PTTG和C-myc在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的表達(dá)和意義

陳歡

摘要：目的：探討垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因（PTTG）和C-myc在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾?。℅TD）發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：收集株洲市中心醫(yī)院收治的GTD病例共55例，同時收集株洲市中心醫(yī)院正常早孕行人工流產(chǎn)的絨毛標(biāo)本21例作為對照。并應(yīng)用免疫組化SP法檢測21例正常的早孕絨毛、15例完全性葡萄胎、10例部分性葡萄胎、14例侵蝕性葡萄胎與15例絨癌石蠟包埋組織中PTTG和C-myc的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：PTTG和C-myc蛋白在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞都表達(dá)，兩者在正常早孕絨毛與GTD中主要表達(dá)于細(xì)胞漿，偶表達(dá)于細(xì)胞核。正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨癌中PTTG蛋白的陽性表達(dá)率分別為14.3％、24.0％、78.6％、80.0％；C-myc蛋白的陽性表達(dá)率分別為23.5％、30.0％、71.4％、73.3％。PTTG和C－myc在正常早孕絨毛和葡萄胎中的表達(dá)量差異無顯著性意義（P＞0.05）；侵蝕性葡萄胎和絨癌的表達(dá)量明顯高于正常早孕絨毛和葡萄胎（P＜0.05)；絨癌的表達(dá)量高于侵蝕性葡萄胎，但差異無顯著意義（P＞0.05）。在GTD中，PTTG和C-myc的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（R＝0.724, F=49.663,P＜0.05 )。

結(jié)論PTTG和C-myc的表達(dá)上調(diào)可能是滋養(yǎng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的早期事件，并在GTD的惡化進(jìn)展中起重要作用。

關(guān)鍵詞：妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾??；PTTG；C-myc；免疫組織化學(xué)

【中圖分類號】R737.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-8602(2014)05-0016-02

葡萄胎發(fā)病率在世界不同地區(qū)變化很大，亞洲國家比歐洲或北美高3～10倍，葡萄胎是包括我國在內(nèi)的東南亞國家常見病之一，我國葡萄胎平均發(fā)病率為290/10萬 [1]，其中10～20％在清宮后惡變?yōu)榍治g性葡萄胎或絨癌，早期即可經(jīng)血液途徑轉(zhuǎn)移至肺﹑腦等處，嚴(yán)重危害婦女的健康。葡萄胎惡變的機(jī)制仍不十分清楚，近年來發(fā)現(xiàn)PTTG基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

據(jù)已有的報道，關(guān)于PTTG基因在腫瘤形成中的作用研究集中在卵巢癌，垂體瘤中，而在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中的作用機(jī)制研究很少。本研究通過SP免疫組化的技術(shù)對正常妊娠絨毛組織和GTD中的PTTG及C-myc蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，比較兩者的表達(dá)水平，從而探討PTTG與C-myc在GTD的發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的作用機(jī)制作初步探討。

1 資料和方法

1.1 組織來源：

正常早孕絨毛組（Normal chorionic villi of first trimester,N）:選取株洲市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科門診2013年12月至2014年2月正常早孕行人工流產(chǎn)的絨毛標(biāo)本21例，年齡21～38歲，平均（27±4）歲，均無異常妊娠史。取上述正常早孕行人工流產(chǎn)的絨毛標(biāo)本，石蠟包埋，作HE染色和免疫組化實驗用。

GTD組： 收集株洲市中心醫(yī)院病理科存檔GTD石蠟包埋標(biāo)本共55例，其中部分性葡萄胎10例，年齡20～43歲，平均（31±7）歲；完全性葡萄胎15例，年齡22～47歲，平均（29±8）歲；侵蝕性葡萄胎14例，年齡31～49歲，平均（43±6）歲；絨毛膜癌15例，年齡29～54歲，平均（43±9）歲。

1.2 方法免疫組化檢測PTTG和C-myc蛋白的表達(dá)：

(1)HE染色

全部收集的標(biāo)本均經(jīng)4％中性甲醛液固定，梯度脫水、浸蠟和包埋。所取蠟塊行5μm連續(xù)切片、烘烤、脫蠟、HE染色、透明和封片。

(2) 采用SP法進(jìn)行免疫組化檢測，具體步驟如下：

① 石蠟切片，厚5μm，用經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片撈片，置烤箱60℃，60分鐘。

② 切片脫蠟至水：二甲苯浸泡30分鐘×2次；100％乙醇浸泡30分鐘×2次，95％、85％、75％乙醇依次浸泡各10分鐘；蒸餾水浸泡5分鐘×3次。

③ 抗原修復(fù)處理：按不同的抗體要求進(jìn)行抗原修復(fù)。以0.01M，pH6.0檸檬酸高壓或微波爐修復(fù)。室溫冷卻后，蒸餾水浸泡5分鐘×3次，繼以0.01M PBS浸洗5分鐘×3次。

