保留時(shí)間兩點(diǎn)校正反相高效液相色譜法測(cè)定持久性有機(jī)污染物的正辛醇-水分配系數(shù)

梁 超， 喬俊琴，2， 葛 欣*， 練鴻振，2*

(1.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京210093;2.南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心，江蘇南京210093)

正辛醇-水分配系數(shù)(Kow)作為持久性有機(jī)污染物(POPs)的一個(gè)重要物理化學(xué)常數(shù)，一般用來表征POPs在環(huán)境介質(zhì)中從水相至有機(jī)相或者生物膜的遷移、轉(zhuǎn)化、吸附等過程的傾向。在研究POPs的生物富集過程時(shí)，Kow還與POPs的生物累積性以及毒性等相關(guān)，因此，Kow數(shù)據(jù)是研究POPs的環(huán)境行為和毒性的一個(gè)非常重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，特別是在定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)的研究中具有重要作用［1－4］。

多環(huán)芳烴(PAHs)、多氯二苯并二惡英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs)是3類典型的POPs化合物。作為最傳統(tǒng)的POPs，PAHs廣泛存在于人類生活的自然環(huán)境如大氣、水體、土壤、作物和食品中，其中的多種化合物已被證明具有致癌毒性，特別是相對(duì)分子質(zhì)量較高的多環(huán)芳烴(如苯并［a］芘)，一直是國內(nèi)外廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)［5－8］。PCDDs和PCDFs是兩類在化學(xué)及毒理學(xué)性質(zhì)方面相似的化合物，統(tǒng)稱為二惡英，PCDD/Fs在環(huán)境樣品中含量低，且1－8氯代的異構(gòu)體共有210個(gè)，包括75種PCDDs和135種PCDFs，其中部分異構(gòu)體具有強(qiáng)烈的毒性，因而也引起了國際社會(huì)的廣泛關(guān)注［9－11］。PCDD/Fs并非人為制造，而是一些工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，主要涉及垃圾焚燒、造紙工業(yè)、含氯化學(xué)品生產(chǎn)及金屬冶煉過程［9］。十溴二苯乙烷(DBDPE)作為已被歐美地區(qū)禁用或限用的阻燃劑十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的替代品，在我國已被廣泛應(yīng)用在電子電器、電線、紡織等的纖維和聚酯材料中，由于其性質(zhì)與BDE209相近，它的潛在危害正逐漸受到環(huán)境科學(xué)界的高度重視［12－14］。

然而，迄今為止，POPs的Kow實(shí)驗(yàn)值鮮有報(bào)道，而以計(jì)算值居多。由于這些POPs的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，致使不同的計(jì)算方法給出的結(jié)果往往大相徑庭;而在為數(shù)不多的實(shí)驗(yàn)測(cè)得的Kow數(shù)據(jù)中，即使對(duì)于同一個(gè)化合物，不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的數(shù)據(jù)之間偏差也較大。產(chǎn)生這種偏差的主要原因可能是它們的高疏水性使得搖瓶法(SFM)［15］或慢攪法(SSM)［16］不再適合測(cè)定其Kow。由于操作的簡便性和結(jié)果的可靠性，反相高效液相色譜法(RP-HPLC)已成為測(cè)定高疏水性POPs類化合物Kow值的主要推薦方法［17］，該方法是基于溶質(zhì)的logKow與其在純水相洗脫條件下的保留因子對(duì)數(shù)值logkw的線性關(guān)系［18］，但對(duì)于疏水性較強(qiáng)(logKow＞6)的POPs，由于其在色譜體系中保留過強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)周期較長，導(dǎo)致硅膠固定相老化而產(chǎn)生保留時(shí)間tR漂移，這使得kw外推誤差變大，從而影響了這類POPs的Kow測(cè)量的準(zhǔn)確性;其次，對(duì)于疏水性較強(qiáng)的POPs，其在低有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例的流動(dòng)相下的tR太長而難以測(cè)量，而通過完全在高有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例下的保留因子外推得到的kw又不夠準(zhǔn)確。鑒于準(zhǔn)確可靠的Kow數(shù)據(jù)在典型POPs的環(huán)境行為和生物毒理研究中的重要地位，我們利用改進(jìn)的RP-HPLC方法測(cè)定了13種 PAHs、10種 PCDDs、4種PCDFs以及DBDPE和五溴苯等共計(jì)29種化合物的Kow值，希望能夠?yàn)榈湫蚉OPs的相關(guān)研究提供準(zhǔn)確可靠的物理化學(xué)參數(shù)。

