電針小海與下巨虛穴對十二指腸潰瘍大鼠血清腫瘤壞死因子-α及十二指腸核因子-κB的影響

鄧石峰，張 泓*，張雨辰，楊璐佳，王珍珍

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

電針小海與下巨虛穴對十二指腸潰瘍大鼠血清腫瘤壞死因子-α及十二指腸核因子-κB的影響

鄧石峰1，張 泓1*，張雨辰2，楊璐佳1，王珍珍1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 觀察電針十二指腸潰瘍（Duodenal ulcer，DU）大鼠“小海”、“下巨虛”后對血清腫瘤壞死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α）含量及十二指腸組織核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表達(dá)的影響。方法將40只健康SD大鼠隨機分為空白、模型、小海、下巨虛四組，每組雌雄各半，除空白組外均皮下注射鹽酸半胱胺建立DU模型大鼠。造模成功并治療10 d后，肉眼和光鏡下分別觀察大鼠十二指腸黏膜潰瘍情況及組織形態(tài)學(xué)變化，ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α含量，免疫組織化學(xué)法檢測十二指腸NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，各組大鼠光鏡下十二指腸組織病理損傷改變明顯，DU肉眼評分、血清TNF-α含量及十二指腸組織NF-κB表達(dá)顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，小海、下巨虛組組織損傷有所改善，且DU肉眼評分、血清TNF-α含量及NF-κB表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與小海組比較，下巨虛組組織損傷恢復(fù)較好，且肉眼評分、血清TNF-α含量及NF-κB表達(dá)降低（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論 電針小海、下巨虛穴均能對DU起治療作用，且下巨虛組效果優(yōu)于小海組，部分證實“合治內(nèi)府”之“合”主要應(yīng)指下合穴。其治療效應(yīng)可能是通過抑制核因子的活性、降低血清TNF-α等促炎因子的含量來實現(xiàn)的。

十二指腸潰瘍；合治內(nèi)府；電針；腫瘤壞死因子-α；十二指腸核因子-κB；小海；下巨虛；大鼠

對于特定穴中“合穴”的臨床應(yīng)用，《靈樞·邪氣臟腑病形》提出了：“滎輸治外經(jīng)，合治內(nèi)府”、“治內(nèi)府奈何？取之于合”的原則。大量研究表明[1-3]，針刺合穴對相應(yīng)臟腑疾病有良好的治療效果。從具體的選穴來看則是以下合穴為主，很少選用經(jīng)合穴，如治療小腸病多以下巨虛為主，極少涉及小海穴[4-5]。那么就小腸腑而言，“合治內(nèi)府”中的“合”到底是指經(jīng)合穴還是下合穴，還是兩者皆是？針對上述問題，我們選取較為經(jīng)典的小腸腑病——十二指腸潰瘍（Duodenal ulcer，DU）為研究對象，以手太陽小腸經(jīng)經(jīng)合穴小海、下合穴下巨虛為刺激點，觀察電針后DU大鼠十二指腸潰瘍評分、血清腫瘤壞死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α）含量及十二指腸組織核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表達(dá)，以初步探討其對DU可能的治療機制以及 “合治內(nèi)府”的部分內(nèi)涵，同時也為特定穴臨床應(yīng)用的相對特異性研究進(jìn)行一些有益的嘗試。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

健康SD大鼠40只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量205～235 g，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%（動物及飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證編號：4304701041）。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。于實驗前24 h禁食不禁水，隨機分為4組：空白組、模型組、小海組和下巨虛組，每組10只，雌雄各半。

1.2 主要材料、試劑與儀器

主要材料和試劑：鹽酸半胱胺（美國sigma公司進(jìn)口），毫針 （規(guī)格0.3 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠），即用型SABC免疫組化染色試劑盒、棕黃色DAB顯色劑 （武漢博士德公司），NF-κB多克隆抗體（中杉金橋），TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海國藥生物）。

主要儀器：SDZ-V型電子針療儀 （蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），CBV-1500A型無菌工作臺（上海瑞仰凈化裝備有限公司），TGL16M 臺式高速冷凍離心機 (長沙科威實業(yè)有限公司)，MoticTeK3.1圖像采集系統(tǒng)（廈門產(chǎn)），OLYMPUSBx-70顯微鏡成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）。

1.3 造模方法

空白組注射生理鹽水作為對照，其余各組采用Szabo法[6]注射鹽酸半胱胺溶液制造DU大鼠。在大鼠禁食不禁水24 h后，皮下注射10%鹽酸半胱胺生理鹽水溶液300 mg/kg大鼠體質(zhì)量，所有大鼠注射部位約當(dāng)大鼠右臀部。造模24 h后，為了保持潰瘍的慢性過程，繼續(xù)給造模大鼠飲用1%鹽酸半胱胺生理鹽水溶液。并觀察大鼠的精神活動、飲食飲水等情況。

