• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    更昔洛韋治療嬰兒人巨細(xì)胞病毒感染的預(yù)后評估指標(biāo)的探討

    2014-07-05 16:38:53李娟
    天津醫(yī)藥 2014年9期
    關(guān)鍵詞:洛韋拷貝數(shù)定量

    李娟

    更昔洛韋治療嬰兒人巨細(xì)胞病毒感染的預(yù)后評估指標(biāo)的探討

    李娟

    目的 探討IE mRNA和pp67 mRNA在更昔洛韋治療后的人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染患兒中的表達(dá)情況。方法在接受更昔洛韋治療前,治療2周和停藥4周時(shí)檢測HCMV患兒總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL);丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)及熒光定量PCR的方法檢測HCMV-DNA拷貝數(shù),IE mRNA和pp67 mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。結(jié)果更昔洛韋治療2周后,患兒肝功能及血HCMVDNA均較治療前降低,停藥4周后TBIL、DBIL、ALT、ALP及HCMV-DNA拷貝數(shù)均較治療前顯著降低,但是與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后2周,仍有12例患兒血液中表達(dá)pp67 mRNA,表達(dá)量顯著低于治療前的pp67 mRNA表達(dá)量,但檢測不到患兒表達(dá)IE mRNA。停藥4周,pp67 mRNA陽性表達(dá)的患兒數(shù)量顯著低于治療2周的患兒數(shù)量,有3例患兒表達(dá)微弱的IE mRNA。2個(gè)基因的mRNA表達(dá)量與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論在更昔洛韋治愈患兒,HCMV-DNA檢測呈現(xiàn)陰性時(shí),應(yīng)再進(jìn)行病毒mRNA檢測,對RNA表達(dá)陽性的患兒,應(yīng)該加強(qiáng)隨訪與復(fù)查,預(yù)防病毒復(fù)發(fā)。

    巨細(xì)胞病毒;嬰兒;更昔洛韋;IE mRNA;pp67 mRNA;病毒檢測

    人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)具有明顯的種屬特異性[1],人類對于該病毒具有較強(qiáng)的易感性,而我國則是HCMV感染的高發(fā)流行地區(qū)。目前針對HCMV的治療方法及效果不滿意[2]。更昔洛韋是目前公認(rèn)的針對HCMV較好的臨床治療藥物[3]。然而,關(guān)于更昔洛韋治療嬰兒HCMV感染的臨床資料還比較缺乏。目前對嬰兒感染HCMV接受治療后的預(yù)后檢測指標(biāo)主要集中于利用DNAPCR方法檢測病毒拷貝數(shù)等[4],缺乏快速明確病毒復(fù)制情況的檢測指標(biāo)。根據(jù)不同時(shí)期表達(dá)RNA分子的差異,可以輔助甄別病毒感染時(shí)期,是目前病毒檢測的新策略。本研究通過對HCMV基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IEA mRNA和pp67 mRNA的檢測,探討mRNA表達(dá)是否可以作為嬰兒HCMV感染及評估預(yù)后的新指標(biāo)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選擇2012年1月—2013年6月我院消化科收治的1~6個(gè)月患兒54例?;純壕鶠橐渣S疸、肝脾腫大、發(fā)熱、咳喘、腹瀉、抽搐為主要癥狀的HCMV感染且肝功能異常。HCMV感染符合參考文獻(xiàn)[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患兒入院后給予更昔洛韋5 mg/kg,每12 h 1次,靜脈滴注治療,同時(shí)靜脈滴注葡醛酸鈉保肝治療。并根據(jù)患兒癥狀分別給予退黃、退熱、止咳平喘、止瀉、止驚等治療。療程2周。2周后部分患兒肝功能仍異常,出院后繼續(xù)口服葡醛內(nèi)酯保肝治療。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 使用的材料均為血清樣本。抽提樣本RNA及相關(guān)PCR實(shí)驗(yàn)均采用Qiagen公司的相應(yīng)試劑盒(Qiagen,德國)。Real-Time PCR儀及數(shù)據(jù)分析軟件購自Life Technologies公司(ABI 7500,Life Technologies,US)。

