人參脂溶性成分提取工藝優(yōu)化及其GCMS分析

劉婷婷，劉鴻鋮，樊紅秀，王大為

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118)

人參(Panax ginseng C.A.Mey)是五加科多年生草本植物，具有大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)脾益肺、復(fù)脈固脫、生津安神等功效［1-3］。人參脂溶性成分包括脂肪酸及酯類、甾醇類、聚乙炔醇化合物及揮發(fā)油等，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，人參脂溶性成分具有消炎、鎮(zhèn)咳、降壓、抗疲勞、抗腫瘤、降低膽固醇含量以及興奮中樞神經(jīng)的作用。人參脂溶性成分的傳統(tǒng)提取方法主要有水蒸氣蒸餾法和有機(jī)溶劑浸取法［5］，但水蒸氣蒸餾法加熱溫度高，提取時(shí)間長(zhǎng)，所得產(chǎn)品的成分往往會(huì)發(fā)生變化，也可能變味［6］;而有機(jī)溶劑浸取法往往會(huì)帶來嚴(yán)重的溶劑殘留問題［7］。超臨界流體萃取技術(shù)(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是近年來迅速發(fā)展的一種新型綠色分離技術(shù)，在功能性油脂的開發(fā)利用上已成為熱點(diǎn)領(lǐng)域之一［8］。目前利用超臨界CO2萃取人參脂溶性成分的相關(guān)報(bào)道較少，因此，本研究以5年人工種植人參為原料，應(yīng)用超臨界CO2萃取技術(shù)提取人參中的脂溶性組分，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察超臨界萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間以及夾帶劑用量對(duì)脂溶性成分萃取率的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)萃取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。將萃取物甲酯化后，采用GC-MS對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析與鑒定，為人參脂溶性成分的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參 吉林省白山市撫松縣露水河鎮(zhèn)5年人工種植參，粉碎后過0.84mm(20目)孔徑篩備用;二氧化碳(CO2含量為99.9%，食品級(jí)) 長(zhǎng)春氧氣廠;正己烷(色譜純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠;無水乙醇、氫氧化鉀、甲醇、無水硫酸鈉均為分析純 北京化工廠。

HA121-50-02超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;GCMS-QP2010氣相色譜質(zhì)譜儀(配有GC-MS Real Time Analysis工作站，NIST107美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫) 日本島津公司;FZ102型微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;GB1302電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;101A-2E電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超臨界CO2萃取人參脂溶性成分單因素實(shí)驗(yàn)考察 稱取100g過0.84mm(20目)孔徑篩的干燥人參粉投入萃取罐中，設(shè)定分離釜I和分離釜II的壓力為6MPa，溫度為35℃，控制CO2流量為12L/h，無水乙醇從夾帶劑罐中加入，進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取。萃取到設(shè)定時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II收集萃取物。萃取物經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，得到棕紅色具有特殊香味的油狀物，將油狀物轉(zhuǎn)移到平皿中，置于干燥器內(nèi)，用無水硫酸鈉脫水，備用。根據(jù)式(1)計(jì)算人參脂溶性成分萃取率。

萃取率(%)=(原料的脂肪含量-萃余物的脂肪含量)/原料的脂肪含量×100 式(1)

設(shè)定萃取壓力25MPa、萃取溫度40℃、萃取時(shí)間3h、原料/夾帶劑(g/mL)為1∶0.6，單因素實(shí)驗(yàn)為固定其他因素，研究某因素對(duì)人參脂溶性成分萃取率的影響，各因素水平為:萃取壓力分別為15、20、25、30MPa;萃取溫度分別為35、40、45、50℃;萃取時(shí)間分別為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h;原料/夾帶劑(g/mL)分別選擇 1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1。

1.2.2 超臨界CO2萃取條件的正交優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，每次裝料100g，選擇萃取壓力(MPa)、萃取溫度(℃)、萃取時(shí)間(h)和原料/夾帶劑(g/mL)為考察因素，以人參脂溶性成分萃取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，確定超臨界CO2萃取的最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)的各因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design test

每組實(shí)驗(yàn)在相同的條件下平行3次，以降低實(shí)驗(yàn)操作過程所產(chǎn)生的誤差，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用SPSS 16.0方差分析對(duì)組間和組內(nèi)差異進(jìn)行比較，p＜0.05時(shí)為差異顯著，p＜0.01時(shí)為差異極顯著。

