人參皂苷Rg1對(duì)腦缺血再灌注大鼠nNOS、iNOS表達(dá)的影響

屈惠瑩袁 靜 包翠芬秦書(shū)儉

人參皂苷Rg1對(duì)腦缺血再灌注大鼠nNOS、iNOS表達(dá)的影響

屈惠瑩1袁 靜2△包翠芬1秦書(shū)儉1

目的 探討人參皂苷Rg1對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織一氧化氮合酶（NOS）表達(dá)的影響。方法將30只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、Rg1-L組、Rg1-M組、Rg1-H組及尼莫地平組，每組5只。采用大鼠中動(dòng)脈栓塞法制作大鼠腦缺血再灌注模型，觀察大鼠再灌注后神經(jīng)功能缺損情況，采用硝酸還原酶法和比色法檢測(cè)大鼠血清中NO、神經(jīng)型NOS（nNOS），誘導(dǎo)型NOS（iNOS）的含量，應(yīng)用免疫組化和免疫印跡法檢測(cè)腦缺血再灌注后nNOS、iNOS的表達(dá)。結(jié)果（1）Rg1-L組、Rg1-M組、Rg1-H組大鼠的腦缺血后神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于腦缺血再灌注組（2.40±0.55、1.80±0.84、1.60±0.89 vs 3.20±0.84，P＜0.05）。（2）與腦缺血再灌注組相比，3個(gè)Rg1組大鼠血清中NO 和iNOS含量降低，nNOS含量增高。（3）與腦缺血再灌注組相比，3個(gè)Rg1組大鼠腦組織中nNOS表達(dá)增高，iNOS表達(dá)降低。結(jié)論人參皂苷Rg1防治大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制可能與激活nNOS、抑制iNOS有關(guān)。

人參皂苷；一氧化氮合酶；一氧化氮；腦缺血再灌注

腦缺血疾病有發(fā)病率高、致殘率高、致死率高的特點(diǎn)，目前臨床上的治療主要以溶栓使血管再通為主，但是缺血再灌注造成的損傷不可避免，如何解決缺血再灌注損傷已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。人參皂苷Rg1主要存在于人參屬藥材中，是人參的主要成分之一。研究表明，腦缺血再灌注后，人參皂苷Rg1可明顯改善大鼠的神經(jīng)功能，減少腦梗死體積并減輕腦水腫程度[1]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是一種同工酶，主要分為3個(gè)亞型，神經(jīng)型NOS（nNOS或NOS1）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS或NOS2）和內(nèi)皮型NOS（eNOS或NOS3），腦缺血后主要通過(guò)nNOS和iNOS影響NO的含量[2]。已有研究報(bào)道人參皂苷Rg1對(duì)腦缺血再灌注大鼠caspase-3[3]、Bax[4]等因子表達(dá)的影響，但關(guān)于人參皂苷Rg1對(duì)腦缺血再灌注大鼠nNOS和iNOS表達(dá)影響的相關(guān)文獻(xiàn)尚少，本研究通過(guò)制作大鼠腦缺血再灌注模型，檢測(cè)腦組織缺血再灌注后nNOS和iNOS的表達(dá)，探討nNOS和iNOS在腦缺血再灌注中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 人參皂苷Rg1(純度＞95％)購(gòu)自吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室，經(jīng)生理鹽水稀釋后備用；尼莫地平注射液(批號(hào)071001)購(gòu)自山西亞寶藥業(yè)；nNOS和iNOS抗體購(gòu)自SANTA CRUZ公司，PV6001試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司，大鼠NO、nNOS和iNOS試劑盒購(gòu)自南京建成試劑公司。其他實(shí)驗(yàn)試劑均由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康SPF級(jí)SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證：SCXK(京)2012-0001]，隨機(jī)均分為6組：（1）假手術(shù)組。（2）腦缺血再灌注組。（3）Rg1-L組。（4）Rg1-M組。（5）Rg1-H組。（6）尼莫地平組即陽(yáng)性藥物對(duì)照組。分別于術(shù)前5 d至取材當(dāng)日給（3）～（5）組腹腔注射10、20、40 mg/kg人參皂苷Rg1，（6）組注射1 mg/kg尼莫地平，其余2組注射等量生理鹽水，1次/d。

1.3 大鼠右側(cè)局灶性腦缺血(MCAO)模型的制備 10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，采用線栓法[5]制備大鼠MCAO模型。線栓采用頭端光滑燙圓的直徑0.23 mm魚(yú)線，長(zhǎng)度由右側(cè)頸外動(dòng)脈分叉部計(jì)約（18.5±0.5）mm，假手術(shù)組插入深度小于15 mm。栓塞2 h后，將魚(yú)線輕輕拔出并縫合皮下筋膜及皮膚，即為再灌注模型，再灌注時(shí)間為24 h。術(shù)中保持肛溫在37.0～37.5℃。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 待動(dòng)物清醒后，參考Longa等[6]的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)其神經(jīng)功能：0分，無(wú)明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分，不能完全伸展左側(cè)前爪；2分，向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分，不能自動(dòng)行走，意識(shí)水平下降。1～3分的大鼠為造模成功，剔除不符合條件及死亡的大鼠。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中剔除及死亡的大鼠均按嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)一補(bǔ)充。