    1.2.2 生化指標(biāo)的檢測 分別于治療前、治療2周、停藥4周時(shí)抽取患兒股靜脈血1~2 mL,檢測肝功能和HCMVDNA。肝功能各項(xiàng)指標(biāo)均采用試劑盒進(jìn)行檢測,而HCMVDNA則采用裂解液,破碎細(xì)胞,使得病毒顆粒游離,14 000×g離心10 min,取上清,利用熒光定量檢測方法對病毒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量。以上操作均嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

    1.2.3 總RNA提取、定量及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 參照參考文獻(xiàn)[6],Trizol法提取樣本總RNA,并利用紫外分光光度計(jì)檢測提取后的RNA樣本的純度與濃度,根據(jù)樣本檢測的不同波長的光密度比值,確認(rèn)提取得到的RNA樣本的質(zhì)量。RNA樣本的PCR反應(yīng)體系為80 μL,其中包含有4 μg的RNA樣本,dNTP混合物(各200 μmol/L),引物(各100 pmol),鎂離子(1.5 mmol/L),10×擴(kuò)增緩沖液8 μL,聚合酶(4 μL)和三蒸水(68 μL)。構(gòu)建好的反應(yīng)體系充分混勻后,在3 000 r/min的條件下,離心1 min,立即轉(zhuǎn)入65℃水浴,處理5 min,最后將裝有樣本的PCR管放于冰中,待用。在樣本的PCR管中,加入5倍體積的First-strand buffer,0.1 mol/L二硫蘇糖醇,RNase抑制劑(40 U/μL)。充分混勻后,在室溫孵育10 min,然后在65℃孵育2 min。向各管中加入4 μL M–MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,在3 000 r/min的條件下,離心1 min,立即放入37℃水浴,處理50 min后,再放入70℃水浴處理15 min,–20℃保存樣品cDNA。

    1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)IE和pp67基因序列設(shè)計(jì)PCR引物,IE的引物序列為上游5′-TTTGAACGAGTGACCGAGGA-3′,下游5′-CCCAATACACTTCATCTCCT-3′,產(chǎn)物大小110 bp。pp67的引物序列為上游5′-CCTCTGGATGTGGTGGTAT-3′,下游5′-CCTCTGGATGTGGTGGTAT-3′,產(chǎn)物大小400 bp,管家基因β-actin的引物序列為上游5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′,下游5′-GAACCGCTCAATGCCGATAG-3′,產(chǎn)物大小229 bp。熒光定量PCR試驗(yàn)流程參照參考文獻(xiàn)[6]。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性60 s、95℃10 s、退火溫度58℃10 s、72℃20 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溫度變化速度為20℃/s,在每個(gè)循環(huán)的延伸末檢測熒光信號。隨后是一個(gè)緩慢升溫的程序:65℃15 s,95℃10 s,溫度變化速度為0.1℃/s,同時(shí)連續(xù)檢測DNA逐漸變化過程中熒光信號的變化情況,繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線(melting curve),以了解樣品擴(kuò)增的特異性,保障測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用PCR儀自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)各待測基因的PCR擴(kuò)增CT值與相對應(yīng)的β-actin的PCR擴(kuò)增CT值相減得到△CT來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,以2-△CT計(jì)算得出各待測基因產(chǎn)物的相對定量,每管樣品重復(fù)測定3次得到的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,比較采用方差分析,多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 治療前后患兒的肝功能及血HCMV-DNA比較 更昔洛韋治療2周后,患兒肝功能及血HCMVDNA均較治療前降低,停藥4周后總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)及HCMV-DNA拷貝數(shù)均較治療前顯著降低,但是與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