1.2.3 萃取物中人參脂溶性成分的GC-MS分析

1.2.3.1 樣品甲酯化 稱取人參脂溶性成分50mg，置于試管中，加入5mL正己烷，混合使之溶解，再加入0.8mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液2mL，混勻，于30℃恒溫水浴15min，取出靜置后分層，加入無水硫酸鈉脫水后，取上層正己烷相進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.3.2 GC-MS分析條件 色譜條件:色譜柱:HP-5ms石英毛細(xì)管柱(30m ×0.25mm ×0.25μm);進(jìn)樣口溫度:250℃;升溫程序:從80℃開始，先以10℃/min升至200℃，然后以1℃/min升至220℃，再以8℃/min升至280℃，維持3min;載氣為高純度氦氣，流速為1mL/min;進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比50∶1，進(jìn)樣量1μL。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70eV;接口溫度250℃;離子源溫度230℃;四級(jí)桿溫度150℃;溶劑延時(shí)4min;倍增器電壓1300V;質(zhì)量掃描范圍 m/z 40～600。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界CO2萃取人參脂溶性成分單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 萃取壓力的影響 通過單因素方差分析，可知萃取壓力對(duì)人參脂溶性成分萃取率的影響達(dá)到極顯著水平(p＜0.01)，說明萃取壓力是影響萃取的一個(gè)重要因素。由圖1可以看出，在萃取壓力為15～25MPa范圍內(nèi)，隨著萃取壓力的升高，萃取率顯著提高(p＜0.01)。這是由于萃取壓力增大不但會(huì)增加超臨界CO2的密度，還會(huì)減少分子間的傳質(zhì)距離，增加溶質(zhì)和溶劑的傳質(zhì)效率［9］;但當(dāng)萃取壓力由25MPa升到30MPa時(shí)，萃取率提高不顯著(p＞0.05)，這是因?yàn)楦邏合翪O2密度增大，粘度也較大，傳質(zhì)性能變差［10］，而且過高的萃取壓力對(duì)設(shè)備的使用壽命不利［11］。綜合考慮，最佳萃取壓力選用25MPa。

圖1 萃取壓力對(duì)人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

2.1.2 萃取溫度的影響 通過單因素方差分析可知，萃取溫度對(duì)萃取率的影響達(dá)到極顯著水平(p＜0.01)，說明萃取溫度也是影響萃取的一個(gè)重要因素。由圖2可以看出，萃取率先隨溫度升高而增加，40℃時(shí)達(dá)到最大，隨后下降。溫度對(duì)超臨界CO2流體溶解能力影響比較復(fù)雜，一方面，溫度的升高能提供克服萃取組分解離時(shí)動(dòng)能勢(shì)壘必需的熱能，導(dǎo)致溶質(zhì)的揮發(fā)度增大，擴(kuò)散系數(shù)增大，對(duì)萃取有利;另一方面，溫度的升高導(dǎo)致超臨界CO2的密度降低，從而直接影響超臨界CO2的溶解能力［12］。因此，最佳萃取溫度選用40℃。

圖2 萃取溫度對(duì)人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

2.1.3 萃取時(shí)間的影響 由圖3可以看出，在最初階段，萃取率隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加;而當(dāng)萃取時(shí)間超過3h時(shí)，萃取曲線上升幅度變小，幾乎成為一條水平直線，此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，也幾乎無萃取物流出。這是由于萃取初始階段，超臨界CO2僅對(duì)物料顆粒表面的有效成分進(jìn)行萃取，內(nèi)擴(kuò)散阻力較小，因此開始階段萃取效率比較高;隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，超臨界CO2擴(kuò)散入固態(tài)物料內(nèi)部進(jìn)行萃取，內(nèi)擴(kuò)散阻力逐漸增大，降低了傳質(zhì)速率，故萃取效率逐漸降低［13］，而且時(shí)間增加也會(huì)增加能耗，因此最佳萃取時(shí)間選擇3h。

2.1.4 夾帶劑用量的影響 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不加夾帶劑時(shí)，人參脂溶性成分的提取效果很差，加入乙醇可得到滿意的效果。這是由于物料中脂溶性成分含量很低，極少的溶質(zhì)被包埋在固體介質(zhì)內(nèi)部，增大了超臨界流體的傳質(zhì)阻力，并且提取出的少量的脂溶性成分極易粘附在管道中和分離釜罐中，難以接出。加入夾帶劑一方面可以提高超臨界流體的溶解性能［14］，另一方面可以將粘附在管道中的溶質(zhì)攜帶入分離釜中，提高萃取率。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

由圖4可以看出，當(dāng)原料/夾帶劑(g/mL)大于1∶0.6時(shí)，萃取率隨夾帶劑用量的增加而顯著增加(p ＜0.01);而當(dāng)原料/夾帶劑(g/mL)小于1∶0.6時(shí)，萃取率隨夾帶劑用量的增加而變化不顯著(p＞0.05)，因此，最佳的原料/夾帶劑(g/mL)選用1∶0.6。

圖4 料液比對(duì)人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.4 Effect of the ratio of material to entrainer on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2中的R值可以看出，各因素對(duì)超臨界CO2萃取人參脂溶性成分萃取率的影響程度依次為A＞C＞B＞D，即萃取壓力的影響最大，萃取時(shí)間次之，再次為萃取溫度和原料/夾帶劑(g/mL)。由表3的方差分析結(jié)果可知，萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響達(dá)到極顯著水平(p＜0.01)，而萃取溫度和原料/夾帶劑(g/mL)對(duì)萃取率影響不顯著(p＞0.05)，這一結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。最優(yōu)方案為A2B2C3D2，即萃取壓力25MPa、萃取溫度40℃、萃取時(shí)間3.5h、原料/夾帶劑(g/mL)1∶0.6。在此優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到人參脂溶性成分的萃取率為85.38% ±3.16%，超過曹立軍等［15］報(bào)道的超臨界萃取法提取人參油的萃取率。

