黑木耳栽培過程中抗霉能力及胞外酶活性變化

李紅+楊鎮(zhèn)+呂立濤+劉巖巖+張敏

摘要：以5個黑木耳（Auricularia auricula）栽培菌株（8808、黑29、981、黑威2號、黑威4號）為試驗材料，研究黑木耳栽培過程中4種胞外酶活性[羧甲基纖維素酶（CMCase）、濾紙纖維素酶（FPase）、漆酶（LAC）、多酚氧化酶（POD）]的變化及酶活性與產量、抗霉能力之間的相關性。結果表明，菌株產量大小排序為黑威2號>黑威4號>981>8808>黑29，黑威2號顯著高于其他菌株，黑威4號和981菌株差異不顯著，8808和黑29菌株產量最低；各菌株抗霉能力有明顯差別，黑威2號、黑威4號、981菌株抗霉能力較差，8808和黑29菌株抗霉能力較強。不同菌株胞外酶活性不同，但在整個生長發(fā)育過程中變化規(guī)律基本一致，即隨著黑木耳子實體的生長發(fā)育，CMCase、FPase、LAC、POD活性逐漸增強，而后維持在相對穩(wěn)定的水平。8808、黑29菌株CMCase、FPase、POD酶活性相對較低，981、黑威2號、黑威4號菌株酶活性較高。相關性分析表明，不同胞外酶活性之間具有顯著或極顯著相關性，不同的胞外酶活性又與抗霉能力、產量有一定的相關性，從而為黑木耳抗病育種、黑木耳生產提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：黑木耳栽培；抗霉能力；胞外酶；酶活性；產量；抗霉能力

中圖分類號： S646.601文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0109-04

黑木耳（Auricularia auricula）是中國廣泛人工栽培的食用菌品種，其栽培業(yè)已成為廣大菇農走上致富道路的支柱產業(yè)之一[1]。黑木耳食味鮮美，含有豐富的營養(yǎng)成分，具有很高的食、藥用價值[2-3]。近年來，隨著人們生活水平的提高，對木耳的消費需求激增，木耳總產量也隨之快速增長。但大量菌種品種退化、老化、不利變異，致使栽培性狀難以預測，造成栽培特性、栽培產量的不確定性[1]。有研究報道，側耳（Pleurotus）、金針菇（Flammulina velutipes）菌絲羧甲基纖維素酶活性與子實體產量成正相關關系，以木屑為主料栽培的黑木耳在子實體形成期間胞外纖維素酶活性逐漸上升[4]。黑木耳的纖維素酶、半纖維素酶活性與栽培基質的降解速率、子實體的產量有關，表明食用菌胞外酶活性變化在栽培過程中存在一定的規(guī)律[5-7]。從目前的研究成果來看，相關食用菌胞外酶活性研究報道較多，而如何通過菌種檢測，鑒定菌種活性、健康程度，預測栽培特性、栽培產量的研究較少[5-7]。黑木耳菌種培養(yǎng)過程中通過酶活性測定研究菌種生長中的酶活性變化規(guī)律，檢測菌種分解纖維素、木質素等的能力，可在一定程度上檢測菌種老化、退化、不利變異，杜絕劣質菌種危害菇農，為黑木耳栽培生產提供科學、系統(tǒng)的理論依據(jù)，因此研究黑木耳胞外酶在栽培過程中的活性變化規(guī)律對菌種優(yōu)劣顯得十分重要[5-6，8]。一方面通過各菌株培養(yǎng)時間與酶活性變化關系的研究，探討菌株菌絲生長過程中酶活變化的規(guī)律性；另一方面通過纖維素、木質素分解酶類的測定，可檢測菌株分解基質能力強弱變化，檢測菌株因在非纖維基質中長期生長、保藏、傳代引起酶活性退化問題，檢測因大量引種、擴繁引起的菌株老化、退化、不利變異的發(fā)生以及病毒感染引起菌株退化問題，防止劣質菌種流入市場[2-3]。有鑒于此，本試驗選擇栽培性狀差異較大的5個黑木耳優(yōu)良菌株，研究栽培過程中菌株胞外漆酶（LAC）、多酚氧化酶（POD）、羧甲基纖維素酶（CMCase）、濾紙纖維素酶（FPase）的酶活性變化，為我國黑木耳栽培用種活力檢測、菌種退化及黑木耳栽培工作提供科學系統(tǒng)的理論參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