1 理論部分

1.1 R P-HPLC法測(cè)定logKow值的基本思路

對(duì)于不解離化合物，它的logKow與其在RPHPLC體系中100%水相條件下的保留因子logkw線性相關(guān)［18］如下:

其中，m和n為擬合系數(shù)。此方程稱為Collander方程，是RP-HPLC法測(cè)定化合物疏水常數(shù)Kow的基礎(chǔ)。

由于100%水相對(duì)色譜柱要求較高，且其對(duì)疏水性物質(zhì)的洗脫能力較弱，使得這些化合物在色譜柱上的保留時(shí)間tR太長，所以在實(shí)際研究中，logkw一般很少從實(shí)驗(yàn)獲得，而是通過外推得到，依據(jù)如下。

液相色譜二元流動(dòng)相組成與保留值之間關(guān)系的通式為［19］:

其中，k為色譜保留因子，φ為流動(dòng)相中有機(jī)調(diào)節(jié)劑的比例，a、b、c為常數(shù)。

在RP-HPLC中，clnφ可以忽略，從而得到Snyder-Soczewinski方程［20］:

方程(1-3)中，參數(shù)a反映了RP-HPLC中溶質(zhì)與固定相的疏水作用，當(dāng)φ=0時(shí)，有a=logk，logk代表了溶質(zhì)在固定相上的疏水性;參數(shù)b反映了溶質(zhì)在流動(dòng)相中的作用能，還被稱為作用指數(shù)，用于表征流動(dòng)相中的洗脫劑強(qiáng)度，對(duì)于特定的溶質(zhì)-洗脫劑而言是一個(gè)常數(shù)。

1.2 保留時(shí)間雙點(diǎn)校正法的引入

針對(duì)經(jīng)典RP-HPLC在測(cè)定高疏水性化合物Kow時(shí)面臨的保留時(shí)間準(zhǔn)確性這一瓶頸問題，本研究小組在前人工作的基礎(chǔ)上提出了一種新的保留時(shí)間校正方法，即保留時(shí)間雙點(diǎn)校正法(DP-RTC)，通過將實(shí)驗(yàn)中某一天(通常為新色譜柱使用的第一天)所使用的色譜柱作為“標(biāo)準(zhǔn)柱”，將以后每天實(shí)驗(yàn)得到的tR均校正為相應(yīng)的在“標(biāo)準(zhǔn)柱”上得到的保留時(shí)間，校正過的保留時(shí)間反映了化合物在色譜體系中真實(shí)的保留行為。采用這種校正方法及RPHPLC，我們準(zhǔn)確測(cè)定了5種迄今尚無SFM/SSM 數(shù)據(jù)的滴滴涕(雙對(duì)氯苯基三氯乙烷，dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)類化合物的 logKow值［21］。本文中，我們進(jìn)一步利用RP-HPLC結(jié)合DP-RTC的方法測(cè)定了前述29種化合物的logKow值。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 藥品與試劑

