以聚乙二醇/甲醇為二元致孔劑的新型磺酸甜菜堿型兩性離子親水毛細管整體柱的合成與色譜評價

況媛媛， 王 彥， 谷 雪， 李 靜， 閻 超

(上海交通大學藥學院，上海200240)

近年來，隨著極性化合物的分離分析在藥物分析、藥物代謝、食品和環(huán)境科學［1-4］等領域越來越受到重視，親水作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)得到了快速發(fā)展。親水作用色譜的概念最早由 Alpert［5］于 1990年提出。HILIC可以較好地分析反相色譜不能分離的極性化合物，并且由于它的流動相由有機試劑與水混合而成，彌補了正相色譜對于水溶性物質(zhì)溶解差、保留時間對流動相中水含量敏感以及與質(zhì)譜檢測器不兼容等缺點［6］。

整體柱(monolithic column)是將單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑等混合通過原位聚合制備而成的棒狀連續(xù)床層。因其傳質(zhì)速度快、反壓低、柱效高而被稱為第四代分離介質(zhì)，已在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等［7］樣品的分離分析中顯示優(yōu)勢。親水整體柱集合了親水作用色譜與整體柱的特點，與反相色譜整體柱相比更適合分離極性物質(zhì)，為微分離技術提供了更多的選擇空間。L?mmerhofer等［8］最早采用 2-甲基丙烯酸二甲胺乙酯(DMAEMA)、2-甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和亞乙基二甲基丙烯酸酯(EDMA)共聚獲得DMAEMA-co-HEMA-co-EDMA親水整體柱并應用于布洛芬類非甾體抗炎藥物的分離。Wang等［9］采用HEMA與季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)制備了聚(PETA-co-HEMA)中性整體柱，所制得整體柱表面不帶電荷，適合于分離堿性物質(zhì)［10］。最近，Lin等［11］采用無機單體多面體低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)與HEMA合成了有機-無機硅膠雜化親水整體柱，并成功應用于5種腦啡肽的分離。

以磺酸鹽甜菜堿作為聚合物的制備單體［12］，因其結構中同時含有季銨基和磺酸基兩個活性基團，且二者數(shù)目相等，凈電荷為零，故不易產(chǎn)生自發(fā)聚合，易進行自由基引發(fā)聚合。由于其具有良好的化學及熱穩(wěn)定性及pH值耐受范圍寬等特點而逐漸引起人們的關注。N，N-二甲基-N-甲基丙烯酰胺基丙基-N，N-二甲基-N-丙烷磺酸內(nèi)鹽(SPP)作為磺酸甜菜堿類兩性離子化合物具有很強的親水性，可用于制備親水性固定相。

李新燕等［13］以甲基丙烯酸丁酯(BMA)和磺酸甜菜堿類化合物3-(N，N-二甲基-(2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基)乙基)銨)丙烷-1-磺酸內(nèi)鹽(SPP)為單體，制備了新型的親水作用毛細管整體柱，以加壓毛細管電色譜為技術平臺，無需添加離子對試劑即可用于奶制品中三聚氰胺的定量測定。高也等［14］以SPP與季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)為單體，分別用甲醇/1，4-丁二醇和乙醇/乙二醇為致孔劑制備了親水整體柱，其中用乙醇/乙二醇制備的親水柱與甲醇/1，4-丁二醇制備的親水柱相比，滲透性較差，但柱效較高。本文在此基礎上，以SPP為單體，PETA為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，采用聚乙二醇(PEG)/甲醇作為致孔體系制備了一種新型親水性整體柱，并以毛細管液相色譜(capillary liquid chromatography，cLC)和加壓毛細管電色譜(pressurized capillary electrochromatography，pCEC)為平臺，應用于核苷類、酚類、胺類等極性化合物的分離，獲得了很好的效果。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

SPP和PETA(Sigma-Aldrich，USA);AIBN 和氫氧化鈉(NaOH)(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司);PEG(國藥集團化學試劑有限公司);甲醇和乙腈(色譜純，Tedia公司);去離子水(南京娃哈哈飲料有限公司);γ-(甲基丙烯酰氧)(γ-MAPS;Alfa Aesar，USA);熔融石英毛細管(100 μm i.d.×360 μm o.d.，河北永年銳灃色譜器件有限公司)。胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、肌苷、胞嘧啶、鳥嘌呤、鳥苷(北京百靈威科技有限公司);苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、焦棓酸、間苯三酚、甲酰胺、對甲苯胺、丙烯酰胺、煙酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司)。