    Tab.1 Comparison of general information for patients before and after drug treatment表1 藥物治療前后患兒肝功能及血HCMV-DNA比較(n=54)

    2.2 治療前后患兒IE及pp67 mRNA的表達(dá) 治療后2周,仍有12例患兒血液中表達(dá)pp67 mRNA,表達(dá)量顯著低于治療前的pp67 mRNA表達(dá)量,但檢測不到患兒表達(dá)IE mRNA。停藥4周,pp67 mRNA陽性表達(dá)的患兒數(shù)量顯著低于治療2周的患兒數(shù)量,有3例患兒表達(dá)微弱的IE mRNA。2個(gè)基因的mRNA表達(dá)量與治療2周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

    Tab.2 Relative mRNA expressions of pp67 and IE mRNA in patients before and after treatment表2 治療前后患者pp67 mRNA及IE mRNA的相對表達(dá)量和陽性患兒數(shù)量

    3 討論

    本研究結(jié)果表明,因HCMV感染的患兒,在接受更昔洛韋治療后,病毒DNA數(shù)量得到顯著的降低,說明了藥物治療的有效性。同時(shí),筆者發(fā)現(xiàn)病毒IE mRNA和 pp67 mRNA也相應(yīng)降低,其中 IE mRNA幾乎檢測不到,而pp67在少數(shù)患者中仍然可以檢測。停藥4周后,進(jìn)行復(fù)查,發(fā)現(xiàn)pp67 mRNA表達(dá)的患者數(shù)量進(jìn)一步降低,但是有3例表達(dá)IE,提示病毒存在復(fù)發(fā)的可能性。

    更昔洛韋是臨床較常用的治療巨細(xì)胞病毒感染的一類藥物,通常用于預(yù)防及治療免疫功能缺陷患者的巨細(xì)胞病毒感染[7-8]。近年來也用于嬰兒HCMV感染。更昔洛韋治療主要是針對HCMV病毒的感染機(jī)制,包括藥物通過滲透作用進(jìn)入病毒DNA,使得DNA復(fù)制受到抑制,同時(shí)還可以通過競爭性抑制DNA聚合酶形成,達(dá)到降低DNA拷貝數(shù)的目的[9]。

    病毒DNA在治療后仍然存在較低量的拷貝數(shù),一方面表明病毒DNA復(fù)制已經(jīng)停止,患兒需要進(jìn)一步加強(qiáng)自身免疫力;另外一方面,也表明體內(nèi)病毒已經(jīng)停止復(fù)制,特別是停藥4周復(fù)查后,病毒數(shù)進(jìn)一步下降的結(jié)果更加證明了這個(gè)結(jié)論。HCMV是一類既含有DNA又含有RNA的病毒[10],因此,筆者在本研究中用熒光定量PCR的方法檢測了RNA表達(dá)情況。結(jié)果表明,盡管病毒DNA復(fù)制已經(jīng)基本停止,但是仍然有一定比例的患兒表達(dá)病毒RNA,提示仍然需要加強(qiáng)日常隨訪。

    按照傳統(tǒng)的DNA檢測標(biāo)準(zhǔn),本研究入組的患兒均已經(jīng)好轉(zhuǎn)并出院,但是mRNA檢測發(fā)現(xiàn),病毒仍然存在復(fù)發(fā)的可能性。因此,應(yīng)該針對此類患兒在出院前檢測相應(yīng)的mRNA表達(dá),對于mRNA陽性表達(dá)的患兒應(yīng)該更加注意隨訪和復(fù)查,降低患兒再次受到HCMV感染的風(fēng)險(xiǎn)。

    [1]Zhao P,Ma DX,Yu S,et al.The development of Chinese specific human cytomegalovirus polyepitope recombinant vaccine[J].Antiviral Res,2012,93(2):260-269.doi:10.1016/j.antiviral.2011.12.005.

