Nav1.7在福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)的研究

王 波，邵先舫*，劉志軍，陳紹軍，李 前，賀淵哲，鐘 佳

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南 常德 415000）

Nav1.7在福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)的研究

王 波1，邵先舫2*，劉志軍2，陳紹軍2，李 前2，賀淵哲1，鐘 佳2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南 常德 415000）

目的 觀察電壓門(mén)控鈉離子通道1.7（Nav1.7）在福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)。方法 SD大鼠24只，隨機(jī)分為2組，空白對(duì)照組（n=12）及福爾馬林模型組（n=12）?？瞻讓?duì)照組左后足底注射0.1 mL生理鹽水，模型組于左后足底注射5%福爾馬林0.1 mL，各組大鼠在指定時(shí)間點(diǎn)取出L3-L6節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)Nav1.7在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)水平。結(jié)果 各時(shí)相點(diǎn)中模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)Nav1.7 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加，與空白組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01﹚。結(jié)論 福爾馬林致炎性疼痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7表達(dá)增強(qiáng)，與炎性疼痛相關(guān)。

福爾馬林炎性疼痛；電壓門(mén)控鈉離子通道1.7；背根神經(jīng)節(jié)；大鼠

電壓門(mén)控鈉離子通道1.7（Nav1.7）作為電壓門(mén)控性鈉離子通道的一個(gè)亞型主要選擇性的允許鈉離子跨膜通過(guò)，并由電壓控制其開(kāi)放，主要功能是維持細(xì)胞膜的興奮性及其傳導(dǎo)，且選擇性高表達(dá)在傷害感受性脊髓背根神經(jīng)節(jié)的感覺(jué)神經(jīng)元上，在疼痛電信號(hào)的產(chǎn)生、傳導(dǎo)和調(diào)控中具有重要的生理功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制福爾馬林炎性疼痛模型[1]，利用實(shí)時(shí)熒光定量和蛋白質(zhì)印跡的方法觀察Nav1.7在大鼠炎性疼痛模型背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)，為該模型疼痛產(chǎn)生機(jī)制的說(shuō)明提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

一抗 （Anti-Nav1.7 antibody[mAbcam62758] ab62758）；二抗（HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG (H+L)）。Nav1.7引物：上游：5'-CTTTGCAGCTGCCCTGGA-3'下 游 ：5'-CATGGCAATGAGCTGGACTTT-3'；β-actin引物：上游：5'-GTACCACTGGCATCGTGATGGACT-3'下游：5'-CCGCTCATTGCCAATGGTGAT-3'。垂直電泳儀 （北京六一儀器廠DYCZ-24DN型）；濕式轉(zhuǎn)膜裝置（北京六一儀器廠DYCZ-40D型）；紫外分光光度計(jì) （上海析譜UV-19）；核酸電泳儀（上海達(dá)平JY3000型）。

1.2 建模及分組[2]

選擇健康成年雄性清潔級(jí)SD系大鼠24只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：syxk(湘)2009-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為空白組和模型組，建模方法同文獻(xiàn)[2]，輕柔地限制動(dòng)物，用微量注射器抽取5%福爾馬林0.1 mL注入模型組大鼠左側(cè)后足底皮下，空白對(duì)照組于左后足底注射0.1 mL生理鹽水。操作完畢，立即將動(dòng)物置于干凈塑料箱內(nèi)，與箱底成45°夾角放置一面鏡子以便觀察動(dòng)物后肢的活動(dòng)情況。

1.3 標(biāo)本制作方法

兩組大鼠于3個(gè)時(shí)相點(diǎn) （造模后24、48、72 h）腹腔注射水合氯醛麻醉，解剖暴露大鼠脊柱，定位L3-L6椎體[3]，取出定位節(jié)段，縱向打開(kāi)椎管，暴露背根神經(jīng)節(jié)，依次取出，置入2 mL凍存管中，迅速保存于液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè) 采用RTPCR方法對(duì)背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)提取背根神經(jīng)節(jié)中總RNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量以及紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度及樣本A260與A280比值，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用ABI 7500 Real time PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)內(nèi)參選用β-actin，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△CT表示，得出“±s”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè) 采用Western blot方法對(duì)背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7表達(dá)水平進(jìn)行檢查。常規(guī)提取背根神經(jīng)節(jié)中總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白含量，電泳分離目標(biāo)蛋白，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)模，后用5%脫脂奶粉溶液封閉，孵育一抗及二抗（工作濃度1∶2 000倍）經(jīng)ECL發(fā)光液顯影，將顯影后所得條帶掃描并保存為電腦文件，用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料“±s”表示。兩組在1、2、3 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果均應(yīng)用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