TriSep-2100GV加壓毛細管電色譜儀(Unimicro Technologies，Inc.，USA)，包括柱上紫外檢測器、微流控系統(tǒng)、溶劑輸送系統(tǒng)、高壓電源和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng);場發(fā)射掃描電鏡(FEI;Hillsboro，USA);Pore-Master33 Mercury Porosimetry Analyzer全自動壓汞儀(Quantachrome，USA);KQ2200B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 毛細管整體柱的制備

毛細管的預處理:用配制的0.1 mol/L NaOH溶液沖洗毛細管30 min，再用去離子水沖洗10 min至流出的液體為中性;將沖洗過的毛細管用氮氣吹4 h至毛細管完全干燥。將配制好的體積分數(shù)為50%的γ-MAPS甲醇溶液充滿毛細管，兩端用橡膠塞封口，放入25℃恒溫水浴中反應12 h，反應完全后取出毛細管，用甲醇沖洗1 h后通氮氣吹干，備用。

整體柱的制備:稱取適量的PEG與甲醇超聲至完全澄清透明，加入適量的 SPP和 PETA，渦旋3 min，置于水浴中超聲15 min，加入適量的AIBN，超聲10 min，通氮氣排氣5 min;將聚合液用注射器注入到預處理好的毛細管中，兩端用橡膠塞封口，放入60℃水浴中反應20 h。反應結束后將毛細管柱接到高壓泵上，用甲醇沖洗1 h以除去未反應的單體與致孔劑。

在柱填料的末端做標記，利用加熱的電阻絲在標記處燒一段2～3 mm的窗口，截取2 cm的毛細管柱做場發(fā)射掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)實驗。

1.3 整體柱性能的考察

1.3.1 滲透率K的測定

所有試驗均在室溫下進行。在毛細管液相色譜模式下，根據(jù)公式× η［15］計算甲醇通過整體柱時的滲透率K，其中μ為甲醇通過整體柱的線性流速，η為甲醇在室溫下的動態(tài)黏滯度(0.58 mPa)［16］，L為整體柱的有效長度，ΔP為甲醇通過整體柱的柱壓。

1.3.2 整體柱色譜性能的考察

通過毛細管液相色譜和加壓毛細管電色譜分離不同極性化合物考察毛細管整體柱的色譜性能。毛細管整體柱規(guī)格為250 mm(總長500 mm)×100 μm，分流管規(guī)格為2 m×50 μm，分流前進樣環(huán)體積約為1 μL，分流比約為200∶1，實際進樣量為5 nL。

2 結果與討論

2.1 親水整體柱聚合液組成比例的優(yōu)化

致孔劑的種類和用量在很大程度上影響整體柱的孔徑大小及分布，從而影響整體柱的滲透性。致孔劑的選擇原則一般為致孔劑要與單體互溶，且不與單體反應;反應完全后易于去除等。PEG是一種無毒高分子聚合物，具有良好的水溶性，并與多種有機組分有極好的互溶性，一般作為模板劑應用于硅膠整體柱的溶膠-凝膠制備過程，而較少用于聚合物整體柱的制備過程［17］。但由于它的相對分子質(zhì)量范圍可以從幾百到幾萬，可以更好地調(diào)節(jié)聚合物的孔尺寸、密度和體積，因此在本研究中選擇PEG/甲醇為致孔體系。

單體與致孔體系比例的優(yōu)化。依次按照單體與致孔體系的質(zhì)量比為 1∶4、1∶3、1∶2.5、1∶2 制備 A、B、C、D 4批整體柱(見表1)，制備過程中其他反應物含量均保持不變。結果表明，隨著致孔體系含量的減少，整體柱的通透性呈下降趨勢，柱效呈上升趨勢。其中，當單體與致孔體系的質(zhì)量比為1∶2時，聚合液呈現(xiàn)不溶解的狀態(tài)，無法制備均勻連續(xù)的整體柱。綜合考慮柱效和柱的通透性，在后續(xù)的實驗中選擇單體與致孔體系的質(zhì)量比為1∶2.5。

致孔體系內(nèi)部比例的優(yōu)化。依次按照PEG-6000 與甲醇的質(zhì)量比為 1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5 制備E、F、C、G 4批整體柱(見表1)。其中隨著PEG含量的增加，滲透性與柱效呈現(xiàn)升高趨勢。當PEG與甲醇的質(zhì)量比為1∶1.5時，聚合液不溶解，達到飽和狀態(tài)，無法制備擁有均一柱床的整體柱。綜合考慮柱效與滲透性二者的最優(yōu)化，在后續(xù)的實驗中選擇PEG與甲醇的質(zhì)量比為1∶2。

