雙酶法制備奶味香精的研究

王孟輝，陳 靜，關(guān)志涵，錢文濤，王 斌，胡鵬麗，李洪亮，母智深

(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011500)

奶味香精，也稱作乳香香精、乳香香味劑，是一種具有奶香香氣的食品添加劑。與奶制品的品種相對應(yīng)，奶味香精分為鮮奶、煉奶、奶油、黃油干酪、酸奶等香型［1－2］。它是食品工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的香精之一，從膨化食品到糖果炒貨食品，從冷飲到飲料，從乳制品到非乳品都有其用武之地。目前，國內(nèi)張之滌［3］，王璋等［4］，李雁群［5］等人利用不同來源的酶制劑制得的增味物質(zhì)對乳香香精進(jìn)行修飾，從而大大提高天然乳品香精的品質(zhì)，武彥文等［6］脂肪酶對不同類型的奶油、奶酪和牛奶等進(jìn)行酶解，得到了奶香濃郁，賦香效果明顯的奶味香精。國外Toelstede S等［7］人利用乳蛋白酶解產(chǎn)物中的增味物質(zhì)配制成各種天然牛奶或奶酪香精，可以顯著增強(qiáng)香精中乳滋味的濃厚感與持久感。Balcao V M等［8］，King R D等人［9］對奶油酶解增香的研究主要集中在特異性脂肪酶對酶解底物水解程度的控制以及脂肪酶的固定化兩個方面。Kirimura J 等［10］，Arnold R G 等人［11］利用不同來源的脂肪酶對乳脂肪進(jìn)行適當(dāng)酶解，通過控制酶解程度以得到具有不同奶香特征的產(chǎn)物，從而達(dá)到增香的目的。中國是世界上人口最多的國家，每年對奶香精的消耗量十分巨大，隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對奶香精品質(zhì)的要求將越來越高，在滿足口感的同時，天然、安全、健康、多樣化的產(chǎn)品將成為消費(fèi)者需求的方向。而市場的發(fā)展趨勢是淘汰無核心技術(shù)的簡單重復(fù)開發(fā)產(chǎn)品，因此，開發(fā)天然、綠色、健康的產(chǎn)品具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的市場空間。本研究采用雙酶結(jié)合可控酶解技術(shù)對稀奶油進(jìn)行酶解，先采用蛋白酶將稀奶油中的蛋白質(zhì)水解，產(chǎn)生小分子肽及多肽類的呈味物質(zhì)，使產(chǎn)品味道自然柔和，然后再加入脂肪酶對脂肪進(jìn)行酶解，進(jìn)而釋放出更多的呈味物質(zhì)，促使酶解產(chǎn)物強(qiáng)度增加、風(fēng)味豐富、香味十足，為工業(yè)化生產(chǎn)奶味香精提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稀奶油 蒙牛乳業(yè);脂肪酶CR 美國萬力;復(fù)合蛋白酶ProTamEx1.17L 諾維信;磷酸氫二鈉(純度97%)、磷酸二氫鈉(純度98%)吳江市杰達(dá)化工有限公司。

FLUKO乳化器 上海弗魯克流體機(jī)械制造公司;酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;JB－50D型增力電力攪拌機(jī) 上海南匯慧明儀器廠;DK－S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;AB204－N電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;恒溫?fù)u床 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Agilent 7890 A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司;S433D型全自動氨基酸分析儀 北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合蛋白酶酶解方法

1.2.1.1 酶添加量 稱取適量稀奶油調(diào)節(jié)體系的pH為6.0，分別加入 0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 和0.05%比例的酶(加酶量為酶與底物的百分比)，控制溫度45℃，轉(zhuǎn)速150r/min，進(jìn)行水解反應(yīng)，3.5h后測定稀奶油中蛋白質(zhì)的水解度。

1.2.1.2 酶解溫度 稱取適量稀奶油調(diào)節(jié)體系的pH為6.0，加酶量為 0.04%，溫度分別 30、35、40、45、50℃，轉(zhuǎn)速150r/min，進(jìn)行水解反應(yīng)，3.5h后測定稀奶油中蛋白質(zhì)的水解度。

1.2.1.3 酶解時間 稱取適量稀奶油調(diào)節(jié)體系的pH為6.0，加酶量為0.04%，溫度40℃，酶解時間分別為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5h，轉(zhuǎn)速 150r/min，進(jìn)行水解反應(yīng)，完畢后測定稀奶油中蛋白質(zhì)的水解度。

1.2.1.4 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，研究加酶量、酶解溫度和時間三因素對稀奶油水解度的影響，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)水平因素表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.2.2 脂肪酶CR水解稀奶油酶解方法

