四氧化三鐵/單壁碳納米管磁性復(fù)合納米粒子分散固相微萃取-高效液相色譜法測定牛奶中的香精添加劑

李海芳， 楊紅云， 張 英， 王培龍， 林金明*

(1.清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084;2.國家人造板與木竹制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京100091;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京100081)

磁性納米顆粒作為一種新型的樣品前處理萃取材料，因具有大的比表面積和外加磁場下的操控性，被越來越多地應(yīng)用于樣品前處理［1，2］。目前，通過修飾和包覆磁性納米材料表面使其具有吸附特性是制備磁性萃取材料最常用的合成方法［3］。碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)由于其表面特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，具有很強的吸附性能，在樣品前處理方面具有很好的應(yīng)用前景［4，5］，近年來已被嘗試用于環(huán)境污染物的富集［6，7］。合成的 CNTs水溶性差，也難溶于有機溶劑，在溶液中容易發(fā)生團聚，這些缺點使得CNTs直接用于樣品前處理特別是液態(tài)基質(zhì)樣品受到很大的限制。為了克服這些缺點，將CNTs修飾在納米或微米級的硅膠或磁性顆粒上，能夠很好地增強CNTs的操控性和溶劑分散性［3，8，9］。本研究以具有良好順磁性的 Fe3O4納米顆粒為CNTs的固相載體，合成了復(fù)合性納米粒子Fe3O4/CNTs，并用于微量、痕量組分的分散固相微萃取富集。

在奶制品加工過程中，為了提高香濃性，同時為了掩蓋奶源由于供應(yīng)季節(jié)性變化和地區(qū)不同的差異性，具有奶香味的香精常作為添加劑。香蘭素與乙基香蘭素具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香，在食品工業(yè)中作為香精添加劑被廣泛使用。對香蘭素和乙基香蘭素生物化學(xué)毒性的研究已有大量文獻(xiàn)報道，超劑量的香蘭素和乙基香蘭素會損害身體健康［10］。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2011的規(guī)定，凡使用范圍涵蓋0至6個月嬰幼兒的配方食品不得添加任何食用香料，較大嬰兒和幼兒的配方食品中香蘭素和乙基香蘭素最大使用量為50 mg/L。監(jiān)控嬰幼兒配方食品特別是奶制品中香精添加劑的含量是非常必要的。由于奶制品的基質(zhì)非常復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、磷脂、維生素和無機鹽等，進(jìn)行微量目標(biāo)物的測定常需要進(jìn)行樣品前處理［11］。關(guān)于牛奶中香蘭素和乙基香蘭素的富集與測定已有不少文獻(xiàn)報道，包括中空纖維液相微萃?。?2］、固相微萃?。?3］、離子液體萃取［14］、分子印記［15］等樣品前處理方法。

本文通過化學(xué)鍵合的方法制備了單壁碳納米管包覆的Fe3O4/CNTs納米粒子，將其用作分散固相微萃取劑快速富集牛奶中的香蘭素和乙基香蘭素，并采用高效液相色譜法進(jìn)行定量分析。通過優(yōu)化影響萃取效果的關(guān)鍵因素(包括洗脫溶劑、樣品pH值、樣品離子強度等)，發(fā)展了一種快速、高效的牛奶香精添加劑的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi L2000液相系統(tǒng)，配紫外檢測器;傅里葉變換顯微紅外光譜儀(Nicolette 5DXB FT-IR)。

香蘭素和乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品，乙二醇、無水醋酸鈉、氨丙基三乙基硅烷化試劑(3-aminopropyltriethoxysilane，APTES)和聚乙二醇均購自 Sigma-Aldrich公司。正己烷、二氯甲烷、苯、甲苯和甲醇購自J.T.Baker公司。1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)購自吉爾生化(上海)有限公司。FeCl3·6H2O、磷酸、濃硫酸和硝酸由北京試劑廠生產(chǎn)。單壁碳納米管(直徑1～2 nm，長度約20 μm，比表面積＞380 m2/g)購自中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司。