交聯(lián)劑與單體比例的優(yōu)化。按照交聯(lián)劑與單體的質(zhì)量比分別為 1∶2、1∶1.5、1∶1、1∶0.5 制備 H、I、C、J 4批整體柱(見表1)。由表1可見，隨著交聯(lián)劑比例的增大，整體柱的滲透性越來越小，柱效增加;當PETA與SPP的質(zhì)量比為1∶0.5時，交聯(lián)劑比例過大導致整體柱滲透性太差，甲醇無法將整體柱沖開。綜上所述，在后續(xù)的實驗中選擇單體與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為1∶1。

表1 制備親水整體柱聚合液的組成Table 1 Composition of polymerization mixtures for the preparation of hydrophilic monolithic columns

PEG隨著聚合度的增加，熔點和黏度也都相應增大，我們選取了相對分子質(zhì)量從2 000到10 000的PEG作為致孔劑制備親水整體柱，考察PEG的相對分子質(zhì)量對整體柱的孔徑、柱效以及滲透性等因素的影響(見表2)?？梢?，由不同相對分子質(zhì)量的PEG制備而成的整體柱存在差異，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，整體柱的滲透性與柱效均呈升高趨勢，這可能是因為隨著相對分子質(zhì)量的增大，致孔劑溶液中存在著更大的空間位阻，導致貫穿孔增多，滲透性增大，但用PEG-6000制備的柱C的柱效高于用PEG-10000制備的柱M，柱效達到148 000塔板/m。綜合以上所有因素，選取親水整體柱的最優(yōu)化制備條件為:單體與致孔劑的質(zhì)量比為1∶2.5，致孔劑中PEG-6000與甲醇的質(zhì)量比為1∶2，SPP與 PETA的質(zhì)量比為1∶1，AIBN為總質(zhì)量的0.1%。

表2 以不同相對分子質(zhì)量的PEG制備的整體柱的滲透性及柱效Table 2 Permeabilities(K)and column efficiencies of the monolithic columns prepared using PEG with different relative molecular masses

2.2 整體柱的表征

2.2.1 整體柱的形貌表征

用場發(fā)射掃描電鏡表征最終制得的聚合物親水整體柱的骨架與大孔尺寸。從圖1可以看出，在優(yōu)化條件下制備的整體柱擁有均一的孔結構，固定相與毛細管管壁牢固地結合成一個整體，沒有發(fā)生脫落的現(xiàn)象;整體結構中有微米級的貫穿孔，保證了整體柱有良好的通透性。

2.2.2 整體柱的孔徑分布

通過壓汞法測得整體柱的平均孔徑為208 nm左右。根據(jù)文獻［18］可以計算出整體柱的孔隙率為0.72。

由以上數(shù)據(jù)可以看出，整體柱具有較大的孔徑及較高的孔隙率，通透性相對較好。

2.3 親水整體柱的色譜性能

在cLC模式下，在不同流速下對制備的整體柱C擬合范第姆特方程曲線(見圖2)。當線性流速達到0.778 mm/s時，最高柱效為1.02 ×105塔板/m。另外，在cLC模式下對整體柱C的親水性進行了考察。當流動相中乙腈含量為95%時，甲苯、丙烯酰胺和硫脲3種物質(zhì)的出峰順序與極性相關，極性越大出峰越晚;在反相色譜模式下不保留的硫脲在17 min左右出峰，說明整體柱C具有良好的親水性。

圖1 親水整體柱C場發(fā)射掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM photographs of the hydrophilic monolithic column C

圖2 親水整體柱C的范第姆特方程曲線Fig.2 van Deemter plot of the height equivalent to a theoretical plate height as a function of flow rate of hydrophilic monolithic column CConditions:cLC mode;column dimension，250 mm(total length 500 mm)×100 μm;mobile phase，ACN/H2O(88/12，v/v)containing 10 mmol/L ammonium formate;detection，UV at 214 nm.

2.4 親水整體柱的重復性與穩(wěn)定性

選取甲苯與丙烯酰胺為樣品，在cLC模式下考察親水整體柱的保留因子與柱效的重復性與穩(wěn)定性，結果如表3所示。其中整體柱的日內(nèi)與日間RSD均小于5%。同時考察不同批次間親水整體柱保留因子與柱效的重復性，6根整體柱的RSD均在可接受范圍內(nèi)，表明所制備的整體柱具有良好的重復性與穩(wěn)定性。

表3 親水整體柱C的保留因子與柱效的重復性Table 3 R eproducibilities of retention factor and column efficiencies on column C

