液態(tài)芯片技術聯(lián)合檢測IFN-γ和IP-10診斷結核性胸腔積液

劉佳慶張 立孫海柏吳 敏杜巖青馮 爽 劉樹業(yè)

新技術交流

液態(tài)芯片技術聯(lián)合檢測IFN-γ和IP-10診斷結核性胸腔積液

劉佳慶1,2張 立1孫海柏1吳 敏1杜巖青1馮 爽1劉樹業(yè)2△

目的 應用液態(tài)芯片技術聯(lián)合檢測胸腔積液中干擾素（IFN）-γ、IFN-γ誘導蛋白（IP）-10水平，探討其在臨床快速診斷及鑒別診斷結核性胸腔積液中的應用價值。方法選取滲透性胸腔積液患者，其中結核性胸腔積液組52例；惡性胸腔積液組38例。利用結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）測定其對結核桿菌反應的效應T細胞數(shù)量，即斑點形成細胞數(shù)（SFCs），同時利用液態(tài)芯片技術測定其IFN-γ和IP-10水平，通過Logistic逐步回歸法評估IFN-γ和IP-10聯(lián)合診斷時的價值，并比較兩種診斷方法的價值。結果T-SPOT.TB法診斷結核性胸腔積液的靈敏度為90.38％，特異度為84.21％，ROC曲線下面積（AUC）及95％CI為0.938(0.867～0.978)；IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷結核性胸腔積液時的靈敏度為98.08％，特異度為97.37％，AUC及95％CI為0.995（0.951～1.000）。2種診斷方法靈敏度和特異度的差異不明顯；2種方法診斷一致性良好（Kappa=0.703）；方法間AUC比較差異有統(tǒng)計學意義（Z=1.996，P＜0.05），檢測IFN-γ、IP-10水平聯(lián)合診斷時AUC較大（AUC=0.995）。結論利用液態(tài)芯片技術同時檢測IFN-γ、IP-10水平聯(lián)合診斷結核性胸腔積液滿足了臨床快速、準確診斷及鑒別診斷結核性胸腔積液的需要。

干擾素Ⅱ型；趨化因子CXCL10；胸腔積液,惡性；結核；ROC曲線；結核感染T細胞斑點試驗；液態(tài)芯片；IFN-γ誘導蛋白10

我國是結核病高負擔國家，≥15歲人口中活動性肺結核患者高達499萬[1]。在控制結核病各個環(huán)節(jié)中，準確診斷和早期治療非常重要，結核感染相關的干擾素（IFN）-γ釋放試驗將可能成為強有力的高靈敏度和高特異度的結核診斷輔助工具[2]。本研究利用液態(tài)芯片技術聯(lián)合檢測胸腔積液中IFN-γ和IFN-γ誘導蛋白（IP）-10水平并與經(jīng)典的結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）方法進行比較，以尋求早期快速準確診斷結核性胸腔積液的策略。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取我院2012年6月—2013年6月胸腔積液患者90例。其中結核組52例，男33例，女19例，平均年齡（49.02±21.99）歲，入組標準：（1）有結核病的中毒癥狀，如發(fā)熱、盜汗、全身乏力、食欲減退等。（2）經(jīng)過抗結核治療后，病情好轉，治療有效。（3）胸膜活檢時可見結核結節(jié)。（4）純化蛋白衍生物試驗（PPD）結節(jié)大于1.5 cm×1.5 cm。（5）經(jīng)肺部X線平片或CT檢查證實有結核病灶。以上5項中符合3項或單項（3）均可。惡性組38例，男27例，女11例，平均年齡（52.89±20.20）歲，入組標準：均經(jīng)肺穿刺活檢、胸部CT、脫落細胞學或纖維支氣管鏡檢查獲得病理組織學或細胞學依據(jù)而確診為惡性胸腔積液患者。2組人群排除標準：（1）妊娠期或哺乳期婦女。（2）年齡＜16歲或＞90歲。（3）正規(guī)抗結核治療超過1周。2組年齡（t=0.854）、性別（χ2=0.279）差異均無統(tǒng)計學意義。

1.2 儀器和試劑 IFN-γ和IP-10聯(lián)合檢測試劑盒購于美國伯樂公司；Luminex 200多功能流式點陣儀購于美國Luminex公司；T-SPOT.TB試劑盒購于英國Oxford Immunotec公司。

1.3 方法 所有患者留取新鮮胸腔積液約50 mL，及時送實驗室，取部分裝于5 mL離心管中，以10 000×g離心10 min后取上清液1 mL放入1.5 mL離心管中，置-20℃冰箱中保存，余下胸腔積液立即利用酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）檢測結核感染T細胞數(shù)量（T-SPOT.TB法），以2種抗原分別刺激所得的斑點形成細胞數(shù)（SFCs）較大者為T-SPOT.TB結果，臨界值為SFCs=6；利用液態(tài)懸浮芯片技術（Luminex xMAP?）同時檢測IFN-γ和IP-10水平，利用ROC曲線確定臨界值。具體操作嚴格按照試劑盒說明書和本科室標準操作規(guī)程（SOP）文件執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布計量資料采用±s表示，2組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料采用M(P25,P75)表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；陽性率的比較采用配對資料的McNemar檢驗；多因素分析采用Binary Logistic回歸；應用Medcalc 11.4軟件繪制ROC曲線，比較曲線下面積(AUC)，確定臨界值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組胸腔積液中IFN-γ、IP-10水平及SFCs比較 結核組胸腔積液中IFN-γ、IP-10水平及SFCs高于惡性組(均P＜0.01)，見表1。