④ 滴加A液（3％過氧化氫溶液）25μl，室溫避光孵育30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶活性；0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑤ 滴加B液（封閉用正常山羊血清工作液）25μl，室溫孵育30分鐘。

⑥ 甩去山羊血清，滴加鼠抗人第一抗體25μl，4℃孵育過夜，0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑦ 滴加C液（生物素化二抗工作液）25μl，室溫孵育30分鐘，0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑧ 滴加D液（辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液）25μl，室溫孵育30分鐘，0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑨ 滴加新鮮配置的DAB溶液顯色1～2分鐘（顯微鏡下控制顯色時間）。

⑩ 自來水沖洗，蘇木素復(fù)染2分鐘，0.05％鹽酸乙醇分化，自來水沖洗反藍(lán)15分鐘，梯度乙醇脫水（100％、95％、85％、75％乙醇浸泡各1分鐘），60℃干烤20分鐘，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判斷：

每批免疫組化均設(shè)有已知陽性和用PBS代替一抗的陰性對照。PTTG和C-myc均以細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明確的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。觀察至少10個具代表性高倍視野，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評估。分別對染色強(qiáng)度（0：無著色；1：淡黃色；2：棕黃色；3:棕褐色）和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（0：<5％；1：5％～25％；2：26％～50％；3：51％～75％；4：>75%）進(jìn)行計分，兩者相加為免疫組化評分，0分～2分為（－），3分～4分為（＋），5分～6分為（＋＋），7分為（＋＋＋）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。免疫組化實驗結(jié)果應(yīng)用等級資料的秩和檢驗對相關(guān)組間進(jìn)行顯著性檢驗；采用Chi-square test分析法對GTD與PTTG和C-myc的蛋白表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析；結(jié)果均以P<0.05為差異有顯著意義，P<0.01為差異有極顯著意義。

2 結(jié)果

2．1 PTTG的蛋白表達(dá)

2. 1. 1 PTTG蛋白免疫組化定位：

PTTG蛋白的在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中都有陽性表達(dá)。在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌組織，PTTG蛋白的表達(dá)以細(xì)胞漿為主，偶爾表達(dá)于細(xì)胞核，未見細(xì)胞膜表達(dá)。

2．1．2 PTTG蛋白表達(dá)半定量分析：

PTTG蛋白在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌的陽性表達(dá)率分別為14.3%、24.0%、78.6%、80.0%。葡萄胎和正常早孕絨毛相比較，PTTG蛋白的表達(dá)量的差異無顯著意義（P＞0.05）,侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌的表達(dá)量明顯高于正常早孕絨毛和葡萄胎（P＜0.05）,侵蝕性葡萄胎的表達(dá)量低于絨毛膜癌，但差異無顯著意義（P＞0.05）。見"表1,"

表1 正常早孕絨毛和GTD組織中PTTG的蛋白表達(dá)

組別例數(shù) PTTG的蛋白表達(dá)

－ ＋ ＋＋＋＋＋ 陽性率（％）

正常早孕絨毛 21 182 1014.3%

葡萄胎 25 191 3224.0%

侵蝕性葡萄胎 1432 2778.6%

絨毛膜癌 1531 3880.0%

2．2 C-myc的蛋白表達(dá)

2．2．1 C-myc蛋白免疫組化定位：

C-myc蛋白在滋養(yǎng)層細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞都有陽性表達(dá)。在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌組織中，C-myc蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿，偶爾表達(dá)于細(xì)胞核。

2．2．2 C-myc蛋白表達(dá)半定量分析：

C-myc蛋白在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌的陽性表達(dá)率分別為23.5%、 35.0%、71.4%、73.3%。正常早孕絨毛和葡萄胎相比較，C-myc的表達(dá)量的差異無顯著意義（P＞0.05）；葡萄胎和侵蝕性葡萄胎相比較，C-myc的表達(dá)量的差異有顯著意義（P＜0.05﹚；侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌相比較，C-myc的表達(dá)量的差異無顯著意義（P＞0.05）。見表2。

表2 正常早孕絨毛和GTD組織中C-myc的蛋白表達(dá)

組別例數(shù) C-myc的蛋白表達(dá)