1.5 大鼠血清中NO、nNOS和iNOS含量的測(cè)定 MCAO術(shù)后24 h，將各組大鼠麻醉，于右心房取血5 mL，室溫靜置2～3 h，待血液凝固后，以1 500 r/min離心5 min，去上清液后于-20℃保存?zhèn)溆?，采用硝酸還原酶法測(cè)定血清NO含量，采用比色法測(cè)定血清nNOS、iNOS含量，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織中nNOS和iNOS的表達(dá) MCAO術(shù)后24 h，將各組大鼠麻醉，4％多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，10％中性福爾馬林固定6～12 h，乙醇逐級(jí)脫水，定向包埋，連續(xù)切片（厚度5 μm）。采用高壓加熱法修復(fù)抗原，PBS漂洗，每張切片滴加適當(dāng)比例稀釋的nNOS、iNOS抗體，4℃過(guò)夜，次日取出，每張切片滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗大鼠多聚體，37℃孵育，PBS漂洗，DAB顯色，鏡下觀察至出現(xiàn)背景染色時(shí)，置于蒸餾水內(nèi)終止反應(yīng)。蘇木精染液復(fù)染后，脫水，透明，封片，鏡下觀察。采用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。采用CIAS圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)每高倍鏡視野下陽(yáng)性蛋白表達(dá)的平均灰度。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)大鼠腦組織中nNOS和iNOS的表達(dá) MCAO術(shù)后24 h，將各組大鼠麻醉，4％多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，迅速放入液氮內(nèi)冷凍，超低溫冰箱內(nèi)保存。檢測(cè)前取適量的冷凍組織，裂解吸取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白含量，電泳，半干轉(zhuǎn)印，TBST沖洗后，5％血清白蛋白于室溫下封閉。加入適當(dāng)比例稀釋的nNOS和iNOS抗體，4℃過(guò)夜，次日滴加適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，內(nèi)參采用β-actin蛋白。掃描條帶，用光密度軟件分析電泳條帶光密度。以目的條帶與內(nèi)參條帶光密度的比值表示待測(cè)蛋白的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損。腦缺血再灌注組大鼠可見(jiàn)有明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀，給予人參皂苷Rg1后，Rg1-L組、Rg1-M組、Rg1-H組神經(jīng)功能缺失程度均較腦缺血再灌注組減輕，但仍較假手術(shù)組嚴(yán)重(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠血清 NO、nNOS和 iNOS水平比較 （1）NO:假手術(shù)組NO正常，腦缺血再灌注組NO含量明顯高于其他各組。給予人參皂苷Rg1后，3 個(gè)Rg1組的血清NO含量均低于腦缺血再灌注組，與假手術(shù)組無(wú)顯著差異，Rg1-M組、Rg1-H組的NO含量與尼莫地平組無(wú)顯著差異（均P＞0.05），但Rg1-L組高于尼莫地平組。（2）nNOS：假手術(shù)組nNOS正常，腦缺血再灌注組nNOS含量明顯低于假手術(shù)組，給予人參皂苷Rg1后，Rg1-L組與腦缺血再灌注組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但Rg1-M組、Rg1-H組的nNOS含量高于腦缺血再灌注組，但與尼莫地平組及假手術(shù)組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。（3）iNOS:假手術(shù)組iNOS含量較少，腦缺血再灌注組iNOS含量明顯高于其他各組。給予人參皂苷Rg1后，3個(gè)Rg1組的iNOS含量均低于腦缺血再灌注組，與假手術(shù)組無(wú)顯著差異。Rg1-M組、Rg1-H組的iNOS含量與尼莫地平組無(wú)顯著差異，但Rg1-L組高于尼莫地平組，見(jiàn)表1。

2.3 免疫組化法檢測(cè)nNOS和iNOS結(jié)果 （1）nNOS：假手術(shù)組為正常神經(jīng)細(xì)胞，體積大，核著色淺，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量淺黃色或黃色的nNOS染色顆粒。腦缺血再灌注組部分神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞呈三角形或梭形，細(xì)胞周?chē)g隙增寬，核色深，核仁不明顯，有的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黃色的nNOS染色顆粒。人參皂苷Rg1各組細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的改善，且見(jiàn)明顯的nNOS染色顆粒，見(jiàn)圖1。（2）iNOS：假手術(shù)組為正常神經(jīng)細(xì)胞，體積大，核著色淺，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)偶見(jiàn)淺黃色或黃色的iNOS染色顆粒。腦缺血再灌注組部分神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞呈三角形或梭形，細(xì)胞周?chē)g隙增寬，核色深，核仁不明顯，有的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯的黃色或棕黃色的iNOS染色顆粒。人參皂苷Rg1各組細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的改善，且見(jiàn)少量的iNOS染色顆粒，見(jiàn)圖2。