Tab.1 Comparison of pleural effusion levels of IFN-γ, IP-10 and SFCs between two groups表1 2組胸腔積液中IFN-γ、IP-10、SFCs水平比較[M(P25,P75)]

2.2 ROC曲線分析 利用ROC曲線確定IFN-γ、IP-10的診斷臨界值分別為68.12、86.68 ng/L，靈敏度分別為90.38％、94.23％，特異度分別為92.11％、94.74％，AUC及95％CI分別為0.965(0.903～0.992)、0.962(0.899～0.991)，見圖1。

Fig.1 Comparison of ROC curves between two diagnostic tests圖1 2種診斷試驗ROC曲線圖比較

2.3 Binary Logistic回歸分析 利用Logistic逐步回歸法計算出IFN-γ、IP-10聯(lián)合檢測時的回歸方程為：Log(P)=0.018×IFN-γ+0.020×IP-10-4.558 (P為預測因子)，經(jīng)轉換得到預測因子的方程P=1/(1+e-(0.01819×IFN-γ+0.01963×IP-10-4.558))，以P作為聯(lián)合診斷指標繪制的ROC曲線見圖1，靈敏度和特異度分別為98.08％、97.37％，AUC及95％CI為0.995(0.951～1.000)。

2.4 2種方法比較 T-SPOT.TB診斷結核性胸腔積液 ROC曲線見圖 1，靈敏度和特異度分別為90.38％、84.21％，與IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷時的靈敏度和特異度比較差異不明顯；AUC及95％CI為0.938(0.867～0.978)，與IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷時的AUC比較，差異有統(tǒng)計學意義(Z=1.996，P＜0.05)，聯(lián)合診斷時的AUC較大。2種診斷方法的診斷一致性良好（Kappa=0.703）。

3 討論

滲出性胸腔積液在臨床上以結核性和惡性最為多見，兩者治療和預后迥然不同，故正確鑒別非常重要。IFN-γ是1型輔助性T淋巴細胞亞群（Th1）的特征性細胞因子，結核菌感染后，病變部位巨噬細胞被活化，IFN-γ產(chǎn)生增加，進而胸腔積液中IFN-γ表達增高。IP-10由IFN-γ和（或）脂多糖（LPS）誘導產(chǎn)生，具有促進多種細胞因子分泌介導Th1型炎癥反應及抗結核等生物學作用。

本研究發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中IFN-γ水平顯著低于結核性胸腔積液，與最近類似報道的結果[3-4]一致。但上述類似報道中IFN-γ的測定均使用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，操作繁瑣，重復性差，易受自身抗體及嗜異性抗體等因素干擾，而且擴展性差，不能多指標并行檢測，本研究所用的液態(tài)芯片技術改變了ELISA的分析模式，是多功能、多指標的并行分析系統(tǒng)，集編碼微球、激光技術、流式細胞、數(shù)字信號處理等技術于一體，具有高通量、高效率的特點，在孵育時間、標本用量、檢測線性范圍、檢測低限等方面均優(yōu)于ELISA法，而且在聯(lián)合指標的選擇上具有非常大的靈活性，可以自行設計，隨意組合多指標并行檢測，節(jié)省了時間和成本。最近有研究利用ELISA方法測定胸腔積液中IFN-γ等多指標組合后診斷結核性胸腔積液，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷時得到最高的靈敏度和特異度[5-6]。本研究選擇聯(lián)合檢測胸腔積液中IFN-γ和IP-10水平，結果高于IFN-γ單獨檢測時的診斷效率，成本也顯著低于IFN-γ和IP-10兩種ELISA試劑的價格之和。聯(lián)合檢測與經(jīng)典的T-SPOT.TB方法比較時，兩者診斷一致性良好（Kappa=0.703），盡管靈敏度和特異度的差異不明顯，但是兩者AUC比較表明IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷時對結核性胸腔積液的診斷價值更高，并且TSPOT.TB方法樣本需要量大，操作繁瑣，等待時間長（2 d）。另有研究表明，與T-SPOT.TB同屬經(jīng)典IFN-γ釋放試驗（IGRAs）的TB.QFT-IT(QuantiFERON-TB Gold in Tube)用于診斷結核性胸腔積液也不如IFN-γ水平直接定量測定價值高，TB.QFT-IT只增加了醫(yī)療費用沒有提高診斷價值[7]。

本研究利用液態(tài)芯片技術多指標并行的優(yōu)勢聯(lián)合檢測IFN-γ、IP-10診斷結核性胸腔積液，操作簡單，報告時間短，而且靈敏度、特異度均較高，滿足了輔助臨床對結核性胸腔積液早期準確診斷的需要。但是由于類似研究的缺少，沒有推薦的臨界值及醫(yī)學決定水平，而且本研究的標本均來自于同一家醫(yī)院，其代表性有一定局限性，樣本量較小，也不能排除在結核性胸腔積液患者中有非結核分枝桿菌感染，雖然這種現(xiàn)象很少見[8]，因此，需要進一步擴大樣本量繼續(xù)深入研究。

[1]Wang LX,Cheng SM,Chen MT,et al.The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010[J].Chinese Journal of Antituberculosis,2012,34(8):485-508.[王黎霞，成詩明，陳明亭，等.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志, 2012,34(8):485-508.]