1.2.2.1 酶添加量 稱取適量稀奶油調(diào)節(jié)體系的pH為7.0，分別加入 0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 和0.07%比例的酶(加酶量為酶與底物的百分比)，控制溫度40℃，轉(zhuǎn)速150r/min，進(jìn)行酶解反應(yīng)，14h后測定酶解稀奶油的酸價。

1.2.2.2 酶解溫度 稱取適量稀奶油調(diào)節(jié)體系的pH為7.0，加酶量為 0.06%，溫度分別 30、35、40、45、50℃，轉(zhuǎn)速150r/min，進(jìn)行水解反應(yīng)，14h后測定酶解稀奶油的酸價。

1.2.2.3 酶解時間 稱取適量稀奶油調(diào)節(jié)體系的pH為7.0，加酶量為0.06%，溫度45℃，酶解時間分別為12、14、16、18、20h，轉(zhuǎn)速 150r/min，進(jìn)行水解反應(yīng)，完畢后測定酶解稀奶油的酸價。

1.2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，研究加酶量、酶解溫度和酶解時間三因素對稀奶油酸價的影響，因素水平見表2。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)水平因素表Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.2.3 水解度測定 氨基態(tài)氮含量的測定:甲醛法［14－16］測定，總氮含量的測定:凱氏定氮法，參照 GB/T5009.5。

1.2.4 酸價的測定 酸價測定采用酸堿中和法［17－18］。

注:V－滴定消耗的氫氧化鉀溶液體積mL;N－氫氧化鉀溶液當(dāng)量濃度mol/L;56.1－氫氧化鉀的毫克當(dāng)量;W－試樣重量g。

1.2.5 感官評定方法 將稀奶油酶解物在玻璃奶瓶中搖勻，待分層現(xiàn)象完全消失、顆粒上下浮游較為均勻時，用膠頭滴管吸取少量樣液于燒杯中，用水溫約30℃的純凈水稀釋成濃度為0.2%的溶液，攪拌均勻，用以進(jìn)行感官評定，總分為10分(其中氣味、滋味各占5分)，氣味和滋味所得分值相加即為感官分值，各評香師所得分值總和與評香師人數(shù)比值即為最終感官分值，本文參與感官評價人員12人，人員組成見表 3，評分標(biāo)準(zhǔn)見表 4［19］。

表3 感官評價人員組成表Table 3 Staff composition of sensory evaluation

1.2.6 GC－MS分析法 采用Agilent 7890 A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 EMV:1500V;離子源溫度:230℃;MASS range:29～500amu;柱溫:57～260℃(4℃/min、最高溫時保持10min);柱流過:1mL/min(He)［12，20］。

表4 稀奶油酶解物感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory evaluation standard of cream hydrolysate

1.2.7 氨基酸分析 采用S433D型全自動氨基酸分析儀 色譜柱:AccQ·Tag;氨基酸分析柱(3.9×150mm，4μm);流速:1mL/min;柱溫:37℃;進(jìn)樣量:10μL;檢測波長:248nm［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合蛋白酶水解稀奶油的工藝條件

2.1.1 加酶量對蛋白水解度的影響 從圖1中可以看出，隨著加酶量的增加，水解度在不斷增大，水解度的增加幅度減小，當(dāng)加酶量在0.04%時，水解度達(dá)到最大，隨著加酶量增加水解度在下降，可能酶在酶解過程中水解度達(dá)到最大值時，本身不進(jìn)行作用，而自身又是蛋白質(zhì)導(dǎo)致水解度降低，故選擇加酶量為0.04%。

圖1 不同加酶量對稀奶油水解度的影響Fig.1 Effect of proteinase dosage on degree of hydrolysis of cream

2.1.2 溫度對蛋白水解度的影響 從圖2可以看出，隨著酶解溫度的增加，水解度不斷增大，酶解溫度升高到40℃后，水解度不升反而降低，酶促水解反應(yīng)在40℃時，反應(yīng)速度快，低于此溫度時，酶活力低，水解度低;當(dāng)溫度高時，由于酶逐漸產(chǎn)生變性作用而減弱甚至喪失其催化活力，導(dǎo)致反應(yīng)速度降低。本實(shí)驗(yàn)中，酶解最適溫度為40℃。

2.1.3 酶解時間對蛋白水解度的影響 如圖3隨著反應(yīng)時間的增加，水解度在增大，到4.5h以后，水解度增加的幅度在減小，說明在4.5h之內(nèi)，水解率隨反應(yīng)時間增加而升高;4.5h之后，底物量不斷減少，酶活力下降，反應(yīng)速度增加幅度降低，導(dǎo)致水解率反而降低，故選擇酶解時間4.5h。