2.3 超臨界CO2萃取人參脂溶性成分的GC-MS分析

采用GC-MS法對(duì)超臨界萃取物進(jìn)行分析，得其總離子流圖見圖5。經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST107)檢索和人工譜圖解析，鑒定出的超臨界萃取物的化學(xué)成分見表4。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 2 Result of L9(34)orthogonal experiment and range analysis

由表4可以看出，從萃取物中共鑒定出28種化合物。脂肪酸類鑒定出13種(82.39%)，其中不飽和脂肪酸8種(68.64%);甾醇類成分鑒定出2種(2.89%);酯類成分2種(2.23%);倍半萜類化合物5種(1.39%);烯烴類成分2種(1.23%)。另外，還有二十八烷等烷烴類成分(0.37%)，桉油烯醇等高級(jí)烯醇類成分(0.28%)，己醛二乙縮醛等縮醛類化合物(0.17%)以及生育酚(0.43%)。萃取物中含量較高的成分為亞油酸(43.12%)、順-6-十八碳烯酸(21.65%)、棕櫚酸(11.86%)、5-烯-3-醇-豆甾醇油酸酯(2.02%)、豆甾醇(1.75%)和菜油甾醇(1.14%)。在所鑒定的成分中，己醛二乙縮醛、桉油烯醇、17-三十五碳烯、5-烯-3-醇-豆甾醇油酸酯和壬酸等5種化合物在前人相關(guān)研究文獻(xiàn)中未見報(bào)道。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Result of analysis of variance for orthogonal design test

表4 SFE法萃取人參脂溶性成分的GC-MS分析Table 4 GC-MS analysis of the lipid-soluble components from Panax ginseng by SFE

圖5 SFE法提取人參根脂溶性成分的總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of the lipid-soluble components from Panax ginseng by SFE

魏建華等［16］采用超臨界CO2萃取法萃取人參脂溶性成分，從中鑒定出44種化學(xué)成分，但不含有本研究鑒定出的β-丁香烯、白菖烯、α-古蕓烯、γ-欖香烯、桉油烯醇、豆甾醇、菜油甾醇、角鯊烯、生育酚等生物活性成分。分析造成鑒定結(jié)果出現(xiàn)差異的原因，一方面可能與樣品甲酯化前處理方式和計(jì)算機(jī)質(zhì)譜圖庫的限制有關(guān)，另一方面可能與人參產(chǎn)地不同有關(guān)。

張秀麗［17］等采用乙醚回流法提取人參脂溶性成分，并鑒定出較高含量的醇類、脂肪酸及酯類成分，以及少量的醛類、烴類、萜類成分。Richter［18］、楊艷輝［19］等采用水蒸汽蒸餾法提取的人參脂溶性成分以萜烯及其含氧衍生物、烷烴、烯、醛、酮類為主［20］。本研究采用的超臨界CO2萃取法由于具有強(qiáng)溶解能力和高選擇性，能將一些高沸點(diǎn)、脂溶性成分一并提取出來，得到的人參脂溶性成分中富含不飽和脂肪酸、甾醇類化合物、酯類和倍半萜類，但未含有倍半萜烯類的含氧衍生物，這是由于超臨界萃取過程完全密閉而且萃取溫度較低，排除了一些化學(xué)成分遇氧氧化及見光反應(yīng)的可能性。超臨界CO2萃取法提取時(shí)間短、無溶劑污染，并且萃余物仍可作為提取皂苷、多糖以及膳食纖維的良好原料，因而超臨界CO2萃取法是一種優(yōu)異的提取方法，在人參脂溶性成分的工業(yè)化提取方面具有巨大的前景。

3 結(jié)論

通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)超臨界CO2萃取人參中脂溶性成分工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳工藝參數(shù)為:萃取壓力25MPa、萃取溫度40℃、萃取時(shí)間3.5h、原料/夾帶劑(g/mL)1∶06，此時(shí)人參脂溶性成分的萃取率為85.38% ±3.16%，與前人相關(guān)研究文獻(xiàn)相比，本研究的提取率較高。

采用GC-MS對(duì)超臨界CO2萃取法萃取的人參的脂溶性成分進(jìn)行了分析鑒定，共鑒定了28種化合物，以脂肪酸、甾醇類、酯類、倍半萜類以及烯烴類物質(zhì)為主。萃取的人參脂溶性成分中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;其含有的植物甾醇、倍半萜類等化合物也是重要的生物活性物質(zhì)，這些都表明超臨界CO2萃取物具有一定的生物活性。

超臨界CO2萃取法是一種公認(rèn)的油脂類物質(zhì)提取較為完全的方法，可實(shí)現(xiàn)萃取分離一體化，萃取過程短，提取系統(tǒng)密閉、提取溫度低。此外超臨界CO2萃取法具有收率高、無溶劑污染等優(yōu)點(diǎn)，人參作為重要的食藥用植物資源，此法對(duì)于人參脂溶性成分的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用有較好的前景。

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