高脂血癥大鼠模型幾種造模方法的篩選及優(yōu)化

孫 赫，梁桂洪，林勇凱，黃宇新

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405）

高脂血癥，即血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）的增高以及高密度脂蛋白（HDL）的降低，是脂質(zhì)代謝障礙的表現(xiàn)，也是動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病、脂肪肝和中風(fēng)的主要危害因素［1-3］。近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活水平及模式的變化，高脂血癥的發(fā)病率逐年升高，尤其是中老年人，高脂血癥是腦卒中、冠心病、心肌梗死、心肌猝死等的危險(xiǎn)因素，因此越來越引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。高脂血癥機(jī)體調(diào)節(jié)血脂的能力和血管機(jī)能狀態(tài)可以通過血清髓過氧化物酶（MPO）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量體現(xiàn)，后二者反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度和清除自由基的能力。而脂質(zhì)的過氧化易引發(fā)NO 生成減少，MPO 可降低NO 的生物活性，最終加劇了炎性反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等，發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。研究高脂血癥的關(guān)鍵是選擇理想的高脂血癥動(dòng)物模型，本研究在查閱文獻(xiàn)［4-8］的基礎(chǔ)上，選取并改進(jìn)了其中3種喂養(yǎng)造模法，觀察不同時(shí)間大鼠血脂、血清超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮和髓過氧化物酶水平的變化，篩選及優(yōu)化出省時(shí)、省力而且經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定的高脂血癥大鼠模型的理想建立方法，以建立與人類高脂血癥的發(fā)病機(jī)制相同或相近的高血脂動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40只，雄性，體重180g～220g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0020。

1.1.2 造模材料 食用油，廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)品；膽固醇、丙硫氧嘧啶和膽酸鈉，上海藍(lán)基生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為100521，100510，100421；吐溫80，廣州威佳濟(jì)恒科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：103170。

1.1.2.1 高脂飼料配方 基礎(chǔ)飼料56.8%＋食用油15%＋蛋黃粉10%＋蔗糖10%＋膽固醇6%＋膽酸鈉2%＋丙基硫氧嘧啶0.2%。

1.1.2.2 高脂乳劑配方 吐溫60%＋食用油15%＋膽固醇6%＋膽酸鈉2%＋丙基硫氧嘧啶0.2%。具體制備方法為：①食用油在80℃水浴中攪拌加熱；②于加熱后的食用油中加入膽固醇和丙基硫氧嘧啶，充分?jǐn)嚢枞芙?；③再加入膽鹽和適量蒸餾水，充分?jǐn)嚢枋鼓扄}溶解；④再加適量吐溫，充分?jǐn)嚢柚敝廉a(chǎn)生乳化現(xiàn)象；⑤緩慢加入37 ℃的溫水稀釋至100mL，即可成為穩(wěn)定的高脂乳劑。保存于-20 ℃冰箱中備用，大鼠灌胃前于80 ℃水浴中加熱融化。

1.1.3 試劑 氯化鈉注射液9g／L，武漢市濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)：120120906；維生素D3注射液1mL∶7.5g／30萬單位，哈爾濱市宏達(dá)動(dòng)物藥品廠產(chǎn)品，批號(hào)：080021417；TC、TG、LDLC、HDL-C 試劑盒，南京建成科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為S10020062，S10030054，S10020071，S10030023；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，丙二醛（MDA）試劑盒，一氧化氮（NO）試劑盒，髓過氧化物酶（MPO）試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批 號(hào)：20130902，20130823，20130824，20130831。

1.1.4 儀器設(shè)備 BP121S型電子天平，美國塞多利公司產(chǎn)品；TGL-16M 型高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司產(chǎn)品；FYL-YS-128L 型-20 ℃冰箱，北京福意電器有限公司產(chǎn)品；Forma 88000 系列-86 ℃超低溫冰箱，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；UV-7504型單光束紫外可見分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品；Ultra Pure UF型和泰凱弗隆實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；DG5033A 型酶標(biāo)儀，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；FinnPiPette移液槍。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 40只大鼠在室溫下23℃±2℃自由飲水，常規(guī)喂飼基礎(chǔ)飼料1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組Ⅰ、模型組Ⅱ、模型組Ⅲ，每組10只。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備 空白組大鼠給予基礎(chǔ)飼料，每只進(jìn)食量30g／d，分三餐定時(shí)定量給予，并按10mL／（kg·d）的容量生理鹽水灌胃。各模型組分別采用不同造模方法誘導(dǎo)高脂血癥大鼠模型，模型組Ⅰ：高脂飼料配方飼喂造模；模型組Ⅱ：基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)配合高脂乳劑灌胃法，按10mL／（kg·d）的容量高脂乳劑給予大鼠，灌胃；模型組Ⅲ：造模前，一次性腹腔注射維生素D3600 000 U／kg后，造模方法同模型組Ⅱ。