Nav1.7 mRNA在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中表現(xiàn)出穩(wěn)定擴(kuò)增狀態(tài)，且在1、2、3 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)中福爾馬林模型組背根神經(jīng)節(jié)Nav1.7 mRNA的表達(dá)量相對(duì)于空白對(duì)照組上升，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01），Nav1.7 mRNA的溶解曲線提示未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1-2。

2.2 Western blot結(jié)果

在福爾馬林模型組及空白對(duì)照組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)中隨機(jī)取3個(gè)樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，其Nav1.7蛋白表達(dá)隨時(shí)相點(diǎn)的變化趨勢(shì)與其基因表達(dá)趨勢(shì)一致，在1、2、3 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)中福爾馬林模型組背根神經(jīng)節(jié)Nav1.7蛋白表達(dá)量相對(duì)于空白對(duì)照組上升，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3-4。

圖1 Nav1.7溶解曲線圖

圖2 Nav1.7mRNA各時(shí)間點(diǎn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)（P﹤0.01）

圖3 Nav1.7在各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)

3 討論

福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型屬經(jīng)典疼痛造模，模型成功復(fù)制率高，其疼痛表現(xiàn)與臨床實(shí)際表現(xiàn)相似，目前已在疼痛發(fā)生機(jī)制及鎮(zhèn)痛藥物機(jī)制中廣泛應(yīng)用。

圖4 兩組大鼠不同時(shí)相點(diǎn)Nav1.7蛋白相對(duì)表達(dá)量（P﹤0.01）

Nav1.7廣泛地分布于脊髓背根神經(jīng)節(jié)、交感神經(jīng)元、施萬(wàn)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，通過(guò)選擇性的允許鈉離子跨膜通過(guò)，并由電壓控制其開(kāi)放，維持細(xì)胞膜的興奮性及其傳導(dǎo)。近年來(lái)研究提示Nav1.7可能是存在于人類痛覺(jué)神經(jīng)纖維上與疼痛的傳入唯一有效的鈉通道，如楊勇等[4]發(fā)現(xiàn)Nav1.7的SCN9A的突變導(dǎo)致了 “紅斑性肢痛癥”；Cox等[5]發(fā)現(xiàn)無(wú)痛癥與Nav1.7的α亞基SCN9A突變相關(guān)，同時(shí)在大鼠炎癥性疼痛模型中，大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上 Nav1.7出現(xiàn)表達(dá)增加的現(xiàn)象[6]，而將大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的Nav1.7基因敲除后，大鼠對(duì)炎癥性疼痛的敏感性明顯降低[7]。同時(shí)近來(lái)研究表明Nav1.7與炎性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛及癌性痛有密切的聯(lián)系，如Wood等在基因敲除小鼠中的研究表明Nav1.7基因與急性痛和炎性痛的發(fā)展有密切相關(guān)[8]，Ghelardini等利用新合成 Tocainide類似物阻斷Nav1.7通道顯著抑制神經(jīng)病理痛大鼠的痛過(guò)敏[9]，Diaz等證實(shí)前列腺癌細(xì)胞株中SCN9A基因呈高表達(dá)[10]，抑制Nav1.7則可以顯著降低前列腺癌細(xì)胞[11]和宮頸癌細(xì)胞[12]的增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。

本實(shí)驗(yàn)中Nav1.7在福爾馬林模型組及空白對(duì)照組中有穩(wěn)定的表達(dá)，且福爾馬林模型組背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7的表達(dá)水平相對(duì)于空白對(duì)照組上升，表明Nav1.7通道蛋白極有可能參與其疼痛信號(hào)傳導(dǎo)，在該炎性疼痛模型發(fā)生機(jī)制中扮演重要角色。

[1]Dubuisson D,Dennis S G.The formalin test:a quantitative study of theanalgesic effectsofmorphine,meperidine,and brain stem stimulation in rats and cats[J].Pain,1977（4）:161-174.

