更昔洛韋治療嬰兒人巨細(xì)胞病毒感染的預(yù)后評估指標(biāo)的探討

李娟

更昔洛韋治療嬰兒人巨細(xì)胞病毒感染的預(yù)后評估指標(biāo)的探討

李娟

目的 探討IE mRNA和pp67 mRNA在更昔洛韋治療后的人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染患兒中的表達(dá)情況。方法在接受更昔洛韋治療前，治療2周和停藥4周時(shí)檢測HCMV患兒總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）及熒光定量PCR的方法檢測HCMV-DNA拷貝數(shù)，IE mRNA和pp67 mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。結(jié)果更昔洛韋治療2周后，患兒肝功能及血HCMVDNA均較治療前降低，停藥4周后TBIL、DBIL、ALT、ALP及HCMV-DNA拷貝數(shù)均較治療前顯著降低，但是與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后2周，仍有12例患兒血液中表達(dá)pp67 mRNA，表達(dá)量顯著低于治療前的pp67 mRNA表達(dá)量，但檢測不到患兒表達(dá)IE mRNA。停藥4周，pp67 mRNA陽性表達(dá)的患兒數(shù)量顯著低于治療2周的患兒數(shù)量，有3例患兒表達(dá)微弱的IE mRNA。2個(gè)基因的mRNA表達(dá)量與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論在更昔洛韋治愈患兒，HCMV-DNA檢測呈現(xiàn)陰性時(shí)，應(yīng)再進(jìn)行病毒mRNA檢測，對RNA表達(dá)陽性的患兒，應(yīng)該加強(qiáng)隨訪與復(fù)查，預(yù)防病毒復(fù)發(fā)。

巨細(xì)胞病毒；嬰兒；更昔洛韋；IE mRNA；pp67 mRNA；病毒檢測

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）具有明顯的種屬特異性[1]，人類對于該病毒具有較強(qiáng)的易感性，而我國則是HCMV感染的高發(fā)流行地區(qū)。目前針對HCMV的治療方法及效果不滿意[2]。更昔洛韋是目前公認(rèn)的針對HCMV較好的臨床治療藥物[3]。然而，關(guān)于更昔洛韋治療嬰兒HCMV感染的臨床資料還比較缺乏。目前對嬰兒感染HCMV接受治療后的預(yù)后檢測指標(biāo)主要集中于利用DNAPCR方法檢測病毒拷貝數(shù)等[4]，缺乏快速明確病毒復(fù)制情況的檢測指標(biāo)。根據(jù)不同時(shí)期表達(dá)RNA分子的差異，可以輔助甄別病毒感染時(shí)期，是目前病毒檢測的新策略。本研究通過對HCMV基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IEA mRNA和pp67 mRNA的檢測，探討mRNA表達(dá)是否可以作為嬰兒HCMV感染及評估預(yù)后的新指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月—2013年6月我院消化科收治的1～6個(gè)月患兒54例?；純壕鶠橐渣S疸、肝脾腫大、發(fā)熱、咳喘、腹瀉、抽搐為主要癥狀的HCMV感染且肝功能異常。HCMV感染符合參考文獻(xiàn)[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患兒入院后給予更昔洛韋5 mg/kg，每12 h 1次，靜脈滴注治療，同時(shí)靜脈滴注葡醛酸鈉保肝治療。并根據(jù)患兒癥狀分別給予退黃、退熱、止咳平喘、止瀉、止驚等治療。療程2周。2周后部分患兒肝功能仍異常，出院后繼續(xù)口服葡醛內(nèi)酯保肝治療。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 使用的材料均為血清樣本。抽提樣本RNA及相關(guān)PCR實(shí)驗(yàn)均采用Qiagen公司的相應(yīng)試劑盒（Qiagen，德國）。Real-Time PCR儀及數(shù)據(jù)分析軟件購自Life Technologies公司（ABI 7500，Life Technologies，US）。