黑木耳1～5號菌株分別為8808、黑29、981、黑威2號、黑威4號，均由遼寧省農業(yè)科學院微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.2培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基（L）：馬鈴薯200.0 g煮汁，葡萄糖20.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，蛋白胨0.5 g，維生素B1 10.0 mg，瓊脂粉14.0 g。

1.3試驗方法

原種瓶（500 mL葡萄糖空瓶）裝培養(yǎng)料折合干料約140 g（濕質量400 g），栽培袋裝培養(yǎng)料折合干料約280 g（濕質量800 g），121 ℃滅菌2 h，取母種培養(yǎng)基活化菌種3塊（3.0 mm×3.0 mm）接于原種培養(yǎng)料中，25 ℃培養(yǎng)30 d，菌絲發(fā)滿后以2%的接種量接入栽培種培養(yǎng)料中，25 ℃培養(yǎng)70 d，每個菌株各接種100袋。分別在菌絲生長10、20、30、40、50、60、70 d 時取樣，每個菌株每個時期取樣3袋，分別壓碎混勻，用于粗酶液制備。

1.5粗酶液制備

250 mL三角瓶中裝入打碎混勻樣品5.0 g，加蒸餾水 25 mL，25 ℃下150 r/min浸提4 h，4 ℃離心10 min（2 500 r/min），上清為粗酶液，4 ℃冰箱短期保存，酶活性測定設1個空白對照、3個重復。

均勻取培養(yǎng)一定時間的酶樣培養(yǎng)基5.0 g，加入蒸餾水25 mL，25 ℃下恒溫搖床以150 r/min浸提4 h，5 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，取上清液為待測酶樣。

觀察發(fā)霉洞穴數(shù)。

1.6酶活測定[7]

1.6.1LAC活性測定

取13.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺（用95%乙醇溶解）0.5 mL作為底物，加入0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH值為4.6）3.4 mL、0.5 mL酶液，28 ℃下反應30 min，于600 nm處測吸光度。另取同量酶液，沸水浴5 min滅活后作為對照。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物與底物作用3 min內改變0.1個吸光度為1個酶活性單位（U）。

1.6.2POD活性測定

取0.1 mol/L鄰苯二酚2.0 mL，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH值為6.0）2.0 mL、0.5 mL酶液，28 ℃下反應 30 min，于400 nm處測吸光度。另取等量酶液，沸水浴5 min滅活后作為對照。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物與底物作用30 min內改變0.1個吸光度為1個酶活性單位（U）。

16.3CMCase活性測定

在試管中加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液1.5 mL，加粗酶液1.0 mL，50 ℃ 水浴保溫30 min，取出后立即加入二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）1.5 mL，100 ℃ 水浴5 min，冷卻后加入蒸餾水定容至25 mL，混勻，測520 nm處吸光度。另取同量酶液，沸水浴5 min滅活后，作為對照。以不同濃度的葡萄糖溶液與DNS試劑反應，測520 nm處吸光度，制作葡萄糖標準曲線。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1個酶活性單位（U）。

1.6.4FPase活性測定

采用濾紙為底物測定FPase活性，分別于酶解管中加入濾紙，0.05 mol/L檸檬酸緩沖液（pH值為4.5）1 mL，酶液1 mL，50 ℃下保溫 30 min，取出后立即加入DNS試劑1.5 mL，100 ℃水浴5 min，冷卻后加蒸餾水至 25 mL，混勻，測520 nm處吸光度。另取同量酶液，沸水浴 5 min 滅活后，作為對照。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1個酶活性單位（U）。

2結果與分析

2.1不同菌株的產量分析

由圖1可知，各菌株間產量有明顯差別，菌株產量大小排序為黑威2號>黑威4號>981>8808>黑29，新復極差法求出各菌株間差異性，黑威2號顯著高于其他菌株（P<0.05），黑威4號、981菌株差異并不顯著（P>0.05），8808、黑29菌株產量最低。

2.2供試菌株的抗霉性分析

由圖2可知，各菌株抗霉能力有明顯差別，其中菌株抗霉能力大小排序為黑29>8808>981>黑威4號>黑威2號，黑威2號、黑威4號、981菌株抗霉能力較差，8808、黑29菌株抗霉能力較強。用新復極差法求出各菌株間抗霉能力差異性，黑威2號、黑威4號、981菌株抗霉能力顯著低于其他2個菌株（P<0.05）。

