犬防御素-3基因的真核表達(dá)及活性檢測(cè)

陳征兵，莫永正，張曉明，陳瑞愛，2，羅滿林，2＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東云浮527300）

美國(guó)Lehrer實(shí)驗(yàn)室1980年從兔肺巨噬細(xì)胞中分離得到了一種陽離子性極強(qiáng)的小分子抗菌肽，隨后科研人員從兔和人中性粒細(xì)胞胞漿顆粒中發(fā)現(xiàn)了一系列一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的小分子肽，由于這些小分子肽廣譜的抗微生物活性而被命名為“防御素（defensins）”。

防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子活性肽，主要存在于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞，并根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)特性可以分為α、β和θ防御素［1］；哺乳動(dòng)物防御素通過與病原體生物膜直接的相互作用不但可以殺滅病原菌［2］，而且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用［3-4］，這些內(nèi)源性短肽是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的天然抗生素，代表著抵御病原體感染的一種天然防御機(jī)制［5-6］。與植物或昆蟲防御素相比，哺乳動(dòng)物防御素?fù)碛懈鼮閺V泛的抗菌譜［7］；已經(jīng)有關(guān)于從組織中分離的犬β防御素的報(bào)道。犬防御素屬于β防御素家族，抗菌范圍廣，其對(duì)革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（如大腸埃希菌）、白色念珠菌和一些支原體（如解脲支原體）均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但也有研究表明，當(dāng)鹽濃度高于140 mmol／L時(shí)，其抗菌活性逐漸減弱。本試驗(yàn)采用人工合成犬防御素-3基因，整合至畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，并通過瓊脂空穴擴(kuò)散法測(cè)定其抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌DH 5ɑ、金黃色葡萄球菌和畢赤酵母菌株X33 均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、TaqDAN 聚合酶，F(xiàn)ermenntas公司產(chǎn)品；DNA Marker、pMD18-T Simple Vector、T4DNA Ligase，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨和酵母提取物，OXOID 公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉 雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨，Sigma公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，OMEGA 公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 基因合成 根據(jù)NCBI（基因登錄號(hào)：NM-001024641.1）發(fā)表的犬防御素-3氨基酸序列，參照趙翔［8］畢赤酵母偏好性密碼子設(shè)計(jì)基因，并添加終止密碼子TAA，送上海英濰捷基全基因合成。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)改造后的密碼子序列設(shè)計(jì)合成了4條引物，分別用于擴(kuò)增目的基因和重組表達(dá)載體質(zhì)粒檢測(cè)，并在上下游引物分別添加EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物序列如表1所示。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增 以P1、P2為引物，合成的犬防御素-3基因?yàn)槟０?，用TaqDNA 聚合酶擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件為，95 ℃5 min；95 ℃30s，60 ℃30s，72 ℃45s，35 個(gè)循環(huán)；終延伸10 min；PCR 產(chǎn)物預(yù)計(jì)大小252bp。

1.2.4 pMD18-T-cbd-3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 膠回收PCR 產(chǎn)物，連接pMD18-T Simple Vector，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，Amp＋抗性瓊脂平板篩選重組子；搖菌，PCR鑒定，抽提質(zhì)粒，EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定，并將陽性克隆送上海立菲生物公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 pPiczɑC-cbd-3重組質(zhì)粒構(gòu)建 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-cbd-3 與酵母表達(dá)載體PpiczɑC，用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，連接回收片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH 5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，Zeocin抗性瓊脂平板篩選陽性克隆，用AOXP1、AOXP2引物作PCR鑒定和EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定后，將陽性克隆送往上海立菲生物公司測(cè)序。

