銀川地區(qū)規(guī)?；瞿膛Ｒ略w病與布魯菌病的血清學(xué)調(diào)查

李永琴，趙世媛，高菊梅，黃 龍，劉溪源，李曉娜，許立華

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

衣原體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，其廣泛存在于世界各地，可以引起動(dòng)物和人的多種疾病，特別是鸚鵡熱嗜性衣原體和流產(chǎn)嗜性衣原體能夠使禽類和多種動(dòng)物感染，引起一種地方流行性的接觸性人畜共患傳染病［1-2］。妊娠母牛感染衣原體后在臨床上表現(xiàn)為流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)出弱犢、胎衣不下等繁殖障礙癥狀，有的甚至發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、乳房炎、輸卵管炎及產(chǎn)奶量下降。新生犢牛表現(xiàn)出腸炎、多關(guān)節(jié)炎、支氣管肺 炎、腹瀉等癥狀［3-4］。1949 年Stamp 和Nisbeth首次在蘇格蘭報(bào)道了該病的發(fā)生［5］，隨后我國于20世紀(jì)70年代從羊身上分離到了衣原體，之后有關(guān)衣原體病的報(bào)道不在少數(shù)。周繼章等［6］2007年統(tǒng)計(jì)有11個(gè)省（市）報(bào)道有牛衣原體病的流行，隨后青海［7-8］、寧夏［9］、貴州［10］等?。▍^(qū)）也有血清學(xué)調(diào)查報(bào)道，這些從一個(gè)側(cè)面反映了動(dòng)物衣原體病的的流行在不斷的上升。牛衣原體病給奶牛場造成的損失不僅僅是胎兒夭折，更嚴(yán)重的是產(chǎn)奶量與正常分娩牛相比，大幅度減少，同時(shí)造成飼料、人力巨大浪費(fèi)和巨額醫(yī)藥費(fèi)開支。對(duì)養(yǎng)殖業(yè)尤其是對(duì)奶牛業(yè)造成重大危害。

布魯菌病是由布魯菌引起的人獸共患慢性細(xì)菌性傳染病。布魯菌病在全世界范圍內(nèi)廣泛分布。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，在全世界200 多個(gè)國家中，有170多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)人、畜布魯菌病的存在和流行。全球有布魯菌病患者近100萬例，而且每年以新發(fā)病例1萬～2萬例的速度增加［11］。在我國，布魯菌病是國家規(guī)定的二類法定傳染病，布魯菌病的流行情況亦不容樂觀。據(jù)報(bào)道，截止2010年全國29個(gè)省（區(qū)、市）發(fā)生畜間布魯菌病，牛、羊、豬感染達(dá)百萬頭之多，人間布魯菌病2010年全年新增病例3.7萬例［12］。

布魯菌可通過體表皮膚黏膜、消化道、呼吸道，也可由吸血蚊蟲叮咬而侵入機(jī)體［13］。主要危害生殖器官，在家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生，還可傳染給人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部炎癥等特征癥狀［14］。我國每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失也達(dá)數(shù)億元。該病危害大、流行廣，不僅影響奶牛業(yè)的健康發(fā)展，也嚴(yán)重威脅人類健康，是目前世界上嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，并被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫?。?5］。

近期銀川一些規(guī)模化奶牛場部分奶牛出現(xiàn)疑似衣原體病、布魯菌病的癥狀，為了確診其病因，了解近期銀川地區(qū)衣原體病及布魯菌病的流行情況，制定牛群的防控方案。筆者及課題組成員對(duì)牛群進(jìn)行衣原體與布魯菌病的血清學(xué)檢測?，F(xiàn)將檢測結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢血清 自銀川地區(qū)A、B、C、D、E、F 6個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場，隨機(jī)抽取了244份血樣，無菌分離血清，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 衣原體IHA 稀釋液，批號(hào)130905；衣原體IHA 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號(hào)：1301115；衣原體IHA 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，批號(hào)：1301115。衣原體IHA抗原，批號(hào)：130524。以上試劑均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制。布魯菌平板凝集抗原及試管凝集抗原，易邦公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)器械 96 孔V 型反應(yīng)板、5μL～100μL移液器、玻璃板、微量振蕩器、恒溫箱、冰箱。

1.2 方法

1.2.1 衣原體間接血凝（IHA）試驗(yàn) ①鋪板：用移液器在96孔110°V 型反應(yīng)板上每孔加衣原體IHA稀釋液75μL；②稀釋血清：用移液器吸取25μL 待檢血清加入第一孔，然后以4倍遞增稀釋，從第一孔稀釋到第三孔，到第三孔棄去25μL，保持孔內(nèi)液體量為75μL。同一板上同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照各2組（稀釋方法同上）；③加入抗原：每孔加入稀釋好的抗原25μL，置于微量振蕩器上振蕩2 min，之后蓋上玻璃板，置于37 ℃恒溫箱中作用2h。