2.4 免疫印跡檢測(cè)nNOS和iNOS的表達(dá)結(jié)果 （1）nNOS:假手術(shù)組nNOS正常表達(dá)，腦缺血再灌注組nNOS表達(dá)低于假手術(shù)組，給予人參皂苷Rg1后，Rg1-L組與腦缺血再灌注組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但Rg1-M組、Rg1-H組nNOS表達(dá)高于腦缺血再灌注組，且其表達(dá)水平與尼莫地平組及假手術(shù)組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。（2）iNOS:假手術(shù)組iNOS少量表達(dá)，腦缺血再灌注組iNOS表達(dá)明顯高于其他各組。給予人參皂苷Rg1后，3個(gè)Rg1組的iNOS水平低于腦缺血再灌注組，與假手術(shù)組無(wú)顯著差異。Rg1-M組、Rg1-H組的iNOS表達(dá)水平與尼莫地平組無(wú)顯著差異，但Rg1-L組高于尼莫地平組，見(jiàn)表2，圖3。

Tab.1 Comparision of neurological scores and contents of NO,nNOS and iNOS in six groups of rats表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及NO、nNOS及iNOS含量比較 （n=5，±s）

Tab.1 Comparision of neurological scores and contents of NO,nNOS and iNOS in six groups of rats表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及NO、nNOS及iNOS含量比較 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a與假手術(shù)組比較，b與腦缺血再灌注組比較，c與Rg1-M組比較，d與尼莫地平組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組腦缺血再灌注組Rg1-L組Rg1-M組Rg1-H組尼莫地平組F神經(jīng)功能評(píng)分（分）0 3.20±0.84a2.40±0.55abd1.80±0.84ab1.60±0.89ab1.80±0.45ab3.963＊NO(μmol/L) 11.72±2.15 20.49±3.08a13.98±2.01bd11.16±0.91b6.25±0.43b8.23±0.30b38.653＊組別假手術(shù)組腦缺血再灌注組Rg1-L組Rg1-M組Rg1-H組尼莫地平組F nNOS（U/mg）147.78±25.40 10.49±4.15a26.88±16.07c87.85±16.93b159.38±24.42b106.60±17.94b53.034＊iNOS（U/mg）20.25±17.78 208.75±17.49a134.06±15.59bd100.06±16.24b35.12±9.15b54.06±31.30b69.200＊

Tab.2 Optical density values of nNOS and iNOS in six groups表2 各組大鼠nNOS、iNOS光密度值（n=5，±s）

Tab.2 Optical density values of nNOS and iNOS in six groups表2 各組大鼠nNOS、iNOS光密度值（n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與腦缺血再灌注組比較，c與Rg1-M組比較，d與尼莫地平組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組腦缺血再灌注組Rg1-L組Rg1-M組Rg1-H組尼莫地平組F nNOS/β-actin 0.393 6±0.059 7 0.080 0±0.048 6a0.166 4±0.040 5cd0.321 3±0.064 9b0.419 1±0.107 1b0.356 8±0.062 4b12.225＊＊iNOS/β-actin 0.068 7±0.007 1 0.360 6±0.089 2a0.250 2±0.087 5bd0.151 5±0.025 7b0.086 7±0.042 4b0.100 5±0.024 4b12.535＊＊

Fig.3 The expression levels of nNOS/iNOS protein in cerebral tissues in six groups圖3 nNOS/iNOS在各組大鼠腦組織的表達(dá)