圖2 酶解溫度對稀奶油水解度的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on degree of hydrolysis of cream

圖3 酶解時間對稀奶油水解度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis of cream

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 在酶水解過程中，各因素之間存在極為復(fù)雜的交叉作用和互補(bǔ)作用，從而影響著酶解程度。為優(yōu)化水解條件，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用了L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，研究酶用量、溫度、反應(yīng)時間三因素對水解度的影響(固定反應(yīng)體系的pH6.0，由酶本身的性質(zhì)決定)。由極差分析知:酶用量是此反應(yīng)的關(guān)鍵，溫度次之，作用時間影響最小。最優(yōu)水解條件為:加酶量為0.04%，溫度45℃，酶解時間3.5h，蛋白質(zhì)的水解度達(dá)到17.3%。

表5 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of L9(34)orthogonal test

2.2 脂肪酶CR水解稀奶油的工藝條件

2.2.1 加酶量對脂肪酶酶解反應(yīng)的影響 從圖4中可以看出，隨著加酶量的增加，酸價在不斷增大，開始曲線的斜率由小變大，隨著加酶量的增加，曲線斜率在減小，當(dāng)加酶量大于0.06%時，酸價增加的幅度減小但仍具有增加的趨勢，從能耗和生產(chǎn)周期等綜合因素考慮，加酶量0.06%較為合適。

圖4 加酶量對酶解稀奶油酸價的影響Fig.4 Effect of proteinase dosage on acid value of cream

2.2.2 溫度對脂肪酶酶解反應(yīng)的影響 從圖5可以看出，隨著酶解溫度的增加，開始酸價在不斷增大，當(dāng)酶促水解反應(yīng)在45℃時，反應(yīng)速度最快，低于此溫度時，酶活力低，解脂率低;當(dāng)溫度高時，可能是酶在作用的同時自身逐漸變性導(dǎo)致酶活減弱甚至喪失其催化活力，使其反應(yīng)速度降低。結(jié)合實(shí)際情況選擇酶解溫度為45℃。

圖5 溫度對酶解稀奶油酸價的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on acid value of cream

2.2.3 時間對脂肪酶酶解反應(yīng)的影響 如圖6所示，隨反應(yīng)時間的增加，酸價在增大，到16h以后，酸價增加的幅度在減小，說明在16h之內(nèi)，解脂率隨反應(yīng)時間增加而增大;16h之后，隨著底物濃度不斷的減少，酶活力下降，酸價增長趨勢逐漸減緩，選擇16h較為合適。

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 通過表6的極差分析可知，其他因素不變的情況下，對水解度影響最大的因素為酶解溫度(R=9.867)，加酶量次之(R=9.666)、而酶解時間(R=6.866)，其大小順序?yàn)?B(酶解溫度)＞A(加酶量)＞C(酶解時間)，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，最優(yōu)工藝組合為 A2B2C3，即加酶量為0.06%，溫度45℃，酶解時間18h，酶解稀奶油的酸價為55.4。

2.3 稀奶油酶解物揮發(fā)性成分分析

圖6 時間對酶解稀奶油酸價的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on acid value of cream

采用GC－MS方法對稀奶油原液及雙酶結(jié)合分步酶解方法制得的稀奶油酶解物進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分的分析，結(jié)果如表7所示。

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of L9(34)orthogonal test

從GC－MS的分析報告數(shù)據(jù)表7來看，酶解后的稀奶油與原料相比，含量較高的組分仍是脂肪酸、酯、醛、醇、酮和硫化物等物質(zhì)，種類差別不大，這些物質(zhì)是重要的揮發(fā)性香氣組成部分。但短鏈及中鏈脂肪酸，如癸酸、辛酸、丁酸等，含量大大增加，對揮發(fā)香氣的加強(qiáng)有很大作用。說明酶解過程中主要進(jìn)行了脂肪酸甘油三酯的降解，在脂肪酶的作用下，水解出了大量游離脂肪酸，使稀奶油風(fēng)味中的脂肪酸特征被釋放出來。由于稀奶油風(fēng)味的形成是一個各種風(fēng)味物質(zhì)協(xié)同產(chǎn)生的復(fù)雜過程，在進(jìn)行酶解以及風(fēng)味濃縮生產(chǎn)香精的過程中，要做到稀奶油風(fēng)味的原汁原味維持，是一個需要全面而細(xì)致的控制和研究。