甲醇(HPLC級(jí))購自Honeywell公司(Honeywell Burdick＆Jackson，Muskegon，MI，USA);水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán))。本實(shí)驗(yàn)所用的樣品、能得到的樣品的SFM/SSM Kow數(shù)據(jù)及相應(yīng)的正辛醇-水分配系數(shù)軟件計(jì)算值(ClogP)見表1，這些樣品分別購自阿拉丁試劑(上海)、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)、AccuStandard(New Haven，USA)、Alfa Aesar(Ward Hill，USA)、Dr.Ehrenstorfer(Augsburg，Germany)以及 TCI(Tokyo，Japan)，所有物質(zhì)的純度均大于98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。實(shí)驗(yàn)中，將這些物質(zhì)分為3組:模型化合物組(Training set)、驗(yàn)證化合物組(Validation set)以及待測(cè)化合物組(Determination set)。用甲醇配制各樣品的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中待用。

2.2 儀器與設(shè)備

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配有真空脫氣機(jī)、數(shù)碼四元泵、120位自動(dòng)進(jìn)樣器及996紫外-可見二極管陣列(PDA)檢測(cè)器(Waters，Milford，MA，USA)。

2.3 色譜條件

Venusil XBP(L)C8色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，15 nm)(天津博納艾杰爾科技有限公司)，柱溫恒定在30℃。流動(dòng)相為甲醇-水，流速為0.2 mL/min。實(shí)驗(yàn)中各樣品的進(jìn)樣濃度均為50 mg/L，進(jìn)樣量為2 μL。在每個(gè)化合物的最佳吸收波長處檢測(cè)。數(shù)據(jù)的采集和處理均在Waters Empower色譜管理系統(tǒng)中進(jìn)行。所有樣品的tR均為至少3次獨(dú)立進(jìn)樣的平均值。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

所有樣品均使用甲醇-水二元流動(dòng)相體系進(jìn)行等度洗脫，根據(jù)樣品疏水性的差異，每個(gè)樣品至少選擇4個(gè)不同的甲醇比例(0.9～0.5，每間隔0.05取一個(gè)比例)，分別得到相應(yīng)的tR。以聯(lián)苯和六甲基苯作為“錨點(diǎn)化合物”，所有tR通過DP-RTC法校正至相當(dāng)于在“標(biāo)準(zhǔn)柱”上得到的保留時(shí)間。保留因子k計(jì)算公式為:k=(tR-t0)/t0，其中t0是死時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)的t0由溶解在甲醇中的NaNO3在“標(biāo)準(zhǔn)柱”上測(cè)得。DP-RTC法的描述詳見文獻(xiàn)［21］。通過Snyder-Soczewinski方程(1-3)得到每一個(gè)溶質(zhì)外推至100%水相中的保留因子的對(duì)數(shù)值logkw(見表1)。根據(jù)Collander方程(1-1)，這些中性化合物的logkw與它們通過SFM/SSM得到的準(zhǔn)確可靠的logKow值之間有著良好的線性關(guān)系。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，由37種模型化合物得到的logKow-logkw的定量結(jié)構(gòu)-色譜保留關(guān)系(QSRR)模型就可用來確定待測(cè)化合物的疏水常數(shù)Kow。此線性模型的可靠性通過正交檢驗(yàn)(cross-validation)中的留一法(leaveone-out，LOO)進(jìn)行驗(yàn)證。為了評(píng)價(jià)QSRR模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力，我們又對(duì)該模型進(jìn)行了外部驗(yàn)證(external validation)。外部驗(yàn)證選取4種驗(yàn)證化合物(聯(lián)苯、芴、PCDD 1和PCDF 114)，分別比較了它們由本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得的和文獻(xiàn)報(bào)道中SFM/SSM測(cè)定的logKow數(shù)據(jù)之間的一致性。

對(duì)擬合模型的統(tǒng)計(jì)分析由SPSS V16.0.0(SPSS，Chicago，Illinois，USA)和 MATLAB software V7.10.0(R2010.a)(the MathWorks，Natick，MA，USA)完成。

表1 實(shí)驗(yàn)中選用的化合物的logKow、ClogP和logkw值Table 1 logKow，ClogP and logkwof investigated compounds