1.2.6 pPiczɑC-cbd-3轉(zhuǎn)化及鑒定 抽提測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pPiczɑC-cbd-3，SacⅠ線性化重組質(zhì)粒，膠回收線性化質(zhì)粒，取20μL回收產(chǎn)物和80μL X33感受態(tài)細(xì)胞混勻，加入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)1 500V，25μF，200Ω，5ms；迅速加入1mL冰預(yù)冷1mol／L的山梨醇，28 ℃靜置1.5h，然后加入1mL YPD 振蕩培養(yǎng)1h；4 000r／min 離心5 min，棄上清，沉淀物涂YPDS（ZeocinTM）抗性瓊脂平板，28 ℃靜置培養(yǎng)3d～5d，挑取平板菌落，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.2.7 陽性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá) 將PCR鑒定為陽性的克隆接種至BMGY 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值為2.0～6.0，離心培養(yǎng)物棄上清，沉淀用BMMY 稀釋至OD值為1.0后進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)72h，每間隔24h加入甲醇至終濃度為10mL／L，并取樣測(cè)定蛋白濃度。

1.2.8 表達(dá)蛋白Tricine-SDS-PAGE 檢測(cè) 取一定量的誘導(dǎo)表達(dá)物，12 000r／min離心5 min，取上清，按比例加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水浴煮沸5min，12 000 再次離心5 min，上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.9 表達(dá)蛋白活性檢測(cè) 取適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液加入一定量45 ℃的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基（經(jīng)高壓滅菌）中，待培養(yǎng)基凝固后打孔，分別加入蛋白表達(dá)產(chǎn)物、空載體表達(dá)產(chǎn)物、空酵母培養(yǎng)液、氨芐青霉素陽性對(duì)照，先置4 ℃冰箱培養(yǎng)2h，然后置于37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增

以人工合成的基因cbd-3 為模板，用引物P1、P2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，20g／L瓊脂糖電泳凝膠檢測(cè)，得到了與預(yù)期大小（252bp）一致的目的條帶（圖1）。

圖1 PCR 目的基因的擴(kuò)增Fig.1 PCR amplifications of target gene

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T cbd-3的雙酶切鑒定

抽提質(zhì)粒pMD18-T cbd-3，經(jīng)EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定，得到2條片段，1條大小2 700bp左右，另一條250bp左右，結(jié)果與預(yù)期相同（圖2）。

圖2 pMD18-T simple-cbd-3的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of pMD18-T simple-cbd-3

2.3 重組質(zhì)粒pPiczɑC-cbd-3的雙酶切鑒定

抽提質(zhì)粒pPiczɑC-cbd-3，經(jīng)EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定，得到2條片段，1條大小3 600bp左右，另1條250bp左右，結(jié)果與預(yù)期相同（圖3）。

2.4 酵母轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

酵母重組質(zhì)?？寺∮媒湍富虺樘嵩噭┖谐樘峄颍琍CR鑒定，在預(yù)期位置獲得了目的條帶（圖4）。

圖3 pPiczɑC-cbd-3的雙酶切鑒定

圖4 重組酵母菌的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant yeast

2.5 表達(dá)蛋白的檢測(cè)

將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物離心濃縮后，與5×SDS 上樣緩沖液混勻，沸水浴變性處理后，Tricine-SDSPAGE檢測(cè)，在8.5ku處出現(xiàn)目的條帶（圖5）。

圖5 目的蛋白Tricine-SDS-PAGE的檢測(cè)Fig.5 Tricine-SDS-PAGE detection of the objective protein

2.6 抑菌活性檢測(cè)

瓊脂空穴擴(kuò)散法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抑菌活性，結(jié)果顯示表達(dá)的犬防御素-3對(duì)革蘭陰性菌（大腸埃希菌DH5ɑ）和革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）均有一定的抑菌活性（圖6）。

圖6 犬防御素-3對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory action of the expressed cbd-3to Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 討論