1.2.3 樣品制備及檢測(cè) 分別于造模1周、3周和5周，末次給高脂乳劑16h 后，用乙醚氣體麻醉大鼠，用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行眥內(nèi)靜脈采血2 mL，全血樣本室溫放置1h，3 000r／min離心10min，取上清液為樣品，采用ELISA 法分別檢測(cè)總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和髓過氧化物酶（MPO）等指標(biāo)的水平，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)一系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD 450nm 值，通過CurveExpert1.3 軟件分析并分別得到TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、MDA、NO、MPO 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及其方程式，將樣品OD 450值代入方程式，分別計(jì)算TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、NO、MPO 的含量及SOD 活力。

1.2.4 大鼠肝指數(shù)計(jì)算方法 大鼠肝指數(shù)＝［大鼠肝臟質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）］×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以±SD表示，多組間比較用單因素方差分析，采用LSD多重比較方法比較組間的變量差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模1周各組大鼠血脂指標(biāo)

與空白組比較，模型組Ⅰ與模型組Ⅱ中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平差異不顯著（P＞0.05）；模型組Ⅲ中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

表1 造模1周各組大鼠的血脂指標(biāo)Table 1 The levels of lipid parameters of the rats in each group at the end of 1week after modeling

2.2 造模3周各組大鼠血脂指標(biāo)

與空白組比較，模型組Ⅰ中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平差異不顯著（P＞0.05），模型組Ⅱ中TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平差異不顯著（P＞0.05），模型組Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組Ⅱ與比較，模型組Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）（表2）。

表2 造模3周各組大鼠的血脂指標(biāo)Table 2 The levels of lipid parameters of the rats in each group at the end of 3weeks after modeling

2.3 造模5周各組大鼠血脂指標(biāo)

與空白組比較，模型組Ⅰ中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 水平差異不顯著（P＞0.05），模型組Ⅱ、模型組Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組Ⅱ比較，模型組Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）（表3）。

2.4 造模5周各組大鼠血清SOD活性、MPO、NO和MDA水平變化結(jié)果分析

與空白組比較，模型組Ⅰ中4項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05），模型組Ⅱ、模型組Ⅲ中MPO、NO、MDA 水平顯著升高，SOD 活性顯著降低（P＜0.05）。與模型組Ⅱ比較，模型組Ⅲ中MPO、NO、MDA 水平顯著升高，SOD 活性顯著降低（P＜0.05）（表4）。

2.5 各組大鼠的體重和肝指數(shù)變化

開始造模第2周后，與空白組對(duì)比，模型組Ⅱ、模型組Ⅲ中體重顯著升高（P＜0.05）；第4周后，與空白組、模型組Ⅰ對(duì)比，模型組Ⅱ、模型組Ⅲ中體重顯著升高（P＜0.05）；第6周后，與空白組對(duì)比，模型組Ⅰ、模型組Ⅱ和模型組Ⅲ中體重顯著升高（P＜0.05），與模型組Ⅰ對(duì)比，模型組Ⅱ中體重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。與空白組對(duì)比，模型組Ⅱ、模型組Ⅲ中肝指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組Ⅰ對(duì)比，模型組Ⅱ中肝指數(shù)無顯著差異（P＞0.05），模型組Ⅲ中肝指數(shù)顯著升高（P＜0.05）（表5）。

表3 造模5周各組大鼠的血脂指標(biāo)Table 3 The levels of lipid parameters of the rats in each group at the end of 5weeks after modeling

表4 各組大鼠血清SOD活性、MPO、NO、MDA含量水平Table 4 The levels of SOD，MPO，NO，MDA of the rats in each group

表5 各組大鼠的體重和肝指數(shù)Table 5 The levels of body weight and the liver index of the rats in each group

3 討論

要建立合理且實(shí)用的高脂血癥動(dòng)物模型，在模型動(dòng)物的選擇上，需考慮造模動(dòng)物脂質(zhì)代謝、對(duì)膳食脂質(zhì)調(diào)節(jié)、生理功能反應(yīng)等應(yīng)盡可能與人類相似，能較準(zhǔn)確的反映人類高脂血癥的各種變化，從而為人類高脂血癥的預(yù)防、治療提供思路。本次動(dòng)物試驗(yàn)，在高脂飼料的配方中以市售食用油取代了豬油，試驗(yàn)結(jié)果證明，此配方同樣可以建立高脂血癥的動(dòng)物模型，形成動(dòng)物脂代謝紊亂。同時(shí)，食用油取代豬油的高脂血癥動(dòng)物模型，更接近目前人們的飲食狀況。本試驗(yàn)通過檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C 的水平來衡量血脂變化情況［9-10］，為篩選理想的高脂血癥大鼠模型提供依據(jù)，其4項(xiàng)血脂指標(biāo)結(jié)果支持上述研究文獻(xiàn)觀點(diǎn)。