1.2 磁性復(fù)合納米粒子Fe3O4/CNTs的制備

［16］的基礎(chǔ)上，按照圖1所示的基本原理制備磁性復(fù)合納米粒子Fe3O4/CNTs。首先采用水熱法制備Fe3O4磁性納米顆粒，并采用APTES硅烷化試劑對Fe3O4顆粒表面進(jìn)行氨基化修飾。同時，用強酸對單壁碳納米管進(jìn)行酸化處理使其表面帶上羧基。最后，將羧基化的CNTs通過交聯(lián)劑修飾到氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒表面。

1.2.1 磁性納米材料Fe3O4的制備及表面氨基化

磁性納米材料Fe3O4的制備采用水熱還原法［17，18］。利用乙二醇將 FeCl3還原為 Fe3O4;加入靜電穩(wěn)定劑無水醋酸鈉和表面活性劑聚乙二醇，防止顆粒團聚。具體反應(yīng)條件為:稱取1.35 g FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇中，磁力攪拌下加入3.6 g無水醋酸鈉和1.0 g聚乙二醇，在60℃下劇烈攪拌至完全溶解，然后將混合溶液轉(zhuǎn)入50 mL的反應(yīng)釜中，在200℃下反應(yīng)12 h，然后冷卻至室溫。對合成的Fe3O4納米顆粒用水與無水乙醇交替清洗，在80℃下真空烘干備用。

稱取150 mg Fe3O4納米顆粒于乙醇中超聲分散，然后轉(zhuǎn)至250 mL三口燒瓶中，攪拌升溫至60℃，再緩慢勻速滴加300 μL的 APTES，升溫至80℃，冷凝回流反應(yīng)6 h。過濾收集固體反應(yīng)產(chǎn)物，用無水乙醇與去離子水反復(fù)洗滌后，得到Fe3O4-NH2磁性納米顆粒。

圖1 Fe3O4/CNTs磁性納米顆粒的制備Fig.1 Preparation of Fe3O4/CNTs

1.2.2 CNTs的表面羧基化

稱取CNTs 100 mg加入裝有H2SO4/HNO3(3∶1，v/v)混合酸的50 mL離心管中，于60℃下超聲8 h，冷卻后倒入冰水中，于10 000 r/min下離心分離10 min，收集下層的CNTs-COOH產(chǎn)物并反復(fù)用蒸餾水洗滌至中性，于80℃真空干燥箱中烘干備用。

1.2.3 Fe3O4/CNTs材料的制備

取130 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.0)，置于500 mL三口燒瓶中，加入50 mg的 CNTs-COOH，充分?jǐn)嚢?500 r/min)。準(zhǔn)確稱取50 mg EDC、100 mg NHS分別溶解于10 mL磷酸緩沖溶液(pH 7.0)中，然后將二者加入到三口燒瓶中劇烈攪拌(500 r/min)30 min，使CNTs-COOH充分活化。最后加入200 mg的Fe3O4-NH2磁性納米顆粒，充分反應(yīng)2 h后終止反應(yīng)。將最終反應(yīng)物Fe3O4/CNTs用蒸餾水和無水乙醇反復(fù)清洗，將其放入80℃真空干燥箱中烘干備用。

1.3 液相色譜定量分析

采用外標(biāo)曲線法定量。分別配制1 000 mg/L香蘭素和乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇儲備液，采用逐級稀釋的方法配制濃度梯度為 200、100、50、5、0.1、0.01 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，做外標(biāo)曲線?？疾鞕z出限、定量限和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

色譜分離采用Lichrospher ODS-BP色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫為 40 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，流動相為甲醇/水(60/40，v/v)，流速為 0.8 mL/min，紫外檢測波長為293 nm。

