/NAD+ratio by over expression of nicotinic acid phosphoribosyltransferase for succinic acid production inEscherichia coliNZN111[J].Enzyme and Microbial Technology，2012，51：286- 293.

[20]Schroer K，Luef K P，Hartner F S，et al.Engineering thePichia pastorismethanol oxidation pathway for improved NADH regeneration during whole-cell biotransformation[J].Metabolic Engineering，2010，12：8-17.

[21]Amidjojo M，Weuster-Botz D.Asymmetric synthesis of the chiral synthon ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate usingLactobacillus kefir[J].Tetrahedron：Asymmetry，2005，16：899-901.

[22]Ye Q，Cao H，Yan M，et al.Construction and co-expression of a polycistronic plasmid encoding carbonyl reductase and glucose dehydrogenase for production of ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate[J].Bioresource Technology，2010，101：6761-6767.

[23]Jung J，Park S，Kim H K.Synthesis of a chiral alcohol using a rationally designedSaccharomyces cerevisiaereductase and a NADH cofactor regeneration system[J].Journal of Molecular CatalysisB：Enzymatic，2012，84：15-21.

[24]Sun J A，Zhang L Y，Rao B，et al.Enhanced acetoin production bySerratia marcescensH32 with expression of a water-forming NADH oxidase[J].Bioresource Technology，2012，119：94-98.

[25]王普，祖蕾，何軍邀，等.基因工程菌在不對稱還原制備手性醇中的應(yīng)用進展[J].化工進展，2008，27（7）：977-982.

[26]Bratigama S，Dennewalda D，Schürmann M，et al.Whole-cell biocatalysis：Evaluation of new hydrophobic ionic liquids for efficient asymmetric reduction of prochiral ketones[J].Enzyme and Microbial Technology，2009，45：310-316.

[27]Ni Y，Li C X，Wang L J.Highly stereoselective reduction of prochiral ketones by a bacterial reductase coupled with cofactor regeneration[J].Org.Biomol.Chem.，2011，9：5463-5468.

[28]Jin J Z，Li H，Zhang J.Improved synthesis of (S)-1-phenyl-2-propanol in high concentration with coupled whole cells ofRhodococcus erythropolisandBacillus subtilison preparative scale[J].Appl.Biochem.Biotechnol.，2010，162：2075-2086.

[29]Rundb?ck F，F(xiàn)idanoska M，Adlercreutz P.Coupling of permeabilized cells ofGluconobacter oxydansandRalstonia eutrophafor asymmetric ketone reduction using H2as reductant[J].Journal of Biotechnology，2012，157：154-158.

[30]Zhang J，Witholt B，Li Z.Coupling of permeabilized microorganisms for efficient enantioselective reduction of ketone with cofactor recycling[J].Chem.Commun.，2006（4）：398-400.

[31]?ali? A，F(xiàn)aletar P，Zeli? B.NAD+regeneration in a microreactor using permeabilized baker’s yeast cells[J].Biochemical Engineering Journal，2013，77：88- 96.

[32]曹政，王亞軍，肖黎，等.羰基還原酶不對稱還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[J].生物加工過程，2013，11（1）：17-22.

[33]Iqbal N，Rudroff F，Brig? A.Asymmetric bioreduction of activated carbon-carbon double bonds using Shewanella yellow enzyme（SYE-4）as novel enoate reductase[J].Tetrahedron，2013，68：7619-7623.

[34]Ni Y，Xu J H.Biocatalytic ketone reduction：A green and efficient access to enantiopure alcohols[J].Biotechnology Advances，2012，30：1279-1288.

[35]Stuermer R，Hauer B，Hall M，et al.Asymmetric bioreduction of activated C=C bonds using enoate reductases from the old yellow enzyme family[J].Current Opinion in Chemical Biology，2007，11：203-213

[36]Rocha-Martín J，Vega D，Bolivar J M，et al.New biotechnological perspectives of a NADH oxidase variant fromThermus thermophilusHB27 as NAD+recycling enzyme[J].BMC Biotechnology，2011，11：101-121.

[37]Li Y H，Liang H，Sun L W.et al.Nanoparticle-tethered NAD+with in situ cofactor regeneration[J].Biotechnol.Lett.，2013，35：915-919.

[38]Odman P，Wellbornb W B，Bommarius A S.An enzymatic process to α-ketoglutarate from L-glutamate-the coupled system L-glutamate dehydrogenase-NADH oxidase[J].Tetrahedron：Asymmetry，2004，15：2933-2937.

[39]Talwalkar A，Kailasapathy K，Hourigan J，et al.An improved method for the determination of NADH oxidase in the presence of NADH peroxidase in lactic acid bacteria[J].Journal of Microbiological Methods，2003，52：333- 339.

[40]Findrik Z，Simunovic I，Vasi?-Ra?ki D.Coenzyme regeneration catalyzed by NADH oxidase fromLactobacillus brevisin the reaction of L-amino acid oxidation[J].Biochemical Engineering Journal，2008，39：319-327.

[41]Labrou N E.Improved purification ofCandida boidiniiformate dehydrogenase[J].Bioseparation，2000，9：99-104.

[42]Bai Y L，Yang S T.Production and separation of formate dehydrogenase fromCandida boidinii[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，40：940-946.

[43]Bekhouche M，Doumèche B，Blum L J.Chemical modifications by ionic liquid-inspired cations improve the activity and the stability of formate dehydrogenase in[MMIm][Me2PO4][J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2010，65：73-78.

[44]Geueke B，Riebel B，Hummel W.NADH oxidase fromLactobacillus brevis- a new catalyst for the regeneration of NAD[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，32：205-211.

[45]Yan Z，Nie Y，Xu，et al.Biocatalytic reduction of prochiral aromatic ketones to optically pure alcohols by a coupled enzyme system for cofactor regeneration[J].Tetrahedron Letters，2011，52：999-1002.

[46]Yang W，Xua J H，Pan J，et al.Efficient reduction of aromatic ketones with NADPH regeneration by using crude enzyme from Rhodotorula cells and mannitol as cosubstrate[J].Biochemical Engineering Journal，2008，42（1）：1-5.