    [2]Minces LR,Nguyen MH,Mitsani D,et al.Ganciclovir-resistant cytomegalovirus infections among lung transplant recipients are associated with poor outcomes despite treatment with foscarnet-containing regimens[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(1):128-135.doi:10.1128/AAC.00561-13.

    [3]Gentry BG,Drach JC.Metabolism of cyclopropavir and ganciclovir in human cytomegalovirus-infected cells[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(4):2329-2333.doi:10.1128/AAC.02311-13.

    [4]Ding D,Han S,Wang Z,et al.Does the existence of HCMV components predict poor prognosis in glioma[J]?J Neurooncol,2014,116 (3):515-522.doi:10.1007/s11060-013-1350-9

    [5]Piccirilli G,Chiereghin A,Gabrielli L,et al.Diagnosis and Management of Human Cytomegalovirus Infection in the Mother,Fetus,and Newborn Infant.Diagnosis and monitoring of cytomegalovirus infection by the quantification of viral load in dried blood spots samples [J].Expert Rev Mol Diagn,2014,14(2):139-142.doi:10.1586/ 14737159.2014.883278.

    [6]Ozbek SM,Ozbek A,Yavuz MS.Detection of human cytomegalovirus and Epstein-Barr Virus in symptomatic and asymptomatic apical periodontitis lesions by real-time PCR[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2013,18(5):e811-816.doi:10.4317/medoral.18905.

    [7]Tawse KL,Baumal CR.Intravitreal foscarnet for recurring CMV retinitis in a congenitally infected premature infant[J].J AAPOS,2014, 18(1):78-80.doi:10.1016/j.jaapos.2013.09.015.

    [8]Langner-Wegscheider BJ,ten Dam-van Loon N,Mura M,et al.Intravitreal ganciclovir in the management of non-AIDS-related human cytomegalovirus retinitis[J].Can J Ophthalmol,2010,45(2): 157-160.doi:10.3129/i09-262.

    [9]Ladd B,Ackroyd JJ,Hicks JK,et al.Inhibition of homologous recombination with vorinostat synergistically enhances ganciclovir cytotoxicity[J].DNA Repair(Amst),2013,12(12):1114-1121.doi: 10.1016/j.dnarep.2013.10.008.

    [10]Hook L,Hancock M,Landais I,et al.Cytomegalovirus microRNAs [J].Curr Opin Virol,2014,7C:40-46.doi:10.1016/j.coviro.2014.03.015.

    (2014-04-29收稿 2014-05-23修回)

    (本文編輯 魏杰)

    Prognostic Indicators for Infants Infected HCMV Virus after Ganciclovir Treatment

    LI Juan
    Department of Gastroenterology and Hepatology,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300074,China

    ObjectiveTo study the IE and pp67 mRNA expressions in infants infected human cytomegalovirus (HCMV)after ganciclovir treatment.MethodsThe values of total bilirubin(TBIL),direct bilirubin(DBIL),alanine aminotransferase(ALT)and alkaline phosphatase(ALP)were detected in patients with HCMV before treatment,2 weeks and 4 weeks after treatment.The HCMV-DNA was detected by quantitative PCR.The expression levels of IE mRNA and pp67 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsHCMV DNA stopped copying and the infected infants were cured following the traditional criterion,however,RNA expression was still tested in part of these infants.ConclusionIt should be identified for mRNA expression when HCMV-DNA copies were hardly identified in these infants to prevent from relapse.

    cytomegalovirus;infant;Ganciclovir;IE mRNA;pp67 mRNA;virus identification

    R722.13

    A

    10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.026

    天津市兒童醫(yī)院消化科(郵編300074)