2.5 對于分離機理的探討

HILIC分離機理［19］被認為是多種機理的混合作用，如氫鍵、吸附、偶極矩為初級作用機理;而帶電荷的固定相可以提供第二個十分重要的有選擇性的保留作用，也就是待分離物質(zhì)與固定相上的電荷之間的靜電作用。并且HILIC的作用機理受到許多因素的影響，最主要的是受到固定相的種類、流動相中有機相的含量、流動相的pH以及緩沖鹽離子濃度等因素的影響。

為了研究磺酸甜菜堿兩性離子親水整體柱的分離機理，我們選取甲苯、丙烯酰胺、硫脲3種極性相差較大的物質(zhì)，通過改變流動相中有機相乙腈的含量來考察3種物質(zhì)保留時間的變化趨勢。如圖3所示，在流動相中乙腈含量超過39%時，硫脲的保留時間比甲苯和丙烯酰胺長;且在乙腈含量由95%降至39%的過程中，硫脲的保留時間也在逐漸降低;在乙腈含量繼續(xù)降至20%的過程中，硫脲的保留時間下降趨勢減緩，趨于穩(wěn)定狀態(tài)。甲苯因其非極性較強，在乙腈含量從95%降到50%的過程中，它的保留時間先略微增長然后基本保持不變;當乙腈含量低于50%后，隨著乙腈含量的降低，甲苯的保留時間急劇升高;當乙腈含量低于39%時，甲苯在硫脲后面出峰。丙烯酰胺由于其極性介于甲苯與硫脲之間，所以隨著流動相中乙腈含量的升高呈現(xiàn)大致升高的趨勢，在乙腈含量從50%上升到95%的過程中，其保留時間超過甲苯。結果表明，當乙腈含量大于50%時，整體柱的分離機理表現(xiàn)為親水作用機理［20］。

2.6 親水整體柱的應用

2.6.1 核苷類化合物的分離

由于核苷類化合物具有強極性，因而很難在反相色譜模式下得到較好的分離。為此，我們采用親水模式，分別從流動相pH、鹽濃度以及流動相中乙腈含量等分離條件對核苷類物質(zhì)的分離進行了優(yōu)化。

圖3 流動相中乙腈含量對甲苯、丙烯酰胺、硫脲保留時間的影響Fig.3 Influence of the ACN content in mobile phase on the retention times of toluene，acrylamide and thioureaConditions:cLC mode;column dimension，250 mm(total length 500 mm)×100 μm;mobile phase，ACN/H2O system with different volume ratios，containing 10 mmol/L ammonium formate;flow rate，0.05 mL/min;detection，UV at 214 nm.

在cLC模式下8種核苷類化合物隨pH的變化趨勢大致相同，依次調(diào)整流動相的pH 為3、5、7、9，8種物質(zhì)的保留因子都是先增大后減小，當pH值為7時達到最大值。各樣品的pKa值分別為胸腺嘧啶9.94，尿嘧啶 9.5，腺嘌呤 9.8，尿苷 9.25，肌苷 8.9，胞嘧啶12.16，鳥嘌呤9.92，鳥苷9.36?？紤]到當流動相的pH為3、5、7時，親水保留機理和離子交換保留機理共同作用，此時樣品均呈正電性，更易與磺酸根發(fā)生離子交換，但磺酸根隨著pH增大會呈解離狀態(tài)，而核苷類物質(zhì)在此時也都是正電性，所以離子交換程度增大;pH在7～9范圍時核苷類物質(zhì)的正電性減弱，離子交換程度降低，因此保留減弱。

同樣，我們也考察了流動相中甲酸銨的濃度對核苷類物質(zhì)保留的影響。實驗中將流動相的甲酸銨濃度從10 mmol/L一直升高到70 mmol/L，這些核苷類物質(zhì)在整體柱上的保留先增大后減小，當甲酸銨濃度為40 mmol/L時保留因子最大;當甲酸銨濃度從10 mmol/L升高到40 mmol/L時，樣品的保留逐漸增大。根據(jù)Alpert［21］的理論，在流動相的鹽濃度逐漸增大的情況下，越來越多的鹽離子進入固定相的水化層，從而增大了固定相的容積，使樣品保留增加。當甲酸銨濃度從40 mmol/L增加到70 mmol/L時，水化層中鹽離子數(shù)量足夠多，以至于與固定相中的磺酸根離子發(fā)生離子交換，使樣品與固定相的離子交換減弱，保留也隨之減弱。