2.4 稀奶油酶解物氨基酸成分分析

采用氨基酸自動分析儀對稀奶油原液及其酶解物進(jìn)行氨基酸成分分析，結(jié)果如表8所示。

由表8的氨基酸分析表明，酶解液氨基酸總量達(dá)23.80mg/g，相比酶解前增長了約十二倍。其中必需氨基酸種類齊全，含量占總氨基酸含量的59.13%。與原料相比，除天門冬氨酸外，其它氨基酸含量都大幅升高。

表7 稀奶油原料及酶解物香氣成分比較Table 7 Comparison of compound aroma of cream materials and enzymatic components

續(xù)表

表8 稀奶油原料及酶解物氨基酸成分比較Table 8 Comparison of amino acid of cream materials and enzymatic components

增幅最大的氨基酸是組氨酸，增長了62倍，其他增加幅度較高的依序有異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，這幾種氨基酸也在酶解物中具有較高的含量。

3 結(jié)論

從GC－MS的分析數(shù)據(jù)來看，酶解后的稀奶油與原料相比，短鏈及中鏈脂肪酸，如癸酸、辛酸、丁酸等，含量大大增加，對揮發(fā)香氣的加強(qiáng)有很大作用。甲基酮類和內(nèi)酯類物質(zhì)相比之下含量較少，從而突顯了酶解稀奶油特殊的風(fēng)味。通過氨基酸分析表明，酶解液氨基酸總量達(dá)23.80mg/g，相比酶解前增長了約12倍。其中必需氨基酸種類齊全，含量占總氨基酸含量的59.13%。與原料相比，除天門冬氨酸外，其它氨基酸含量都大幅升高。氨基酸含量的變化也間接地說明蛋白酶在酶解過程中除產(chǎn)生氨基酸外，同時也產(chǎn)生了大量的沒有徹底變成氨基酸的多肽類物質(zhì)，而多肽類物質(zhì)中含有的風(fēng)味肽能使奶味香精呈現(xiàn)出更加飽滿自然的香氣，經(jīng)感官分析，本研究制備的奶味香精具有濃度高、香味醇等特點(diǎn)。

［1］艾萍，張偉民，孫艦.黃油乳脂香精的研制［J］.食品工業(yè)，2007(6):31－32.

［2］張文啟，喬吉喆.當(dāng)前食品香精研究開發(fā)的熱點(diǎn)及展望［J］.現(xiàn)代食品科技，2005(3):144－147.

［3］李雁群，肖功年.酶在食品加工中的應(yīng)用(第二版)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2002.

［4］王璋，許時嬰等.食品化學(xué)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2003:407－413.

［5］張之滌.酶法奶類香精的研制及應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，1999(4):51－53.

［6］武彥文，歐陽杰，張津鳳，等.酶法水解奶油制備奶味香精的研究［J］.中國調(diào)味品，2003，12:39－42.

［7］Toelstede S，Dunkel A，Hofinanna T.A Series of Kokumi Peptides Impart the Long－Lasting Mouthfulness of Matured Gouda Cheese［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2009，57:1440－1448.

［8］Balcao V M，Malcata F X.Lipase catalyzed modification of milk fat［J］.Biotechnology Advances，1998，16(2):309－341.

［9］King R D，Cheetham P SJ.Food Biotechnology［M］.London:Elsevier applied science，1988:59－63.

［10］Kirimura J，Shimitsu A，Kimizuka A，et al.The contribution of peptide and amino acids to the taste offood stuffs［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1969，17:689－695.

［11］Arnold R G，Shahani K M，Dwivedi B K.Application of lipolytic enzymes to flavor development in dairy products［J］.Journal of Dairy Science，1975，58:1127－1143.

［12］韓雙.GC－MS分析液體奶味香精的致香成分［J］.江蘇調(diào)味副食品，2010(6):11－15.

［13］大連輕工業(yè)學(xué)院、華南理工大學(xué)、鄭州輕工業(yè)學(xué)院等.食品分析［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2006，1:240.

［14］劉崢，王麗娟，王麗.磁性固定化胃蛋白酶水解牛奶的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2009(1):45－46.

［15］趙新淮，馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測定［J］.食品科學(xué)，1994(1):65－67.

［16］天津輕工業(yè)學(xué)院、大連輕工業(yè)學(xué)院、無錫輕工業(yè)學(xué)院等.工業(yè)發(fā)酵分析［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1980.

［17］劉桂梅.食用香精在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2006(4):179－180.

［18］唐厚才.生物工程技術(shù)在呈味生香中的研究［J］.中國食品添加劑，2006:320－324.

［19］王蓓，許時嬰.復(fù)合酶在pH自然變化下水解干酪工藝條件的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009(2):176－179.

［20］于鐵妹，王衛(wèi)飛，楊博，等.GC/MS分析天然奶味香精的致香成分［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24(1):80－82.