[2]賀淵哲，邵先舫，熊 輝，等.福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型的建立及背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體表達(dá)水平 [J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（1）：10-13.

[3]楊安峰，王 平.大鼠的解剖和組織[M].北京：科學(xué)出版社，1985：159-189.

[4]Yang Y，Wang Y，Li S，et al.Mutat ions in SCN9A ，encoding a sodiumchannel alpha subunit，in patients with primary eryt hermalgia[J].MedGenet，2004，41(3)：171-174.

[5] Cox J J， Reimann F， Nicholas A K， et al.An SCN9A channelopathy causes con-genital inability to experience pain[J].Nat ure，2006，444(12)：894-898.

[6]Black JA，Liu S，Tanaka M，et al.Changes in the expression of tetrodotoxin-sensitive sodium channel with in dorsal root ganglia neurons in inflammatory pain[J].Nature，2004，108(3)：237-247.

[7]Mohammed A，Caroline Stirling L，Greta F，et al.Nociceptorspecific genedeletion reveals a major role for Nav1 7(PN1)in acut e and inflammatory ain[J].PNAS，2004，101(34)：2 706-2 711.

[8]Nassar MA，Stirling LC，F(xiàn)orlani G，et al.Nociceptor-specific gene deletion reveals a major role for Nav1.7(PN1)in acute and inflammatory pain[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（34）：12 706-12 711.

[9]Ghelardini C，Desaphy JF，Muraglia M，et al.Effects of a new potent analog of tocainide on hNav1.7 sodium channels and in vivo neuropathic pain models[J].Neuroscience，2010，169（2）：863-873.

[10]Diss JK，Archer SN，Hirano J，et al.Expression profiles of voltage-gated Na (+) channel alpha-subunit genes in rat and human prostate cancer cell lines [J].Prostate，2001，48（3）：165-178.

[11]Nakajima T，Kubota N，TsutsumiT，etal.Eicosapentaenoic acid inhibits voltage-gated sodium channels and invasiveness in prostate cancer cells[J].Br J Pharmacol，2009，156（3）：420-431.

[12]Diaz D，Delgadillo DM，Hernandez-Gallegos E，et al.Functional expression of voltage-gated sodium channels in primary cultures of human cervical cancer[J].J Cell Physiol，2007，210（2）：469-478.

（本文編輯 楊 瑛）

Study of the Expression of Nav1.7 in Dorsal Root Ganglion of Formalin-induced Paw Inflammatory Pain Model

WANG Bo1,SHAO Xianfang2*,LIU Zhijun2,CHEN Shaojun2,LI Qian2,HE Yuanzhe1,ZHONG Jia2
(1.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；
2.Changde Affiliated Hospital of HUCM,Changde,Hunan 410005,China)

Objective To investigate the Nav1.7 expression in the dorsal root ganglion of formalin-induced paw inflammatory pain model of the rat.Methods24 Sprague-Dawley rats were divided into two groups:control rats(n=12)and formalin-induced paw inflammation rats(n =12).The controls were injected 0.1 mL NS,and formalin-induced rats were injected with 0.1ml saline formalin.L3-6 dorsal root ganglion were collected from rats.The expression of Nav1.7 was detected by real-time quantitative PCR and Western blot.Results Nav1.7 protein and mRNA expression in the dorsal root ganglion of formalin-induced paw inflammatory pain model were significant higher than the control group(P<0.01﹚.Conclusion The Nav1.7 expression in the dorsal root ganglion of formalin-induced paw inflammatory pain model of the rat was significant higherthan before.It might be have some association with inflammatory pain.

formalin inflammatory pain;Nav1.7;dorsal root ganglion(DRG)

R441.1；Q95-33

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.04.004.010.03

2013-10-08

湖南省常德市科技局一般項(xiàng)目（2011sk13）。

王 波，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治創(chuàng)傷修復(fù)的研究。

*邵先舫，主任醫(yī)師，教授，E-mail：756500827@qq.com。