現(xiàn)代研究表明，高脂血癥機(jī)體調(diào)節(jié)血脂的能力和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和機(jī)體的脂質(zhì)過氧化所造成的損傷有關(guān)，且血清過氧化脂質(zhì)的含量與血清TC 呈正相關(guān)［9、11-12］。脂質(zhì)的過氧化易引發(fā)NO 生成減少，導(dǎo)致其生物利用度降低，繼而誘發(fā)氧化應(yīng)激，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，加劇炎性反應(yīng)［13-14］。另一方面，NO 生成減少，又造成內(nèi)皮依賴性舒張功能調(diào)節(jié)失衡、血管張力增加、結(jié)構(gòu)重建和內(nèi)皮損傷［15］。而髓過氧化物酶（MPO）為血紅素過氧化物酶超家族成員之一，是氧化應(yīng)激的一個(gè)主要標(biāo)志物，能通過調(diào)節(jié)NO 對(duì)血管信號(hào)傳遞和舒張的作用。其含量增多能直接改變血管的炎癥反應(yīng)性，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮功能障礙［16］。故髓過氧化物酶（MPO）和NO 水平則反應(yīng)血管內(nèi)皮的功能狀態(tài)。此外，SOD 是體內(nèi)特異除超氧陰離子的一種抗氧化酶，調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化和抗氧化的平衡［17］。高脂血癥時(shí)會(huì)直接損傷動(dòng)脈壁抗氧化機(jī)能，使動(dòng)脈壁內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，進(jìn)而又使機(jī)體脂質(zhì)代謝失調(diào)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，引發(fā)強(qiáng)烈的脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生大量丙二醛（MDA），MDA 可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。綜上可知SOD 和MDA之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的生物學(xué)特性［18-21］。兩者反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，清除自由基的能力［22］。上述四個(gè)指標(biāo)不但從不同機(jī)制體現(xiàn)高脂血癥機(jī)體調(diào)節(jié)血脂的能力和血管機(jī)能狀態(tài)，又彼此相關(guān)、緊密聯(lián)系。因此，試驗(yàn)可以通過檢測(cè)血清SOD 活性和MDA、MPO 及NO 含量，在更深層次探討建立與人類高脂血癥的發(fā)病機(jī)制相同或相近的高血脂動(dòng)物模型，篩選及優(yōu)化出省時(shí)、省力而且經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定高脂血癥大鼠模型的理想建立方法。

從大量的文獻(xiàn)可知，形成高脂血癥模型的配方很多，高脂飼料喂養(yǎng)或灌胃形成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)用最為常用。本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)，將膽鹽和丙硫氧嘧啶二者聯(lián)合運(yùn)用到高脂血癥模型配方的效果較好［23-24］。有資料顯示，若一次性注射超生理劑量維生素D3可致大鼠動(dòng)脈出現(xiàn)彌漫性的中膜鈣化，引起彈性纖維斷裂，動(dòng)脈僵硬、順應(yīng)性降低而發(fā)生動(dòng)脈硬化，進(jìn)而又加重高脂血癥的程度，可防止因多種不確定因素導(dǎo)致動(dòng)物模型不穩(wěn)定的情況發(fā)生［25-26］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，高脂飲食方法造模（模型Ⅰ），在造模5 周還未能使SOD 活性、HDL-C、MDA 和MPO 含量有顯著性差異，且這些高脂飼料脂肪含量高、不易儲(chǔ)存、易氧化變質(zhì)，且動(dòng)物易出現(xiàn)"厭食"情況，故不易掌握每只大鼠每天高脂飼料的精確用量，且存在造模周期過長、費(fèi)用過高或模型組血脂水平參差不齊等缺點(diǎn)，故對(duì)于研發(fā)新藥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，此造模方法并不理想；而高脂乳劑灌胃，在2周時(shí)就可使各項(xiàng)指標(biāo)差異均有顯著性，但穩(wěn)定性較差，SOD活性和MDA、MPO 和NO 含量雖有顯著性差異，但對(duì)比在高脂乳劑灌胃的基礎(chǔ)上超生理劑量維生素D3的造模方法，效果并不夠理想。在高脂乳劑灌胃的基礎(chǔ)上超生理劑量維生素D3的造模方法在1周時(shí)即可使TC、TG、LDL-C 均升高、且HDL 顯著降低，體重、肝指數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)在不同時(shí)期差異均有顯著性，在造模5周后各項(xiàng)指標(biāo)差異相比上述兩種造模方法顯著（P＞0.05）。對(duì)比上述方法，說明正?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)配合高脂乳劑灌胃法，按10mL／（kg·d）的容量高脂乳劑給大鼠灌胃（高脂乳劑配方：吐溫60%＋食用油15%＋膽固醇6%＋膽酸鈉2%＋丙基硫氧嘧啶0.2%），并在造模前，一次性腹腔注射維生素D3600 000U／kg，可以建立理想的高脂血癥模型，且造模所需時(shí)間最短，3周左右即可，穩(wěn)定性較高，隨時(shí)間延長，血脂水平也不斷升高，也最與人類高脂血癥的發(fā)病機(jī)制相近。

本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MⅢ在聯(lián)合應(yīng)用膽鹽和丙硫氧嘧啶的基礎(chǔ)上，制作高脂乳劑灌胃，通過注射超生理劑量維生素D3來加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，從而提高血脂濃度，加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與脂質(zhì)過氧化的程度，促進(jìn)高脂血癥大鼠模型的成功構(gòu)建。綜上所述，此方法快捷、穩(wěn)定，適用于抗高膽固醇癥新藥、食品的研究與開發(fā)，是一個(gè)用于高脂血癥研究較為理想的造模方法。

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