1.2.2 生化指標(biāo)的檢測 分別于治療前、治療2周、停藥4周時(shí)抽取患兒股靜脈血1～2 mL，檢測肝功能和HCMVDNA。肝功能各項(xiàng)指標(biāo)均采用試劑盒進(jìn)行檢測，而HCMVDNA則采用裂解液，破碎細(xì)胞，使得病毒顆粒游離，14 000×g離心10 min，取上清，利用熒光定量檢測方法對病毒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量。以上操作均嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.2.3 總RNA提取、定量及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 參照參考文獻(xiàn)[6]，Trizol法提取樣本總RNA，并利用紫外分光光度計(jì)檢測提取后的RNA樣本的純度與濃度，根據(jù)樣本檢測的不同波長的光密度比值，確認(rèn)提取得到的RNA樣本的質(zhì)量。RNA樣本的PCR反應(yīng)體系為80 μL，其中包含有4 μg的RNA樣本，dNTP混合物（各200 μmol/L），引物（各100 pmol），鎂離子（1.5 mmol/L），10×擴(kuò)增緩沖液8 μL，聚合酶（4 μL）和三蒸水（68 μL）。構(gòu)建好的反應(yīng)體系充分混勻后，在3 000 r/min的條件下，離心1 min，立即轉(zhuǎn)入65℃水浴，處理5 min，最后將裝有樣本的PCR管放于冰中，待用。在樣本的PCR管中，加入5倍體積的First-strand buffer，0.1 mol/L二硫蘇糖醇，RNase抑制劑（40 U/μL）。充分混勻后，在室溫孵育10 min，然后在65℃孵育2 min。向各管中加入4 μL M–MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，在3 000 r/min的條件下，離心1 min，立即放入37℃水浴，處理50 min后，再放入70℃水浴處理15 min，–20℃保存樣品cDNA。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)IE和pp67基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，IE的引物序列為上游5′-TTTGAACGAGTGACCGAGGA-3′，下游5′-CCCAATACACTTCATCTCCT-3′，產(chǎn)物大小110 bp。pp67的引物序列為上游5′-CCTCTGGATGTGGTGGTAT-3′，下游5′-CCTCTGGATGTGGTGGTAT-3′，產(chǎn)物大小400 bp，管家基因β-actin的引物序列為上游5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，下游5′-GAACCGCTCAATGCCGATAG-3′，產(chǎn)物大小229 bp。熒光定量PCR試驗(yàn)流程參照參考文獻(xiàn)[6]。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性60 s、95℃10 s、退火溫度58℃10 s、72℃20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溫度變化速度為20℃/s，在每個(gè)循環(huán)的延伸末檢測熒光信號。隨后是一個(gè)緩慢升溫的程序：65℃15 s，95℃10 s，溫度變化速度為0.1℃/s，同時(shí)連續(xù)檢測DNA逐漸變化過程中熒光信號的變化情況，繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線（melting curve），以了解樣品擴(kuò)增的特異性，保障測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用PCR儀自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)各待測基因的PCR擴(kuò)增CT值與相對應(yīng)的β-actin的PCR擴(kuò)增CT值相減得到△CT來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以2-△CT計(jì)算得出各待測基因產(chǎn)物的相對定量，每管樣品重復(fù)測定3次得到的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后患兒的肝功能及血HCMV-DNA比較 更昔洛韋治療2周后，患兒肝功能及血HCMVDNA均較治療前降低，停藥4周后總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）及HCMV-DNA拷貝數(shù)均較治療前顯著降低，但是與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Comparison of general information for patients before and after drug treatment表1 藥物治療前后患兒肝功能及血HCMV-DNA比較（n=54）

2.2 治療前后患兒IE及pp67 mRNA的表達(dá) 治療后2周，仍有12例患兒血液中表達(dá)pp67 mRNA，表達(dá)量顯著低于治療前的pp67 mRNA表達(dá)量，但檢測不到患兒表達(dá)IE mRNA。停藥4周，pp67 mRNA陽性表達(dá)的患兒數(shù)量顯著低于治療2周的患兒數(shù)量，有3例患兒表達(dá)微弱的IE mRNA。2個(gè)基因的mRNA表達(dá)量與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Relative mRNA expressions of pp67 and IE mRNA in patients before and after treatment表2 治療前后患者pp67 mRNA及IE mRNA的相對表達(dá)量和陽性患兒數(shù)量

3 討論

本研究結(jié)果表明，因HCMV感染的患兒，在接受更昔洛韋治療后，病毒DNA數(shù)量得到顯著的降低，說明了藥物治療的有效性。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)病毒IE mRNA和 pp67 mRNA也相應(yīng)降低，其中 IE mRNA幾乎檢測不到，而pp67在少數(shù)患者中仍然可以檢測。停藥4周后，進(jìn)行復(fù)查，發(fā)現(xiàn)pp67 mRNA表達(dá)的患者數(shù)量進(jìn)一步降低，但是有3例表達(dá)IE，提示病毒存在復(fù)發(fā)的可能性。

更昔洛韋是臨床較常用的治療巨細(xì)胞病毒感染的一類藥物，通常用于預(yù)防及治療免疫功能缺陷患者的巨細(xì)胞病毒感染[7-8]。近年來也用于嬰兒HCMV感染。更昔洛韋治療主要是針對HCMV病毒的感染機(jī)制，包括藥物通過滲透作用進(jìn)入病毒DNA，使得DNA復(fù)制受到抑制，同時(shí)還可以通過競爭性抑制DNA聚合酶形成，達(dá)到降低DNA拷貝數(shù)的目的[9]。