1.4 基于Fe3O4/CNTs的分散固相微萃取

1.4.1 牛奶樣品的預(yù)處理

稱取牛奶約10 mL，加入20 mL乙腈，加入0.01 mol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 為 11.0，超聲 5 min，于10 000 r/min離心15 min;移取樣品上清液，在其中加入0.01 mol/L HCl調(diào)節(jié) pH 至3.0，用 0.45 μm濾膜過濾，用水定容至100 mL。

1.4.2 牛奶樣品的Fe3O4/CNTs分散固相微萃取

稱取10 mg的Fe3O4/CNTs磁性納米顆粒置于5.0 mL離心管中，依次采用正己烷、丙酮、甲醇和去離子水清洗和活化;然后加入預(yù)處理后的牛奶樣品2 mL，超聲5 min;用磁鐵將Fe3O4/CNTs顆粒分離收集在離心管底部，棄去樣品廢液。加入0.1 mL去離子水洗滌Fe3O4/CNTs，然后加入1.5 mL甲醇洗脫富集在Fe3O4/CNTs的目標(biāo)物，洗脫液用氮氣濃縮，再用移液器加入200 μL甲醇重新溶解，待HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4/CNTs的表征與性能評價

分別采用透射電鏡、傅里葉紅外光譜儀等對制備的Fe3O4/CNTs磁性納米顆粒的物相、粒度、表面功能團進(jìn)行了表征。

2.1.1 紅外光譜表征

圖2 CNTs和Fe3O4納米顆粒修飾前后的紅外光譜譜圖Fig.2 FTIRspectra of CNTs and Fe3O4nanoparticles before and after modificationa.FTIR spectra of Fe3O4nanoparticles before and after amino silanization modification;b.comparison of FTIR spectra of CNTs，CNTs-COOH and Fe3O4/CNTs.

采用KBr壓片的方法，對各步驟的合成產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜表征。圖2a為Fe3O4納米顆粒APTES硅烷修飾前后的譜圖對比。水熱法合成的Fe3O4在579 cm－1處有Fe－O －Fe鍵的伸縮振動峰，是Fe3O4的特征吸收峰;在3 409 cm－1處的吸收峰是－OH的伸縮振動峰，對應(yīng)的彎曲振動峰在1 623 cm－1處，表明在Fe3O4納米顆粒表面存在 －OH。經(jīng)APTES修飾后，出現(xiàn)1 105 cm－1處的Si－O 鍵特征吸收峰，2 921 cm－1處－CH2的C－H伸縮振動峰。1 623 cm－1和3 423 cm－1處的加強峰推斷為Fe3O4顆粒表面－NH2的特征峰以及殘余的－OH峰。這些吸收峰表明Fe3O4納米顆粒表面修飾上了硅烷化氨基。圖2b是 CNTs、羧基化 CNTs和Fe3O4/CNTs的紅外光譜對比。可以看出，經(jīng)過強酸處理后的CNTs在1 700 cm－1處具有非常明顯的羧基官能團吸收峰，同時在3 435 cm－1處存在很明顯的 －OH峰，表明碳納米管表面修飾上了 －COOH。在 Fe3O4/CNTs的紅外譜圖中，1 720 cm－1處為 C=O 的伸縮振動峰，3 440 cm－1、1 530 cm－1與 1 210 cm－1處為仲酰胺的特征峰，表明CNTs成功接枝在磁性顆粒Fe3O4的表面。

2.1.2 納米顆粒的粒度與分散性

用透射電鏡(TEM)表征制備的納米顆粒的粒度和形貌。如圖3a所示，通過水熱法合成的Fe3O4磁性碳納米顆粒為規(guī)則的球形，且顆粒均勻，分散性好。粒徑基本在200～300 nm范圍內(nèi)。在這個范圍內(nèi)的磁性納米顆粒，具有很高的比表面積及很強的磁性。圖3b為CNTs包覆后的Fe3O4顆粒的TEM圖，可以看出CNTs包覆層的結(jié)構(gòu)是比較松散的。如圖3c所示，經(jīng)超聲分散后，F(xiàn)e3O4/CNTs顆粒在無水乙醇中具有很好的分散性，且在外加磁場作用下，F(xiàn)e3O4/CNTs顆粒能夠迅速從溶液中被分離收集。