1.2.2 衣原體間接血凝（IHA）試驗(yàn)結(jié)果判定 ①判定標(biāo)準(zhǔn)：“＋＋＋＋”紅細(xì)胞全部凝集，形成一層均勻的膜，布滿整個(gè)孔底；“＋＋＋”紅細(xì)胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者稍?。弧埃奔t細(xì)胞在孔底形成薄層凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀；“＋”紅細(xì)胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圓點(diǎn)；“±”紅細(xì)胞沉于孔底，但周圍不光滑或中心有空斑；“-”紅細(xì)胞完全沉積于底，呈光滑的圓點(diǎn)；“＋＋”以上的凝集判為陽性凝集，②對(duì)照試驗(yàn)出現(xiàn)如下結(jié)果試驗(yàn)方可成立，否則需要重試，陽性血清＋抗原呈“＋＋＋＋”；陰性血清＋抗原呈“-”；抗原＋生理鹽水呈“-”，③被檢樣品判定標(biāo)準(zhǔn)：哺乳動(dòng)物血清效價(jià)≥1∶64（＋＋）者判為陽性；效價(jià)≤1∶16（＋＋）者判為陰性；介于二者之間判為可疑。

1.2.3 布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn) ①檢測方法：按照農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)》中規(guī)定的技術(shù)要求進(jìn)行操作，血清以布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）初篩，吸取20μL滴于潔凈玻璃板上，加入20μL虎紅平板凝集抗原，混勻后4min，陽性或疑似陽性的樣品用布魯菌病試管凝集試驗(yàn)（SPT）方法進(jìn)行確認(rèn)；②判斷標(biāo)準(zhǔn) 以出現(xiàn)50%凝集（＋＋）的血清最大稀釋度作為該被檢血清的凝集價(jià)，當(dāng)凝集價(jià)1∶100以上時(shí)判為陽性，1∶50～1∶100之間判為可疑，1∶50以下判為陰性。

2 結(jié)果

2.1 衣原體間接血凝（IHA）試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)銀川地區(qū)6個(gè)規(guī)?；?44份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，檢測的244份血清中，陽性總檢出率為25%，牛群最高檢出率為38.3%，最低為0（表1）。

表1 衣原體間接血凝（IHA）試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of Chlamydia indirect hemagglutination test

2.2 布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測結(jié)果

對(duì)銀川地區(qū)6個(gè)規(guī)?；?44份血清樣品進(jìn)行布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測，結(jié)果顯示，244份血清中布魯菌陽性總檢出率為34.3%，牛群最高陽性檢出率為66.6%，最低陽性檢出率為12%（表2）。

表2 布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測結(jié)果Table 2 The results of rose bengal plate agglutination and tube agglutination test for brucellosis

3 討論

通過對(duì)銀川地區(qū)6個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場進(jìn)行衣原體的血清學(xué)抽檢調(diào)查，結(jié)果表明，在這244份血清中平均陽性率為25%，牛群最高陽性率為38.3%，最低為0。這與何存利等［16］的調(diào)查結(jié)果基本一致。近一段時(shí)間，銀川地區(qū)這些規(guī)?；龅牟糠帜膛３霈F(xiàn)不同程度的率配不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)或死產(chǎn)等繁殖障礙癥狀，并伴有呼吸道癥狀，產(chǎn)奶量也不同程度下降。而且不同程度地存在犢牛肺炎、腸炎、關(guān)節(jié)炎的癥狀。在此之前進(jìn)行的細(xì)菌學(xué)檢測以及牛病毒性腹瀉-黏膜病的檢測都不能確定其主要病因。本次衣原體的血清學(xué)檢測說明衣原體感染在銀川地區(qū)已然存在廣泛，一些牛場母畜發(fā)生的繁殖障礙可能與衣原體的感染有關(guān)，并且有可能是造成母畜不孕、早產(chǎn)以及犢牛腸炎、關(guān)節(jié)炎等的主要原因之一。規(guī)?；B(yǎng)殖場應(yīng)對(duì)奶牛衣原體的感染予以高度重視。