    猜你喜歡
    洛韋拷貝數(shù)定量
    線粒體DNA拷貝數(shù)變異機(jī)制及疾病預(yù)測價(jià)值分析
    威伐光聯(lián)合伐昔洛韋治療帶狀皰疹的療效觀察
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    胎兒染色體組拷貝數(shù)變異與產(chǎn)前超聲異常的相關(guān)性分析
    當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    更昔洛韋治療嬰兒肝炎綜合征的療效觀察
    慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
    泛昔洛韋聯(lián)合微米光治療帶狀皰疹的臨床效果觀察
    DNA序列拷貝數(shù)變化決定黃瓜性別
    在线观看av片永久免费下载| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产在线视频一区二区| 一区二区三区精品91| 大码成人一级视频| 一本一本综合久久| 91成人精品电影| 免费大片黄手机在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 色吧在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 中文天堂在线官网| 欧美国产精品一级二级三级 | a级片在线免费高清观看视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日本黄色片子视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女大奶头黄色视频| 日韩制服骚丝袜av| 午夜老司机福利剧场| 嘟嘟电影网在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品,欧美精品| 色哟哟·www| 精品国产国语对白av| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 久久久午夜欧美精品| 国产成人精品婷婷| 久久久久精品性色| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 美女中出高潮动态图| 国产黄片美女视频| 亚洲欧洲国产日韩| 久久午夜福利片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品乱久久久久久| 精品久久久精品久久久| 免费黄频网站在线观看国产| 寂寞人妻少妇视频99o| 99久久中文字幕三级久久日本| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 特大巨黑吊av在线直播| 伊人久久精品亚洲午夜| 一区二区av电影网| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲精品一区蜜桃| 人体艺术视频欧美日本| 欧美精品国产亚洲| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产永久视频网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 少妇 在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久精品国产亚洲网站| 欧美人与善性xxx| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产成人午夜福利电影在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲成人一二三区av| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品成人在线| 中文字幕av电影在线播放| 久热久热在线精品观看| 国产在线免费精品| 亚洲av男天堂| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产精品国产精品| 大陆偷拍与自拍| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品少妇内射三级| 老女人水多毛片| 在线天堂最新版资源| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜老司机福利剧场| 一个人免费看片子| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 97超碰精品成人国产| 日日啪夜夜撸| av国产精品久久久久影院| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美日本中文国产一区发布| 人人妻人人澡人人看| 久久 成人 亚洲| 亚洲人成网站在线播| 亚洲av二区三区四区| 少妇人妻久久综合中文| 日韩强制内射视频| 99热全是精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲精品色激情综合| 一本一本综合久久| 亚洲性久久影院| 成人黄色视频免费在线看| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 成人毛片60女人毛片免费| 少妇的逼好多水| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲国产精品999| 国产熟女午夜一区二区三区 | 免费看av在线观看网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av福利一区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品国产三级专区第一集| 国产成人一区二区在线| 麻豆成人av视频| 久久久久久伊人网av| 99热国产这里只有精品6| 一级毛片电影观看| 热re99久久国产66热| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 老熟女久久久| 黄色欧美视频在线观看| 久久久精品免费免费高清| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品无大码| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 视频中文字幕在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 日韩一区二区三区影片| 国产一区有黄有色的免费视频| 91久久精品电影网| 日日摸夜夜添夜夜爱| videos熟女内射| 天天操日日干夜夜撸| 国产综合精华液| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产精品国产三级国产av玫瑰| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品不卡视频一区二区| av福利片在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 免费少妇av软件| 久久99精品国语久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久热这里只有精品99| 国产熟女午夜一区二区三区 | 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 免费观看在线日韩| 欧美另类一区| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 99久久精品一区二区三区| 精品熟女少妇av免费看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成年av动漫网址| 国产免费福利视频在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 欧美97在线视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美日韩综合久久久久久| 大片电影免费在线观看免费| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一级毛片电影观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品一区二区三卡| 欧美日韩视频精品一区| 下体分泌物呈黄色| 尾随美女入室| 国产亚洲欧美精品永久| 成年av动漫网址| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜免费鲁丝| 久热这里只有精品99| 少妇丰满av| 亚洲成人手机| 内地一区二区视频在线| 黑丝袜美女国产一区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 