圖3 制備的Fe3O4/CNTs納米顆粒的形貌與分散性Fig.3 Characterization of feature and dispersivity of the prepared nanoparticlesa，b.TEM images of prepared Fe3O4and Fe3O4/CNTs;c.dispersive Fe3O4/CNTs in ethanol reagent(left)and with external magnet(right).

2.2 Fe3O4/CNTs分散固相微萃取條件的優(yōu)化

以Fe3O4/CNTs為固相萃取材料富集香蘭素和乙基香蘭素，考察了吸附容量、洗脫溶劑、樣品溶液的pH值及離子強度、萃取時間等因素對富集效果的影響。

2.2.1 吸附容量的測定

吸附容量是衡量吸附劑萃取能力的主要指標(biāo)。本實驗采用50 mg/L的香蘭素與乙基香蘭素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過改變加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積監(jiān)測Fe3O4/CNTs固相萃取材料的吸附容量。實驗結(jié)果表明，10 mg的Fe3O4/CNTs固相萃取材料的吸附飽和量為250 μg，吸附容量為25 mg/g。

2.2.2 洗脫溶劑的選擇

比較了正己烷、二氯甲烷、苯、甲苯、甲醇等溶劑對富集在Fe3O4/CNTs上的香蘭素和乙基香蘭素的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)甲醇對香蘭素和乙基香蘭素具有更高的洗脫效率。因此選擇甲醇為洗脫溶劑。

2.2.3 樣品溶液pH值的影響

樣品溶液的pH值是影響被分析物在樣品介質(zhì)與萃取溶劑之間分配系數(shù)的一個重要因素。如圖4所示，考察pH在1.0～13.0范圍內(nèi)香蘭素和乙基香蘭的萃取效率，發(fā)現(xiàn)萃取效率隨著溶液pH值的升高而降低。特別是在堿性條件下，萃取效率急速下降。原因是香蘭素與乙基香蘭素均含有酚羥基，在堿性條件下，二者會以酚鹽的形式溶解在水溶液中，不利于萃取。雖然pH 1.0時的萃取效率比pH 3.0時略高，但過低的pH值會影響Fe3O4/CNTs材料的穩(wěn)定性，最終選擇樣品溶液的最佳pH值為3.0。

圖4 樣品溶液的pH對萃取效率的影響Fig.4 Effect of the pH value of the sample solution on the extraction efficiencyExtraction conditions:sample，1 mg/L of vanillin and ethyl vanillin with 10%(m/m)NaCl added;extraction time，5 min.

2.2.4 樣品溶液離子強度的影響

在固相萃取過程中，樣品溶液的離子強度是影響萃取效率的重要因素之一。通過向樣品溶液中加入鹽來增加離子強度，可以減小待測物質(zhì)在水溶液中的溶解度，提高萃取效率。根據(jù)鹽析效應(yīng)，向溶液中加入NaCl會降低香蘭素和乙基香蘭素在水相中的溶解度，有助于提高二者的萃取效率。實驗考察了NaCl含量為0～25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時對香蘭素和乙基香蘭素萃取效率的影響。在NaCl含量為10%時萃取效率達(dá)到最大值;繼續(xù)增大NaCl含量，萃取效率反而略有減弱，這是因為隨著鹽濃度的繼續(xù)增加溶液的黏度會加大，使分析物的擴散速率降低，在固定的萃取時間內(nèi)不能達(dá)到萃取平衡，導(dǎo)致萃取效率降低。故選擇在樣品溶液中添加10%的NaCl。