[2]Qian F,Wang W,Qiu Z,et al.Evaluation of a new tuberculosis-related interferon gamma release assay for tuberculosis infection diagnosis in Huzhou,eastern China[J].Indian J Pathol Microbiol,2013, 56(2):125-128.

[3]Ibrahim L,Salah M,Abd El Rahman A,et al.Crucial role of CD4+ CD 25+FOXP3+T regulatory cell,interferon-γ and interleukin-16 in malignant and tuberculous pleural effusions[J].Immunol Invest,2013,42(2):122-136.

[4]Khan FY,Hamza M,Omran AH,et al.Diagnostic value of pleural fluid interferon-gamma and adenosine deaminase in patients with pleural tuberculosis in Qatar[J].Int J Gen Med,2013,6:13-18.

[5]Wu YB,Ye ZJ,Qin SM,et al.Combined detections of interleukin 27,interferon-γ,and adenosine deaminase in pleural effusion for diagnosis of tuberculous pleurisy[J].Chin Med J(Engl),2013,126 (17):3215-3221.

[6]Keng LT,Shu CC,Chen JY,et al.Evaluating pleural ADA,ADA2, IFN-and IGRA for diagnosing tuberculous pleurisy[J].J Infect, 2013,67(4):294-302.

[7]Ghanem M,Nasr Eldin E,Omar A,et al.Diagnostic value of quantitative measurement of pleural fluid interferon-gamma(IFN-γ)versus quantiFERON-TB gold in tube assays(QFT-IT)in blood,pleural fluid,and isolated pleural fluid cells in tuberculous pleural effusion[J].Chest,2013,144:262A.

[8]Lim JG,O SW,Lee KD,et al.Mycobacterium intracellulare pleurisy identified on liquid cultures of the pleural fluid and pleural biopsy[J].Tuberc Respir Dis(Seoul),2013,74(3):124-128.

（2013-12-14收稿 2014-04-25修回）

（本文編輯 李國琪）

Diagnostic Value of Combined Detection of the Level of IFN-γ and IP-10 by Liquid Array Technology in Tuberculous Pleural Effusion

LIU Jiaqing1,2,ZHANG Li1,SUN Haibai1,WU Min1,DU Yanqing1,FENG Shuang1,LIU Shuye2△
1 Tianjin Haihe Hospital,Tianjin 300350,China;2 The Third Central Clinical School of Tianjin Medical University△

E-mail:lshye@163.com

ObjectiveTo explore the diagnostic value of combined detection of the liquid array technology,interferon(IFN)-γ and IFN-γ-inducible protein(IP)-10 in the rapid,accurate diagnosis and differential diagnosis of tuberculous pleural effusions.MethodsPatients with transudative pleural effusions were divided into tuberculous pleural effusion group(n=52)and malignant pleural effusion group(n=38).The method of T-SPOT.TB was used to detect the number of effector T cells sensitized to Mycobacterium tuberculosis and spot forming cells(SFCs).The liquid array technology was used to detect the level of IFN-γ and IP-10.Logistic regression was used to analyze and compare the diagnostic value of the twomethod combination.ResultsThe diagnostic sensitivity,specificity and the area under the ROC curve(AUC)of T-SPOT. TB were 90.38％,84.21％,and 0.938(95％CI:0.867-0.978),respectively.The diagnostic sensitivity,specificity and AUC of combined detection of IFN-γ and IP-10 were 98.08％,97.37％,and 0.995(95％CI:0.951-1.000),respectively.There was no significant difference in the diagnostic sensitivity and specificity between the two methods,and the diagnostic agreement for the two diagnostic methods was fine(Kappa=0.703).The difference of AUC between the methods was significantly different(Z=1.996,P＜0.05).The method of combined detection of IFN-γ and IP-10 showed the larger AUC(AUC=0.995).Conclusion The combined diagnosis meets the clinical needs of rapid,accurate diagnosis and differential diagnosis for tuberculous pleural effusion by simultaneously assaying the level of IFN-γ and IP-10 using the liquid array technology.

interferon typeⅡ;chemokine CXCL10;pleural effusion,malignant;tuberculosis;ROC Curve; T-SPOT.TB;liquid array technology;IFN-γ-inducible protein 10

R521

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.027

天津市衛(wèi)生局科技基金項目(2013KZ042)

1天津市海河醫(yī)院檢驗科(郵編300350)；2天津醫(yī)科大學三中心臨床學院

△通訊作者 E-mail:lshye@163.com