－ ＋ ＋＋＋＋＋ 陽性率（％）

正常早孕絨毛 2117 2 2023.5%

葡萄胎 2518 3 31 35.0%

侵蝕性葡萄胎 1442 35 71.4%

絨毛膜癌 1542 36 73.3%

2.3 GTD中PTTG 與C-myc蛋白表達(dá)的相關(guān)性：

55例GTD病例中，PTTG和C-myc蛋白表達(dá)同時為陽性者為32例，同時為陰性者為10例，表達(dá)的一致率為76.4％,呈明顯正相關(guān)（R＝0.724, F=49.663,P＜0.05﹚。見表3。

表3 GTD中PTTG蛋白和C-myc蛋白表達(dá)的相關(guān)性

PTTG蛋白C-myc蛋白

陽性 陰性 合計

陽性32739

陰性 6 1016

合計48 1755

3 討論

人類的hPTTG基因定位于五號染色體的5q33.1。hPTTG cDNA序列由787bp組成，含一個609bp的開放讀碼框架。編碼一條含202個氨基酸的蛋白質(zhì),其編碼的蛋白在N末端（58～101）和C末端分別有一富含堿基和一富含脯氨酸的區(qū)域，前者被認(rèn)為是一核定位信號區(qū)，而后者包含兩個PXXP基序，其作為SH3的結(jié)合位點參與SH3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[2,3]。研究已證明PXXP基序是PTTG在體內(nèi)多種作用的關(guān)鍵位點[4]。

PTTG家族至少有三個成員，PTTG1定位于5q35.1，而PTTG2，PTTG3分別定位于4p15.1和8q13.1，但與前者不同是它們均不含內(nèi)顯子。Chen等人發(fā)現(xiàn)hPTTG2和hPTTG3的cDNA核酸序列與hPTTG1分別有91%和89%的相似性[5]。

hPTTG的mRNA在正常人類睪丸組織胎兒肝組織胸腺有高表達(dá), 而小腸，結(jié)腸，胰腺，大腦，肺，胎盤組織中僅有弱表達(dá)，其它人類正常組織hPTTG的mRNA表達(dá)幾乎沒有或很低。hPTTG mRNA高表達(dá)于垂體，腎上腺，卵巢，子宮內(nèi)膜，子宮體，肝臟和腎臟等的腫瘤組織中，同時在許多腫瘤細(xì)胞系中也有高表達(dá)，包括宮頸癌Hela株，絨毛膜癌JEG-3和JAR株，乳腺癌MCF-7，骨源性肉瘤 U-2 OS，肝細(xì)胞癌Hep 3B，肺癌 EY，甲狀腺癌TC-1[2.3]。在腫瘤細(xì)胞株中高表達(dá)的hPTTG99%為hPTTG1，hPTTG2僅在三種腫瘤細(xì)胞株中有增高，而hPTTG3的表達(dá)僅限于腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株[6、7]。這些表明不同的hPTTG家族成員在正常細(xì)胞和腫瘤形成中起不同的作用。本實驗中，PTTG蛋白的表達(dá)隨著妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的惡性程度增高而增加，說明PTTG與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤有著密切的關(guān)系。

C-myc基因是最早于禽類骨髓瘤病毒MC29中發(fā)現(xiàn)的一種癌基因[8]。C-myc可誘導(dǎo)細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。本實驗中，C-myc蛋白的表達(dá)隨著妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的惡性程度增高而增加，說明C-myc與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤有著密切的關(guān)系。

近年以來，隨著基因和分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已經(jīng)意識到惡性腫瘤的形成和發(fā)展是多基因參與、多步驟的過程。越來越多的腫瘤相關(guān)因子被人們發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)行了深入的研究，但在眾多腫瘤因子中，找出腫瘤發(fā)展各個環(huán)節(jié)的重要因子就具有非常重要的現(xiàn)實意義，將有助于對某種類型的腫瘤進(jìn)行檢測，并將指標(biāo)量化，從而對腫瘤的診斷、鑒別診斷、預(yù)后判斷及個體化治療的選擇等方面提供有意義的參考。PTTG可調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，刺激成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的表達(dá)和分泌[10]，促進(jìn)腫瘤血管形成[6]，通過p53依賴和p53非依賴的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡[11]，與C-myc一起作用調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[12]。本實驗中，PTTG及C-myc蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)性，提示PTTG和C-myc的表達(dá)上調(diào)可能是滋養(yǎng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的早期事件，并在GTD的惡化進(jìn)展中起重要作用。因此，PTTG和C-myc表達(dá)水平的檢測可作為葡萄胎惡變預(yù)測的參考指標(biāo)。基因轉(zhuǎn)錄異?？赡苁荘TTG和C-myc表達(dá)上調(diào)的主要原因之一，對它們的深入研究有望在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生機(jī)制研究領(lǐng)域獲得新的進(jìn)展。

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