2.2.5 萃取時間的影響

萃取時間是固相萃取技術(shù)的重要參數(shù)之一。當(dāng)吸附劑與目標(biāo)物之間未達(dá)到吸附平衡時，隨著萃取時間的增加，萃取效率通常會增加。同時，在保證富集效果的前提下，應(yīng)該盡量縮短萃取時間?？疾炝?～7 min的萃取時間對香蘭素和乙基香蘭素萃取效率的影響。如圖5所示，萃取富集5 min時香蘭素和乙基香蘭素的萃取效率達(dá)到最大值。

圖5 萃取時間對萃取效率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction efficiencyExtraction conditions:the standard solution containing 1 mg/L of vanillin and ethyl vanillin as the model by adjusting pH value to 3.0 and adding 10%NaCl.

2.3 富集效果與分析方法的性能評價

在最優(yōu)化的條件下，考察了香蘭素與乙基香蘭素在0.1～100 mg/L范圍內(nèi)的線性相關(guān)性、檢出限、定量限以及峰面積的重復(fù)性(RSD)。如表1所示，使用Fe3O4/CNTs分散固相微萃取與高效液相色譜分析聯(lián)用的方法，檢測具有較高的靈敏度，對香蘭素和乙基香蘭素的檢出限達(dá)到10 μg/L，完全能夠滿足牛奶中香蘭素和乙基香蘭素的檢測。對質(zhì)量濃度為5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)6次的萃取與色譜分析，香蘭素和乙基香蘭素的RSD分別為4.9%和5.1%，表明方法具有較好的重現(xiàn)性。

表1 固相微萃取方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和重復(fù)性Table 1 Linear ranges，correlation coefficients(R2)，limits of detection(LODs)，limits of quantification(LOQs)of the SPME method

2.4 實際樣品檢測

分別對不同類型的奶制品包括牛奶、酸牛奶、嬰兒配方奶粉進(jìn)行檢測。圖6是對牛奶樣品的檢測譜圖，香蘭素和乙基香蘭素均被檢出，含量分別為(11.6±0.6)mg/L和(10.3±0.5)mg/L。如表2所示，在酸奶中也同時檢測到了香蘭素和乙基香蘭素添加劑，在嬰兒奶粉中只檢測到香蘭素添加劑。令人欣慰的是所有樣品中的香蘭素和乙基香蘭素添加劑均未超過國家規(guī)定的限量值。

向?qū)嶋H樣品中分別添加1 mg/L的香蘭素和乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品，在最優(yōu)化的萃取和色譜分析條件下進(jìn)行回收率測定。對于不同類型的實際加標(biāo)樣品，香蘭素和乙基香蘭素的回收率均大于92%，表明Fe3O4/CNTs萃取和色譜分析方法具有很高的準(zhǔn)確度和適用性。

圖6 (a)牛奶樣品和(b)加標(biāo)(1.0 mg/L香蘭素和乙基香蘭素)牛奶樣品的色譜圖Fig.6 Chromatograms of(a)a real milk sample and(b)the real milk sample spiked with 1.0 mg/L vanillin and ethyl vanillinPeak identifications:1.vanillin;2.ethyl vanillin.

表2 不同奶制品中香蘭素和乙基香蘭素的含量Table 2 Contents of vanillin and ethyl vanillin in different milk products

3 結(jié)論

本研究建立了磁性納米Fe3O4/CNTs分散固相微萃取與高效液相色譜聯(lián)用快速檢測香蘭素和乙基香蘭素的方法。在酸性介質(zhì)條件下，合成的Fe3O4/CNTs固相萃取劑對奶類制品中的香蘭素和乙基香蘭素具有較好的萃取效果和較高的回收率，其檢出限達(dá)10 μg/L。另外，結(jié)合不同的樣品預(yù)處理技術(shù)，該方法還可推廣應(yīng)用到其它類型食品中香蘭素和乙基香蘭素添加劑的檢測。

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