1.4 治療方法

穴位定?。焊鶕?jù)林文注[7]主編《實驗針灸學(xué)》及華興邦制定的《實驗動物圖譜》提供的方法，并參照人體腧穴骨度分寸法量取：（1）小海位于大鼠前肢，前肘突與肱骨髁之間的凹陷中，直刺5 mm；（2）下巨虛位于大鼠后肢，約當(dāng)下肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，脛骨外上髁下約15 mm處，直刺5 mm。處理方法：在造模成功后第2天（造模后24 h）起，分別給予各組大鼠不同的處理：空白組大鼠不做任何處理；模型組大鼠只捆綁不針刺，每次30 min；小海組與下巨虛組大鼠捆綁后分別針刺雙側(cè)的小海穴、下巨虛穴，使用電針治療儀[（疏密波（10/50 Hz），左側(cè)接正極，右側(cè)接負(fù)極，以肢體出現(xiàn)震顫為度]，留針30 min。均每天1次，治療10 d。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

治療結(jié)束后將各組大鼠麻醉，立即開腹，EP管行腹主動脈采血，之后置于臺式高速冷凍離心機4℃、4 000 r/min，離心15 min，取上清液于-70℃低溫冰箱保存，用于TNF-α的檢測，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，嚴(yán)格按照試劑盒所述步驟操作。

采血后迅速分離十二指腸，沿十二指腸系膜縱軸方向剪開并用冰生理鹽水沖洗干凈，先于10倍放大鏡下行肉眼潰瘍評分，取出一塊約150 mg左右的腸組織，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，用于HE染色和NF-κB的免疫組化檢測。

肉眼下十二指腸組織黏膜潰瘍指數(shù)評分：按照Moraes[8]等的方法，并采用其改良后的評分標(biāo)準(zhǔn)[9]評價十二指腸黏膜損傷程度：0分為黏膜正常；1分為黏膜充血、水腫；2分為黏膜糜爛、出血；3分為淺潰瘍；4分為深潰瘍；5分為潰瘍穿孔。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

模型組大鼠造模后死亡1只 （死于十二指腸穿孔），小海組、下巨虛組治療過程中分別死亡2只和1只（死于十二指腸穿孔及急性感染），故納入統(tǒng)計大鼠共36只。

2.1 各組大鼠十二指腸潰瘍?nèi)庋墼u分比較

空白組大鼠十二指腸黏膜正常；模型組大鼠十二指腸組織黏膜糜爛、出血嚴(yán)重；小海組及下巨虛組黏膜糜爛、出血較輕。結(jié)果見圖1。

圖1 各組十二指腸潰瘍組織圖

與空白組比，各組DU評分均升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；電針治療后，小海組和下巨虛組評分較模型組降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且下巨虛組評分低于小海組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表1。

2.2 各組大鼠光鏡下十二指腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變

光鏡下，空白組十二指腸黏膜表面細(xì)胞完整，無潰瘍性損害，各層組織結(jié)構(gòu)正常，未見萎縮、缺損；模型組大鼠十二指腸黏膜損傷明顯，可見明顯壞死和廣泛的破損、脫落，并見大量炎性細(xì)胞浸潤；小海組大鼠十二指腸黏膜表面有部分脫落，破損情況較模型組改善，炎性細(xì)胞少量集結(jié)；下巨虛組大鼠十二指腸黏膜表面有少量破損、脫落。綜上所述，小海組、下巨虛組較模型組明顯改善，且下巨虛組改善優(yōu)于小海組，結(jié)果見圖2。

表1 各組大鼠十二指腸潰瘍?nèi)庋墼u分的比較 （分）

圖2 各組光鏡下十二指腸組織形態(tài)學(xué)特征（HE×100）

2.3 各組大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指腸組織NF-κB表達(dá)比較

與空白組比，各組血清TNF-α含量及十二指腸組織NF-κB表達(dá)均升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；電針治療后，小海組和下巨虛組TNF-α含量及十二指腸組織NF-κB表達(dá)均較模型組降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且下巨虛組TNF-α含量低于小海組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01），結(jié)果見表2、圖3。

3 討論

十二指腸潰瘍是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。腸黏膜的糜爛、潰瘍是其最基本的病理變化，其并發(fā)癥包括出血、穿孔、癌變等[10]。形態(tài)學(xué)檢查是判定消化性潰瘍（Peptic ulcer，PU）的治療是否有效的一個非常重要且直觀可靠的方法[8，9，11]。 本實驗中，采用改良的Moraes方法對DU行肉眼評分，并結(jié)合光鏡下觀察進(jìn)行評定，能夠較好地評價電針的治療效果。炎癥反應(yīng)在DU發(fā)病中具有重要的意義，研究表明，在眾多炎性因子中TNF-α水平測定可作為判斷PU病變程度及療效的參考指標(biāo)[12-13]。本實驗中，從大鼠形態(tài)學(xué)指標(biāo)及血清TNF-α含量觀察分析可知：（1）大鼠DU模型復(fù)制成功；（2）電針小腸腑經(jīng)合穴“小?！迸c下合穴“下巨虛”可能通過改善十二指腸黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低血清炎癥因子的含量，最終對DU產(chǎn)生治療效應(yīng)；（3）通過比較可知，“下巨虛”穴的效益要優(yōu)于“小?！毖?，具有相對特異性，就小腸腑而言，“合治內(nèi)府”之“合”穴，主要應(yīng)指下合穴。