衣原體病的綜合防控方面，筆者建議重點(diǎn)從以下幾方面著手：①嚴(yán)格貫徹執(zhí)行獸醫(yī)防疫衛(wèi)生措施，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意清潔衛(wèi)生，減少應(yīng)激因素對(duì)牛群的不良影響，一旦發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)、死胎，對(duì)胎兒、胎膜、子宮排出物等進(jìn)行無害處理和徹底消毒。對(duì)已污染的畜棚、環(huán)境用20mL／L～50mL／L來蘇兒或20g／L氫氧化鈉等有效消毒劑迸行嚴(yán)格消毒，以有效控制該病傳染的機(jī)會(huì)；②加強(qiáng)檢疫工作力度，力求從源頭上凈化牛群。由于該病在臨床感染上經(jīng)常以隱性感染為主，很少引起明顯癥狀，而且隱性感染?？砷L期帶毒，引起衣原體病的傳播與暴發(fā)［17］。因此，規(guī)?；B(yǎng)殖場應(yīng)當(dāng)定期進(jìn)行衣原體血清學(xué)檢測，檢出陽性牛應(yīng)及時(shí)淘汰或治療，以徹底凈化牛群。并且牛場從外引進(jìn)奶牛時(shí)，必須加強(qiáng)檢疫，對(duì)新引進(jìn)的牛群應(yīng)采取隔離觀察措施，防止疫病傳入。對(duì)于檢出疑似的牛，可用四環(huán)素類藥物（如長效土霉素）進(jìn)行及時(shí)治療；③把衣原體病的免疫接種和防控工作納入牛場主要工作議程，定期對(duì)牛群進(jìn)行衣原體的預(yù)防接種。

通過對(duì)采集的244 份血清進(jìn)行布魯菌病的檢測，結(jié)果顯示，陽性有84份，平均陽性率為34.3%，牛群最高陽性率為66.6%，最低為12%。此次調(diào)查結(jié)果與張永康等［18］的調(diào)查結(jié)果相比，陽性率較高。但是我們不能確定是因?yàn)椴剪斁≡谂Ｈ褐械母腥韭噬仙?。因?yàn)槟壳般y川地區(qū)的養(yǎng)殖場普遍都進(jìn)行針對(duì)布魯菌病的弱毒疫苗接種，對(duì)布魯菌病檢出陽性者，存在兩種可能，一種是自然感染布魯菌病的牛，另一種是接種過弱毒疫苗的牛。因?yàn)楫?dāng)前的布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)及試管凝集試驗(yàn)并不能對(duì)這兩種可能進(jìn)行判別。但檢測結(jié)果顯示的陰性結(jié)果過多，由于在進(jìn)行布魯菌病調(diào)查之前，牛場都不同時(shí)間進(jìn)行了布魯菌病的弱毒疫苗接種。所以對(duì)于檢測結(jié)果出現(xiàn)的過多陰性，說明疫苗在牛群中的免疫保護(hù)力及保護(hù)期未達(dá)到預(yù)期效果。這樣就使得牛群中存在著布魯菌病的大量易感牛，牛群感染布魯菌病的機(jī)率較大。檢測結(jié)果為陽性的牛中就有可能存在著自然感染布魯菌病牛，并成為牛群中的傳染源，感染牛群，造成母畜繁殖障礙。所以此次銀川地區(qū)規(guī)?；龀霈F(xiàn)的母畜繁殖障礙就有可能與布魯菌的感染有關(guān)。所以為了防控此類疫情的發(fā)生，養(yǎng)殖場必須實(shí)行以加強(qiáng)檢疫凈化為主的綜合性防御措施。需要對(duì)牛群中布魯菌的抗體消長水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，避免牛群中出現(xiàn)易感牛；可通過進(jìn)一步的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)確定有無自然感染牛，若存在則需淘汰；牛場需在外引進(jìn)牛時(shí)，必須加強(qiáng)檢疫，確保牛只健康后方可合群。

針對(duì)本次銀川地區(qū)出現(xiàn)的疫情，我們了解到衣原體已在銀川地區(qū)這些規(guī)?；鲋写嬖趶V泛。雖然之前也有對(duì)銀川地區(qū)衣原體病的相關(guān)報(bào)道，但并未引起本地區(qū)養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)其重視，因此此次疫情給養(yǎng)殖場帶來了比較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本次血清學(xué)調(diào)查雖并不能確定布魯病是為本次疫情的主要原因之一，但是它所存在的安全隱患不容忽視。衣原體病與布魯病均為嚴(yán)重危害人類及家畜健康的人畜共患病，若同時(shí)存在與場群之中，將嚴(yán)重影響?zhàn)B殖場的經(jīng)濟(jì)效益以及養(yǎng)殖人員的公共衛(wèi)生安全。因此，養(yǎng)殖企業(yè)需對(duì)這兩種疾病引起一定的重視，及時(shí)進(jìn)行疫情的防控與治療。

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