3 討論

人參被譽(yù)為“滋陰補(bǔ)生，扶正固本”之極品，其主要的藥理作用通過(guò)人參皂苷表現(xiàn)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)歸補(bǔ)氣湯[7]，芪菖治癱口服液[8]、蓮心堿[9]、茶色素[10]、MC-002[11]、葛根黃酮[12]等均可抑制NOS表達(dá)，降低NO的神經(jīng)毒性。腦缺血再灌注損傷主要與興奮性氨基酸毒性、自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化[13]、熱休克蛋白表達(dá)紊亂、NO含量和Ca2+超載有關(guān)[14-15]。NOS是NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，腦缺血后，神經(jīng)末梢釋放大量的谷氨酸，刺激N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體，導(dǎo)致細(xì)胞中Ca2+濃度升高，NOS活性增強(qiáng)，NO產(chǎn)生量增加。且腦缺血后，ATP大量消耗，能量代謝障礙及cAMP依賴(lài)性蛋白激酶活性下降，使NOS脫磷酸化，NOS的活性增強(qiáng)[16]。NO能擴(kuò)張血管[17]，增加血流量，改善缺血組織血供[18]，抑制血小板凝集[19]，但是高濃度的NO則會(huì)對(duì)機(jī)體及組織造成損害，引起組織氧化應(yīng)激損傷。腦缺血再灌注后，神經(jīng)細(xì)胞中的nNOS減少，不利于腦組織缺血再灌注，不同于nNOS，iNOS只在細(xì)胞受到刺激后被激活而發(fā)揮作用，且產(chǎn)生的NO也較多，NO具有神經(jīng)毒性，不利于腦組織的再灌注，還會(huì)加重腦缺血損傷程度[20]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定大鼠腦組織中NO、nNOS和iNOS的含量以及腦組織中nNOS和iNOS的表達(dá)，結(jié)果顯示，假手術(shù)組NO含量較少，腦缺血再灌注組NO含量明顯高于其他各組，給予人參皂苷Rg1后，3個(gè)Rg1組NO含量低于腦缺血再灌注組；假手術(shù)組nNOS正常表達(dá)，腦缺血再灌注組nNOS表達(dá)明顯低于假手術(shù)組，Rg1-M組、Rg1-H組nNOS表達(dá)高于腦缺血再灌注組；假手術(shù)組iNOS少量表達(dá)，腦缺血再灌注組iNOS表達(dá)明顯高于其他各組，給予人參皂苷Rg1后，3個(gè)Rg1組的iNOS水平低于腦缺血再灌注組，表明腦缺血再灌注后nNOS明顯減少，應(yīng)用人參皂苷Rg1可以激活腦缺血再灌注后nNOS的活性，使NO產(chǎn)生量增加，有利于腦組織血管擴(kuò)張，增加腦組織的血流量，改善腦組織血供，而iNOS在細(xì)胞受到刺激后產(chǎn)生，產(chǎn)生有毒性作用的NO也較多，影響腦缺血再灌注后的恢復(fù)，應(yīng)用人參皂苷Rg1后，iNOS的表達(dá)水平降低，產(chǎn)生的具有神經(jīng)毒性的NO也隨之減少，將有利于腦組織的再灌注及減少腦缺血的損傷程度。

Fig.1 nNOS expressions in cerebral tissues in six groups(DAB dyeing,×400)圖1 nNOS在大鼠腦組織的表達(dá)（DAB染色,×400）

Fig.2 iNOS expressions in cerebral tissues in six groups(DAB dyeing,×400)圖2 iNOS在大鼠腦組織的表達(dá)（DAB染色,×400）

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(2014-05-23收稿 2014-06-30修回)

（本文編輯 閆娟）

Effects of Ginsenoside Rg1 on nNOS and iNOS Expressions in Rat Brain Tissue after Cerebral Ischemia Reperfusion

QU Huiying1，YUAN Jing2△，BAO Cuifen1，QIN Shujian1
1 Department of Human Anatomy＆Histology and Embryology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2 The First Affiliated Hospital，Liaoning Medical College△

E-mail：mianyizuhua@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the effects of Ginsenoside Rg1 on the expression of nitric oxide synthase (NOS)in brain tissue after cerebral arterial thrombosis in adult rats.MethodsThirty rats were randomly divided into the sham-operative group,cerebral ischemia-reperfusion group,Ginsenoside Rg1-L group,Ginsenoside Rg1-M group,Ginsenoside Rg1-H group and nimodipine group(n=5 for each group).The ischemia-reperfusion rat model was established by middle cerebral artery occlusion.The neurological score after reperfusion was observed.The levels of nitric oxide(NO),neuronal NOS(nNOS)and inducible NOS(iNOS)were detected by nitrate reduction method and colorimetric method.The expressions of nNOS and iNOS after reperfusion were analyzed by immunohistochemistry and Western blot assay.Results(1)The neurological scores after cerebral ischemia were significantly lower in Rg1-L group,Rg1-M group and Rg1-H group than those of cerebral ischemia-reperfusion group（2.40±0.55,1.80±0.84,1.60±0.89 vs 3.20±0.84，P＜0.05).(2)Compared with those of model group,serum levels of NO and iNOS were reduced,and nNOS levels increased,in three groups of Rg1.(3)Compared with those of model group,the expression of nNOS was significantly increased，and iNOS expression was significantly reduced,in three groups of Rg1.ConclusionThe preventive effects of Ginsenosides Rg1 on cerebral ischemia-reperfusion injury may be associated with the activation of nNOS and the inhibition of iNOS.

ginsenoside;nitric oxide synthase；nitric oxide；cerebral ischemia reperfusion;

R282

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.010

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170930、81202783）

1遼寧錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室（郵編121000）；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

△通訊作者 E-mail：mianyizuhua@aliyun.com