3 結(jié)果與討論

3.1 logKow-logkw模型的建立及驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)由含有37種化合物的模型化合物組擬合，得到logKow與logkw之間的QSRR線性模型，其方程如下:

其中，相關(guān)系數(shù)(R2)=0.985，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù))=0.983，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)=0.16，F(xiàn)=2 290.56(見圖1)。由LOO正交檢驗(yàn)和圖1可知，logKow-logkw模型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果相關(guān)度非常高，此線性擬合的內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果令人滿意。再以4個(gè)結(jié)構(gòu)類似的化合物作為模型的外部驗(yàn)證化合物，其外部驗(yàn)證結(jié)果也令人滿意。

圖1 37種模型化合物的logKow-logkw線性模型Fig.1 Linear correlation between logKowand logkwof 37 model compounds

通過對(duì)比本文DP-RTC-RP-HPLC法測(cè)得的logKow值與SFM/SSM 法測(cè)定的logKow值，發(fā)現(xiàn)二者之間的偏差很小(≤0.1 log unit)(見表2)，此結(jié)果表明，在對(duì)本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo) POPs(PAHs、PCDD/Fs、DBDPE)的 logKow值測(cè)定中，DP-RTC-RP-HPLC法與經(jīng)典的SFM/SSM法的準(zhǔn)確性相當(dāng)。

表2 對(duì)logKow-logkw線性模型的外部驗(yàn)證Table 2 External validation for logKow-logkwlinear model

3.2 PAHs、PCDD/Fs、DBDPE 等 化 合 物 的logKow的測(cè)定

如前所述，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到了logKow-logkw的QSRR模型，并且驗(yàn)證了此模型適合于預(yù)測(cè)PAHs、PCDD/Fs及DBDPE等POPs的logKow值。因此利用此線性模型測(cè)定了表1中列出的待測(cè)POPs化合物的logKow值，并將測(cè)定結(jié)果與ClogP值進(jìn)行比較(見表3)。由表1和表3可見:對(duì)于高疏水性化合物(logKow＞5)，ClogP值普遍小于相應(yīng)的 SFM/SSM或RP-HPLC法測(cè)量的實(shí)驗(yàn)值;而對(duì)疏水性稍低的化合物(logKow＜5)，其ClogP值卻又略大于其相應(yīng)實(shí)驗(yàn)值。同時(shí)，從表3中，我們可以看到，對(duì)不含氯或溴原子的PAHs類化合物來說，其ClogP值與我們RP-HPLC法測(cè)得的實(shí)驗(yàn)值比較接近，但是對(duì)于coronene和truxene來說，因二者結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，其軟件計(jì)算值顯示出較大的偏差;而對(duì)于含氯或溴的POPs，如PCDD/Fs類的化合物，其軟件計(jì)算值本身就有較大的誤差(＞±0.6)，且含氯或溴原子越多，其與實(shí)驗(yàn)值的偏差越大。軟件計(jì)算法和RPHPLC法得到的logKow數(shù)據(jù)的不一致，反映了多種復(fù)雜因素對(duì)軟件計(jì)算法具有共同影響，因此，使用商業(yè)軟件法計(jì)算得到高疏水性化合物的logKow值時(shí)需十分謹(jǐn)慎。