青青草视频在线视频观看| 久久热精品热| 伦理电影免费视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 中文字幕久久专区| 亚洲精品视频女| av一本久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 丁香六月天网| videos熟女内射| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 天堂中文最新版在线下载| 最黄视频免费看| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产69精品久久久久777片| 自线自在国产av| 欧美97在线视频| 岛国毛片在线播放| 只有这里有精品99| 七月丁香在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产 精品1| videos熟女内射| 少妇高潮的动态图| 极品人妻少妇av视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 人妻系列 视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲成色77777| 精品亚洲成国产av| 亚洲在久久综合| 国产精品福利在线免费观看| 国产精品三级大全| 精品少妇久久久久久888优播| 99热这里只有是精品50| 国产一区二区在线观看av| 韩国av在线不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 观看美女的网站| 国产高清三级在线| 精品一区二区免费观看| 特大巨黑吊av在线直播| 中文欧美无线码| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲中文av在线| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲国产精品国产精品| 久久精品国产自在天天线| 曰老女人黄片| 欧美最新免费一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 只有这里有精品99| 少妇 在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久狼人影院| 黑人高潮一二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲情色 制服丝袜| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一本久久精品| 国产精品熟女久久久久浪| a级毛色黄片| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久午夜欧美精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品少妇内射三级| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 男人添女人高潮全过程视频| 国产成人精品福利久久| 26uuu在线亚洲综合色| 多毛熟女@视频| 99久久精品国产国产毛片| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲伊人久久精品综合| 99久久综合免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 伦理电影大哥的女人| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久亚洲中文字幕| 美女国产视频在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一区二区av电影网| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 91精品国产九色| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 2021少妇久久久久久久久久久| 黄色配什么色好看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 黄色配什么色好看| 一二三四中文在线观看免费高清| 不卡视频在线观看欧美| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久久视频综合| 丝袜喷水一区| 亚洲怡红院男人天堂| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 美女主播在线视频| 国产一级毛片在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩欧美 国产精品| 大香蕉97超碰在线| 国产成人freesex在线| 免费av中文字幕在线| 夜夜爽夜夜爽视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日本91视频免费播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 我要看黄色一级片免费的| 看十八女毛片水多多多| av国产精品久久久久影院| 人妻一区二区av| 久久久精品94久久精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩av免费高清视频| 久久久a久久爽久久v久久| 视频区图区小说| 女的被弄到高潮叫床怎么办| av福利片在线| 中文字幕亚洲精品专区| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久久精品94久久精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 五月玫瑰六月丁香| 一级爰片在线观看| 高清av免费在线| 国产色婷婷99| 亚洲精品色激情综合| 涩涩av久久男人的天堂| 亚州av有码| 国产色爽女视频免费观看| 桃花免费在线播放| 99热这里只有是精品50| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线观看一区二区三区激情| xxx大片免费视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 777米奇影视久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品色激情综合| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲国产av新网站| 日本91视频免费播放| 桃花免费在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 久热这里只有精品99| 亚洲欧洲日产国产| 国产淫语在线视频| 亚洲精品国产成人久久av| 青春草视频在线免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成人国产麻豆网| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久久久久久久久久丰满| 欧美bdsm另类| 国产乱人偷精品视频| 七月丁香在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品久久久噜噜| 99久久中文字幕三级久久日本| 91成人精品电影| 亚洲精品乱久久久久久| 免费人成在线观看视频色| 精品久久久久久久久av| 97超碰精品成人国产| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久久久久久成人| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99re6热这里在线精品视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 岛国毛片在线播放| 精品久久久精品久久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 成人二区视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99久久人妻综合| 亚洲国产av新网站| 日本欧美视频一区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 在线精品无人区一区二区三| 高清不卡的av网站| 欧美日韩综合久久久久久| 高清欧美精品videossex| 久久99一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 欧美日韩在线观看h| 香蕉精品网在线| 