犬β防御素（-1，-2，-3）雖然都屬于犬β防御素家族，但存在部位有一定差異；原位雜交實(shí)驗(yàn)證明cbd-1主要存在于曲細(xì)精管支持細(xì)胞，cbd-2主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞，cbd-3主要在支持細(xì)胞，這說明犬β防御素主要表達(dá)在犬睪丸組織［9］。當(dāng)犬遭遇病原體感染時(shí)，犬防御素就會(huì)在體內(nèi)高效表達(dá)以抑制泌尿生殖道的病原體。鑒于犬防御素的作用機(jī)制和抗菌活性，本研究選擇巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)cbd-3，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種優(yōu)秀的表達(dá)系統(tǒng)具備了其他表達(dá)系統(tǒng)不具備的優(yōu)點(diǎn)［10］，既克服了大腸埃希菌表達(dá)雜蛋白多，表達(dá)蛋白多以包涵體形式存在外，也避免了昆蟲表達(dá)細(xì)胞操作復(fù)雜，投入和產(chǎn)出嚴(yán)重不成比例的缺點(diǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)不但能高效表達(dá)重組蛋白，而且能對(duì)表達(dá)蛋白加工修飾。因此本試驗(yàn)選擇利用甲醇能力強(qiáng)，生長(zhǎng)快的X-33酵母表達(dá)菌株和分泌型表達(dá)載體，能夠?qū)⒈磉_(dá)產(chǎn)物直接分泌到酵母培養(yǎng)基中，這樣不但避免了表達(dá)產(chǎn)物在菌體內(nèi)的堆積和對(duì)細(xì)胞毒害，同時(shí)也由于縮短了破碎菌體對(duì)蛋白的損傷；但對(duì)于載體系列來說，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的重點(diǎn)是要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確；由于本試驗(yàn)中表達(dá)目的蛋白分子量相對(duì)較小，為避免多余氨基酸序列對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，因此在合成基因的時(shí)候，在目的基因末端添加了終止密碼子序列。由于畢赤酵母沒有天然質(zhì)粒，犬防御素-3通過SacⅠ線性化后以同源重組的方式整合至酵母基因組染色體內(nèi)，這樣不但增加了基因重組幾率，而且重組表達(dá)框更加穩(wěn)定。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)過程中伴隨著液泡蛋白酶和分泌途徑蛋白酶的產(chǎn)生，培養(yǎng)過程中，由于細(xì)胞密度不斷增加以及部分細(xì)胞的裂解，蛋白酶從胞液釋放到培養(yǎng)基中，致使目的蛋白被降解。蛋白酶降解目的蛋白是酵母表達(dá)系統(tǒng)共有缺陷，培養(yǎng)過程中，外源蛋白和蛋白酶都會(huì)不斷地釋放到培養(yǎng)基中，蛋白分泌和降解就同時(shí)發(fā)生了，降解發(fā)生的結(jié)果不僅導(dǎo)致目的蛋白的產(chǎn)率下降，降解產(chǎn)生的氨基酸片段又給目的蛋白的純化帶來了困難，尤其是像本研究中表達(dá)的短肽，常規(guī)的分離方法很難將目的蛋白和降解產(chǎn)物分離開來，導(dǎo)致產(chǎn)品回收率下降，產(chǎn)品純度進(jìn)一步降低，蛋白的比活性降低，因此，做畢赤酵母表達(dá)時(shí)有必要采取一定措施減少蛋白酶的降解作用和提高外源蛋白的穩(wěn)定性，主要方法有培養(yǎng)基中添加10g／L酪氨酸水解物，在不影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)的情況下調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 等。

本研究中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PAGE 電泳分析，在8.5ku左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致，同時(shí)瓊脂空穴擴(kuò)散法檢測(cè)出現(xiàn)了抑菌圈，說明cbd-3在畢赤酵母中成功表達(dá)；研究選擇大腸埃希菌DH 5α和金黃色葡萄球菌作為抑菌活性的指示菌，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物抑菌效果和一定量氨芐青霉素陽性對(duì)照比較效果較差；根據(jù)抑菌圈大小判斷，表達(dá)產(chǎn)物和已報(bào)道的天然犬防御素-3 成熟肽也有不小差距，這可能是因?yàn)槌墒祀脑诒磉_(dá)中被進(jìn)行了影響結(jié)構(gòu)與活性的無關(guān)修飾［11］，因此繼續(xù)篩選高表達(dá)菌株和提高其抗菌活性將是下一步的研究工作重點(diǎn)。

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