2.3供試菌株5種胞外酶活性分析

[CM（26]2.3.1LAC活性變化

5個供試黑木耳菌株在栽培過程中

LAC活性變化如圖3所示，由圖3可知，LAC活性變化基本趨勢一致，981、黑威2號、黑威4號菌株酶活性較高，981、黑威4號酶活性最高峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)的60 d。其他菌株酶活性差別不大，酶活性相對較低的菌株有8808、黑29。各菌株酶活性峰值出現(xiàn)的時間不同，5個供試黑木耳菌株酶活性高峰均出現(xiàn)在培養(yǎng)的60 d左右，培養(yǎng)30 d以后，酶活性高峰有所波動。

2.3.2POD活性的變化

在栽培過程中，5個供試菌株的POD活性有升有降，但總體上呈逐漸上升趨勢（圖4）。圖4中，隨著培養(yǎng)時間的延長，981、黑威2號、黑威4號菌株酶活性較高，50 d以后981、黑威4號菌株酶活性有所降低，黑威2號酶活性在培養(yǎng)的60 d達到最大。8808、黑29菌株酶活性相對較低，在培養(yǎng)的20 d達到最高峰，之后一直維持在較低的水平。

2.3.3CMCase活性變化

CMCase酶活性隨培養(yǎng)時間延長而增加，隨后有所降低，降到一定低水平時酶活性又有所升高，呈有交替性的升高下降趨勢。圖5顯示，981、黑威2號、黑威4號菌株酶活性較高，黑威2號、黑威4號酶活性在培養(yǎng)的30 d達到第1個高峰，培養(yǎng)的50 d達到第2個高峰，之后酶活性最高峰交替波動。8808、黑29菌株酶活性相對較低，最高峰出現(xiàn)得比較早，在培養(yǎng)的30 d達到最高峰，之后一直維持在較低的水平，在培養(yǎng)的時間內酶活性變化不大。

2.3.4FPase活性變化

栽培過程中FPase活性變化如圖6所示，隨著栽培時間的延長，981、黑威2號、黑威4號FPase活性迅速升高，而后其峰值交替出現(xiàn)。8808、黑29菌株酶活性相對較低，變化幅度也相對較小，20 d以后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，在前60 d表現(xiàn)為黑29>8808，60 d以后表現(xiàn)為黑 29>8808。

2.4不同菌株胞外酶相關性分析

相關性分析結果顯示（表1），供試菌株間產量與 CMCase、FPase、LAC活性呈顯著正相關（P<0.05），與抗霉性呈顯著負相關（P<0.05）；抗霉性與CMCase活性呈極顯著負相關（P<0.01），與FPase、LAC、POD活性呈顯著負相關（P<0.05）；LAC活性與 CMCase、FPase、POD活性呈極顯著正相關（P<0.01）；POD活性與CMCase、FPase活性呈極顯著正相關（P<0.01）；CMCase 活性與FPase活性呈極顯著正相關（P<0.01）。

3結論與討論

在黑木耳栽培過程中研究各菌株胞外酶活性變化規(guī)律，了解其在整個發(fā)育階段的分泌特點、活性大小、變化規(guī)律，推測其在不同生長發(fā)育階段對培養(yǎng)基中木質纖維素等大分子營養(yǎng)成分的降解動態(tài)，對提高培養(yǎng)料利用率有重要意義[5-7]。此外，黑木耳栽培過程中合成的各類酶，可使大分子物質降解生成葡萄糖并被食用菌利用，生成各類有機活性物質。研究各[CM（25]菌株在菌絲生長各階段（母種、原種、栽培種）的酶活性變

化規(guī)律，找出各菌株在培養(yǎng)過程中酶活性的變化特點，建立各菌株酶活性變化規(guī)律基本圖譜，繪制某些特定菌株的特定酶活性曲線，了解其酶學基礎用于菌株的鑒定工作[7]。本試驗研究顯示，被測各菌株酶活性變化存在一定的規(guī)律性，這一變化規(guī)律表明菌株正常生長的活力。當測定的酶活性及變化規(guī)律發(fā)生大改變時，就應該考慮停止使用該菌株，并進行栽培試驗測試，以檢測該菌株是否發(fā)生栽培性狀的改變。