少妇丰满av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品国产av在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 免费大片黄手机在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲国产色片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩伦理黄色片| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产男人的电影天堂91| 国产成人午夜福利电影在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产成人精品福利久久| 春色校园在线视频观看| 男人舔奶头视频| 少妇熟女欧美另类| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 精品人妻熟女av久视频| 免费观看av网站的网址| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费观看无遮挡的男女| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 男男h啪啪无遮挡| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久久久人妻| 国产真实伦视频高清在线观看| 在线观看www视频免费| freevideosex欧美| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩欧美 国产精品| 热99国产精品久久久久久7| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜福利影视在线免费观看| 国产成人精品福利久久| 天堂8中文在线网| 麻豆成人av视频| 一级毛片久久久久久久久女| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产高清有码在线观看视频| 亚洲第一av免费看| av免费在线看不卡| 老熟女久久久| 亚洲怡红院男人天堂| 内地一区二区视频在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| a级毛片在线看网站| 最近手机中文字幕大全| 久久久国产精品麻豆| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人一区二区在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日日啪夜夜爽| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜av观看不卡| 午夜激情福利司机影院| 22中文网久久字幕| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 成人亚洲欧美一区二区av| 日日爽夜夜爽网站| 蜜桃在线观看..| 日韩av免费高清视频| 中文字幕久久专区| 国产亚洲欧美精品永久| 国产日韩欧美在线精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| av在线app专区| 亚洲综合色惰| 老熟女久久久| 日本wwww免费看| 中文字幕免费在线视频6| 免费观看a级毛片全部| 一级av片app| av免费观看日本| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲av免费高清在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 久久国内精品自在自线图片| 一区二区三区精品91| 十八禁高潮呻吟视频 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 婷婷色综合www| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99久久人妻综合| 欧美另类一区| 女人久久www免费人成看片| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久精品国产a三级三级三级| 色哟哟·www| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 我要看日韩黄色一级片| av福利片在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久 成人 亚洲| 永久免费av网站大全| 特大巨黑吊av在线直播| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品熟女久久久久浪| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日本91视频免费播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 久久久久久久久久人人人人人人| 狂野欧美激情性bbbbbb| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 在线观看免费高清a一片| 22中文网久久字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产精品一区www在线观看| 99热国产这里只有精品6| 久久这里有精品视频免费| 国产免费视频播放在线视频| 在线观看av片永久免费下载| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲精华国产精华液的使用体验| 午夜91福利影院| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美性感艳星| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲国产成人一精品久久久| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美+日韩+精品| 久久6这里有精品| 在线天堂最新版资源| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产黄频视频在线观看| 99热这里只有精品一区| 国产成人免费观看mmmm| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 成人国产av品久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 啦啦啦啦在线视频资源| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一区在线观看完整版| 日韩视频在线欧美| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲av国产av综合av卡| tube8黄色片| 久久99热这里只频精品6学生| 交换朋友夫妻互换小说| 伊人久久国产一区二区| 人人澡人人妻人| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | av免费在线看不卡| 免费看光身美女| 亚洲精品日本国产第一区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| kizo精华| 热99国产精品久久久久久7| 日韩伦理黄色片| 欧美高清成人免费视频www| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久久亚洲精品成人影院| 涩涩av久久男人的天堂| 校园人妻丝袜中文字幕| 美女大奶头黄色视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 天美传媒精品一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 丝瓜视频免费看黄片| 精品午夜福利在线看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av日韩在线播放| 丰满少妇做爰视频| 男女无遮挡免费网站观看| 国产高清国产精品国产三级| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品久久久久成人av| 国产精品成人在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 丰满迷人的少妇在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美97在线视频| 视频中文字幕在线观看| av福利片在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 街头女战士在线观看网站| av线在线观看网站|