通過以上考察我們選取pH為7，流動相中甲酸銨濃度為40 mmol/L作為核苷類物質(zhì)的分離條件。另外，我們也考察了不同含量的乙腈對分離的影響。如圖4所示，在95%乙腈條件下，各物質(zhì)因結構相似很難達到有效分離;在90%乙腈條件下，峰形與分離度都有所改善，其中只有尿苷與肌苷未達到基線分離;當乙腈濃度減少為85%時，8種物質(zhì)的保留時間較為接近，分離度變差。所以我們選擇90%乙腈作為后續(xù)的實驗條件。

圖4 乙腈含量對核苷化合物在親水整體柱C上分離的影響Fig.4 Effect of ACN content on the retention of nucleosides on hydrophilic monolithic column CConditions:cLC mode;column dimension，250 mm(total length 500 mm)×100 μm;mobile phase，ACN/H2O system with different volume ratios，containing 40 mmol/L ammonium formate;flow rate，0.05 mL/min;detection，UV at 254 nm.Peaks:0.toluene;1.thymine;2.uracil;3.ademine;4.uridine;5.inosine;6.cytosine;7.guanine;8.guanosine.

在加壓毛細管電色譜模式下，整體柱兩端施加正電。如圖5所示，隨著電壓的增大，峰形變好，分離度提高，柱效也有所增加，其中電壓為10 kV時8種核苷類化合物都得到基線分離;15 kV時分離度并未繼續(xù)提高，而峰形卻不如10 kV時。綜上所述，8種核苷化合物的最優(yōu)分離條件為pH為7，甲酸銨濃度為40 mmol/L，電壓為10 kV。

2.6.2 其他極性化合物的分離

酚類化合物的分離 圖6為親水整體柱C對酚類化合物的分離圖。結果顯示，隨著化合物中羥基數(shù)目的增加，保留時間相應增加，6種酚類混合物得到基線分離，出峰順序也與文獻［22］報道一致。

胺類化合物的分離 在毛細管液相色譜模式下對胺類極性小分子化合物進行了分離并獲得了理想效果。如圖7a所示，其中分離N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺的柱效可達到2.4×105塔板/m，而圖7b中，乙酰苯胺與N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺的分離度為1.4，沒有達到基線分離。

圖5 分離電壓對核苷化合物在親水色譜柱C上分離的影響Fig.5 Effect of separation voltage on the retention of nucleosides on hydrophilic monolithic column CConditions:pCEC mode;mobile phase，ACN/H2O(90/10，v/v)containing 40 mmol/L ammonium formate，pH 7;others are the same as in Fig.4.Peak identifications are the same as in Fig.4.

圖6 親水色譜柱C對酚類化合物的分離Fig.6 Chromatogram of phenols on hydrophilic monolithic column CConditions:cLC mode;mobile phase，ACN/H2O(95/5，v/v)containing 10 mmol/L ammonium formate;detection，UV at 214 nm;others，same as in Fig.4.Peak identifications:0.toluene;1.phenol;2.quinol;3.catechol;4.resorcinol;5.pyrogallol;6.phloroglucinol.

雜環(huán)類化合物的分離 雜環(huán)類化合物具有一定的生物活性，在醫(yī)藥領域中有廣泛的應用。由于雜環(huán)類化合物結構較為相近，分離困難，我們用制備的新型親水整體柱C在加壓電色譜模式下在7 min內(nèi)分離了4種雜環(huán)類化合物，如圖8所示，4種物質(zhì)達到了基線分離。

圖7 親水色譜柱C對胺類化合物的分離Fig.7 Chromatograms of amides on hydrophilic monolithic column CThe conditions are the same as in Fig.6.Peak identifications:a.0.toluene;1.paratoluidine;2.N，N'-dimethylenebisacrylamide;3.formamide;4.thymine.b.0.toluene;1.acetanilide;2.N，N'-dimethylenebisacrylamide;3.acrylamide;4.nicotinamide;5.formamide.

圖8 親水色譜柱C對雜環(huán)類化合物的分離Fig.8 Electrochromatogram of heterocyclics on hydrophilic monolithic column CConditions:pCEC mode;mobile phase，ACN/H2O(88/12，v/v)containing 10 mmol/L ammonium formate;backpressure，6.4 MPa;applied voltage，20 kV;others，same as in Fig.7.Peak identifications:0.toluene;1.caffeine;2.theophyline;3.nicotin;4.thymine.

3 結論

本文以PEG/甲醇為二元致孔劑，SPP與PETA為單體，原位聚合制備了親水整體柱;所制備的整體柱機械強度好，孔徑分布均勻，滲透性好，反壓低，并且具有良好的親水性，能夠很好地分離酚類、胺類、雜環(huán)類、核苷類等極性較大的物質(zhì)，可以作為反相色譜應用的補充，也可為親水-反相色譜聯(lián)用提供新的思路。

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