木質素分解能力與食用菌代謝過程中合成的木質素分解酶有關，LAC、POD是目前公認的木質素分解酶之一，它能在O2存在的條件下脫去羥基上的電子或質子形成自由基，導致酚型木質素側鏈脫羧或脫氫，造成C—C鍵斷裂，從而降解木質素[2-3]。LAC、POD是與木質素等大分子物質降解有關的酚氧化酶，它能加速木質素等芳香族高分子化合物的分解[8-11]。本研究表明，原種培養(yǎng)基中存在豐富的木質素作用底物，黑木耳菌絲生長過程中可向基質中源源不斷地分泌LAC、POD等木質素酶，當培養(yǎng)菌絲產生的酶積累到一定水平時，表現(xiàn)為酶活性升高，激發(fā)酶與底物結合降解木質素，生成小分子而被菌絲生長利用，酶與底物結合后酶活性下降，菌絲生長。在酶活性監(jiān)測的過程中，隨酶活性的升高而降低，能較清晰地看到酶與底物之間的相互作用，這種作用的高低強弱與菌株自身分解基質能力有關，在檢測中如果發(fā)現(xiàn)某些菌株的酶活性發(fā)生異常，就應停止該菌株的大規(guī)模生產使用，并進行栽培試驗檢測。

黑木耳栽培過程中各菌種以分解基質中的纖維素、半纖維素、木質素來滿足其生長繁殖所需要的營養(yǎng)，而這些大分子物質須在纖維素酶的作用下才能夠分解，培養(yǎng)基中存在大量的纖維素。CMCase是一種誘導酶，隨著菌絲生長發(fā)育，菌絲細胞分泌的胞外CMCase逐漸增多，因此CMCase活性隨著培養(yǎng)時間逐漸增加。LAC、POD活性是與木質素等大分子物質降解有關的酶，本研究顯示，LAC、POD活性隨著栽培時間的延長呈上升趨勢，與前人的研究結果[5-7，12-14]一致。試驗中5個黑木耳菌株的CMCase、FPase、LAC、POD活性在菌絲生長期較低，隨著子實體的形成和成熟而逐漸增高，這符合木質素類物質優(yōu)先利用的推斷。5個供試菌株中，黑29產量一般，而本試驗測定的4種胞外酶活性中該菌株也相對較低，分析低酶活性可能與該菌株退化有關。

參考文獻：

[1]唐利華，肖揚，邊銀丙. 中國黑木耳主要栽培菌株ISSR指紋分析及SCAR標記[J]. 菌物學報，2008，27（2）：243-251.

[2]李輝平，黃晨陽，陳強，等. 黑木耳栽培菌株的ISSR分析[J]. 園藝學報，2007，34（4）：935-940.

[3]張潤光，刁小琴，關海寧. 黑木耳營養(yǎng)保健功能及其產品開發(fā)[J]. 保鮮與加工，2010（1）：54-56.

[4]牛福文，印桂玲. 黑木耳栽培期兩種培養(yǎng)基主要組分的降解和有關酶活的變化[J]. 微生物學通報，1990，17（4）：201-204.

[5]任廣明，李滇華，郭興，等. 黑木耳栽培菌株親緣關系的ISSR分析[J]. 東北林業(yè)大學學報，2011，39（5）：99-101.

[6]韓增華，張丕奇，孔祥輝，等. 黑木耳胞外酶活變化與栽培性狀比較的研究[J]. 食用菌學報，2007，14（4）：41-46.

[7]王玉江，韓增華，戴肖東，等. 黑木耳栽培過程中胞外酶活性變化[J]. 食用菌學報，2011，17（4）：40-43.

[8]陳艷秋，鹿道富，王歧，等. 袋料栽培黑木耳與段木栽培黑木耳的品質分析[J]. 食用菌學報，2001，8（1）：48-50.

[9]韓增華，張介馳，張丕奇，等. 黑木耳原種胞外酶活性的研究[J]. 生物技術，2009，19（5）：14-16.

[10]陳和生，孫振亞. 黑木耳多糖的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2003，14（5）：300-301.

[11]程金良，周麗潔，陳艷秋. 不同培養(yǎng)料栽培黑木耳比較試驗初報[J]. 食用菌，2008（3）：33-34.

[12]牛福文，印桂玲. 黑木耳栽培期兩種培養(yǎng)基主要組分的降解和有關酶活的變化[J]. 微生物學通報，1990，17（4）：201-204.

[13]韓增華，張介弛. 六株黑木耳兩種同工酶的研究[J]. 中國食用菌，2002，21（6）：42-45.

[14]陳錫時，夏炎. 胞外多糖酶活性和木耳子實體形成的關系[J]. 沈陽農業(yè)大學學報，1995，26（4）：403-407.