表2 各組大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指腸組織NF-κB表達(dá)比較 （±s）

表2 各組大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指腸組織NF-κB表達(dá)比較 （±s）

組別空白組模型組小海組下巨虛組n 10 9 8 9 TNF-α（ng/L）110.76±13.92 361.06±9.45** 317.87±19.69**ΔΔ275.36±14.97**ΔΔ●●NF-κB（光密度值）0.10±0.02 0.30±0.03** 0.19±0.04**ΔΔ0.16±0.04**ΔΔ●

圖3 各組光鏡下十二指腸粘膜核因子-κB表達(dá)（×100）

近年來研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[14-16]。本實驗中，模型組十二指腸組織中NF-κB大量表達(dá)，這與戴幸平等[17-18]在PU及潰瘍性結(jié)腸炎中觀察到的一致，這可能意味著在DU發(fā)病中，NF-κB受到炎性因子的刺激而活化，并進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，使得血清中TNF-α等炎癥因子的含量增高；而電針小海、下巨虛可能通過影響NF-κB進(jìn)而降低TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生，其具體機制有待進(jìn)一步研究；小海組與下巨虛組之間的差異體現(xiàn)了不同穴位之間的差異性。

綜上所述，電針小海穴及下巨虛穴均對DU有治療作用，且下巨虛穴優(yōu)于小海穴，就小腸腑而言，“合治內(nèi)府”之“合”主要應(yīng)指下合穴，其確切內(nèi)涵仍需進(jìn)一步研究；可能的部分治療機制是通過抑制核因子的表達(dá)、降低炎癥因子（TNF-a等）的合成與釋放來實現(xiàn)。

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（本文編輯 匡靜之）

Effects of Electroacupuncture on Serum TNF-α Level and Duodenal Tissue NF-κB Expression in DU Rats

DENG Shifeng1,ZHANG Hong1*,ZHANG Yuchen2,YANG Lujia1,WANG Zhenzhen1
(1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;
2.The Second Affiliated Hospital of HUCM,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective By electroacupuncture at Xiaohai and Xiajuxu points on duodenal ulcer model rats,to observe the effect of electroacupuncture on serum TNF-α level and duodenaltissue NF-κB expression,and to analyze their mechanism to which they related,briefly explaining the meaning of He points in curing viscera diseases by He points.Methods Forty SD rats were randomly divided into 4 groups:Blank group,Model group,Xiaohai group and Xiajuxu group.Set up the Duodenal Ulcer rat models through injection of cysteamine hydrochloride at the right buttock.After molding,following electro-acupuncture at rat's XiaoHai and XiaJuXu acupoint,EA parameters density wave (10/50 Hz),a negative electrode on the right and the positive one left, the intensity between 1～3 mA,with limb tremor in degrees needle for 30 minutes once a day for 10 days.After treatment,make DU score by eyes first.Histological changes in the duodenum were observed by light microscopy.ELISA is used to check models'serum TNF-α level and the expression of NF-κB in the duodenum were detected by immunohistochemistry.Results The DU score,serum TNF-α levels and NF-κB expression of Model,Xiaohai and Xiajuxu groups are significantly higher than the Blank group(P<0.01)and the tissue injurychanges are obviously under lightmicroscope.Compared with Modelgroup,the tissue injury changesofXiaohaiand Xiajuxu groups improved obviously,the DU score,serum TNF-α levels and NF-κB levels of Xiaohai and Xiajuxu groups are significantly lower(P<0.01).Compared with Xiaohai group,the tissue injury changes of Xiajuxu group improved well,the DU score,serum TNF-α and NF-κB levels is obviously lower (P<0.01 or P<0.05).Conclusion Electroacupuncture at Xiaohai and Xiajuxu point have treatment effects on DU rats,and the effects of Xiajuxu is obvious better than Xiaohai,which proves Xiajuxu has relative specificity.This result partly confirmed:"He""He Zhi Nei Fu"should refer to the Xia He point.The treatment mechanism of He point might inhibit the activity of NF-κB and reduce the serum TNF-α level.

duodenalulcer;curing viscera diseasesby He points;TNF-α;NF-κB; electro-acupuncture

R245.3；R573.1

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.04.011.036.05

2014-02-18

國家自然科技基金項目（81173327/H2718）。

鄧石峰，男，在讀碩士研究生，研究方向：針灸對常見病康復(fù)機理的研究。

*張 泓，男，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zh5381271@sina.com。