病毒DNA在治療后仍然存在較低量的拷貝數(shù)，一方面表明病毒DNA復(fù)制已經(jīng)停止，患兒需要進(jìn)一步加強(qiáng)自身免疫力；另外一方面，也表明體內(nèi)病毒已經(jīng)停止復(fù)制，特別是停藥4周復(fù)查后，病毒數(shù)進(jìn)一步下降的結(jié)果更加證明了這個(gè)結(jié)論。HCMV是一類既含有DNA又含有RNA的病毒[10]，因此，筆者在本研究中用熒光定量PCR的方法檢測了RNA表達(dá)情況。結(jié)果表明，盡管病毒DNA復(fù)制已經(jīng)基本停止，但是仍然有一定比例的患兒表達(dá)病毒RNA，提示仍然需要加強(qiáng)日常隨訪。

按照傳統(tǒng)的DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)，本研究入組的患兒均已經(jīng)好轉(zhuǎn)并出院，但是mRNA檢測發(fā)現(xiàn)，病毒仍然存在復(fù)發(fā)的可能性。因此，應(yīng)該針對此類患兒在出院前檢測相應(yīng)的mRNA表達(dá)，對于mRNA陽性表達(dá)的患兒應(yīng)該更加注意隨訪和復(fù)查，降低患兒再次受到HCMV感染的風(fēng)險(xiǎn)。

[1]Zhao P,Ma DX,Yu S,et al.The development of Chinese specific human cytomegalovirus polyepitope recombinant vaccine[J].Antiviral Res,2012,93(2):260-269.doi:10.1016/j.antiviral.2011.12.005.

[2]Minces LR,Nguyen MH,Mitsani D,et al.Ganciclovir-resistant cytomegalovirus infections among lung transplant recipients are associated with poor outcomes despite treatment with foscarnet-containing regimens[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(1):128-135.doi:10.1128/AAC.00561-13.

[3]Gentry BG,Drach JC.Metabolism of cyclopropavir and ganciclovir in human cytomegalovirus-infected cells[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(4):2329-2333.doi:10.1128/AAC.02311-13.

[4]Ding D,Han S,Wang Z,et al.Does the existence of HCMV components predict poor prognosis in glioma[J]?J Neurooncol,2014,116 (3):515-522.doi:10.1007/s11060-013-1350-9

[5]Piccirilli G,Chiereghin A,Gabrielli L,et al.Diagnosis and Management of Human Cytomegalovirus Infection in the Mother,Fetus,and Newborn Infant.Diagnosis and monitoring of cytomegalovirus infection by the quantification of viral load in dried blood spots samples [J].Expert Rev Mol Diagn,2014,14(2):139-142.doi:10.1586/ 14737159.2014.883278.

[6]Ozbek SM,Ozbek A,Yavuz MS.Detection of human cytomegalovirus and Epstein-Barr Virus in symptomatic and asymptomatic apical periodontitis lesions by real-time PCR[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2013,18(5):e811-816.doi:10.4317/medoral.18905.

[7]Tawse KL,Baumal CR.Intravitreal foscarnet for recurring CMV retinitis in a congenitally infected premature infant[J].J AAPOS,2014, 18(1):78-80.doi:10.1016/j.jaapos.2013.09.015.

[8]Langner-Wegscheider BJ,ten Dam-van Loon N,Mura M,et al.Intravitreal ganciclovir in the management of non-AIDS-related human cytomegalovirus retinitis[J].Can J Ophthalmol,2010,45(2): 157-160.doi:10.3129/i09-262.

[9]Ladd B,Ackroyd JJ,Hicks JK,et al.Inhibition of homologous recombination with vorinostat synergistically enhances ganciclovir cytotoxicity[J].DNA Repair(Amst)，2013,12(12):1114-1121.doi: 10.1016/j.dnarep.2013.10.008.

[10]Hook L,Hancock M,Landais I,et al.Cytomegalovirus microRNAs [J].Curr Opin Virol,2014,7C:40-46.doi:10.1016/j.coviro.2014.03.015.

（2014-04-29收稿 2014-05-23修回）

（本文編輯 魏杰）

Prognostic Indicators for Infants Infected HCMV Virus after Ganciclovir Treatment

LI Juan
Department of Gastroenterology and Hepatology,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300074,China

ObjectiveTo study the IE and pp67 mRNA expressions in infants infected human cytomegalovirus (HCMV)after ganciclovir treatment.MethodsThe values of total bilirubin(TBIL),direct bilirubin(DBIL),alanine aminotransferase(ALT)and alkaline phosphatase(ALP)were detected in patients with HCMV before treatment,2 weeks and 4 weeks after treatment.The HCMV-DNA was detected by quantitative PCR.The expression levels of IE mRNA and pp67 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsHCMV DNA stopped copying and the infected infants were cured following the traditional criterion,however,RNA expression was still tested in part of these infants.ConclusionIt should be identified for mRNA expression when HCMV-DNA copies were hardly identified in these infants to prevent from relapse.

cytomegalovirus;infant;Ganciclovir;IE mRNA;pp67 mRNA;virus identification

R722.13

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.026

天津市兒童醫(yī)院消化科（郵編300074）