3.3 POPs同系化合物Kow值測(cè)定的新策略

在環(huán)境化學(xué)研究中，許多POPs的同系物種類非常繁多，這使得采用SFM/SMM實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定它們的Kow值時(shí)間冗長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而在經(jīng)典的RPHPLC法中，對(duì)于每一個(gè)待測(cè)同系物，為了獲得準(zhǔn)確的外推logkw值，需要在等度洗脫條件下測(cè)定至少4個(gè)不同的有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例φ下的logk，以保證Snyder-Soczewinski線性方程擬合的可靠性。但由于大多數(shù)POPs的疏水性很強(qiáng)，使得在水相比例較高的流動(dòng)相條件下，這些物質(zhì)很難被洗脫，在這種情況下想要得到它們的tR值是相當(dāng)困難甚至是不可能的，而通過完全在高有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例下的保留因子外推得到的kw因不能覆蓋全流動(dòng)相比例范圍，準(zhǔn)確性較差，這個(gè)矛盾在經(jīng)典RP-HPLC法中難以調(diào)和。本研究小組曾提出了一種新的基于實(shí)驗(yàn)的計(jì)算logkw的方法，此方法通過建立同系物logkw與logk之間簡單的線性關(guān)系，只需要測(cè)定化合物在某一個(gè)φ下的一個(gè)k值即可得到該物質(zhì)的logkw，從而大大簡化了RP-HPLC法測(cè)定同系化合物Kow的過程［40］。基于logkw與logk之間的這種線性關(guān)系，我們用RPHPLC法測(cè)定了無SFM/SSM數(shù)據(jù)報(bào)道的7種多氯聯(lián)苯(PCB)、6種多溴聯(lián)苯(PBB)和8種多溴聯(lián)苯醚(PBDE)的logKow值。以PCB為例，分別采用C8和C18的色譜固定相，測(cè)得的logKow數(shù)據(jù)具有很好的一致性。由于本篇工作中化合物種類較多，涉及PAHs、PCDDs、PCDFs和 DBDPE 4 類結(jié)構(gòu)不同的POPs，故沒有引入該方法。

表3 29種化合物的logKow的測(cè)定Table 3 Determination of logKowfor the 29 compounds

3.4 極性污染物Kow值的測(cè)定思路

本工作所建立的方法和模型針對(duì)疏水性較大的中性化合物，對(duì)于中性的污染物適用。但污染物分子種類很多，除中性分子外還有很多會(huì)發(fā)生解離的極性化合物，如抗生素分子，在用RP-HPLC法研究易解離化合物的Kow值時(shí)，需要采用修正的模型，即用表觀正辛醇-水分配系數(shù)(Kow″)來替代Kow。本研究小組在這方面也曾做過系統(tǒng)的研究，專門針對(duì)酸性［41－45］、堿性［46，47］以及兩性化合物［48］等極性分子的Kow測(cè)定及保留行為進(jìn)行研究。在近期的工作中，我們還利用中性化合物為模型化合物測(cè)定了弱解離酸性藥物馬兜鈴酸的Kow值［44］，對(duì)極性污染物的Kow值的測(cè)定具有借鑒價(jià)值。

4 結(jié)論

本文采取對(duì)保留時(shí)間準(zhǔn)確定量的DP-RTCRP-HPLC方法，選擇了37種模型化合物，擬合得到了可靠的logKow-logkwQSRR模型，并利用此模型測(cè)定了29種POPs類化合物的logKow值，這些POPs的logKow實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚未見報(bào)道。雖然RP-HPLC是目前經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)推薦的測(cè)定化合物疏水常數(shù)的一種可靠性較高、普遍使用的方法，但是其在測(cè)定POPs疏水常數(shù)時(shí)，依然存在著在整個(gè)測(cè)定過程中主要由固定相老化引起的化合物tR偏移的問題，即使在完全相同的色譜洗脫條件下，這種偏移也無法避免。對(duì)于依賴準(zhǔn)確tR值構(gòu)建模型的RP-HPLC法來說，這種偏移毫無疑問會(huì)導(dǎo)致化合物Kow值測(cè)定不準(zhǔn)，我們推薦在實(shí)驗(yàn)中采用DPRTC法來校正tR，且在測(cè)定較高疏水性化合物時(shí)，選用疏水性較低的C8短柱在水相比例較高的流動(dòng)相條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以此增加Snyder-Soczewinski方程外推得到logkw的準(zhǔn)確性，從而得到更加準(zhǔn)確可靠的logKow數(shù)據(jù)。

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