食品中檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀的毛細管區(qū)帶電泳分析

張一丁，常翠蘭，郭啟雷，曹 紅，白 玉*，劉虎威

（1.北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院分析化學(xué)研究所，北京 100871；2.北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，北京 100094）

食品安全是人們?nèi)粘Ｉ钪行枰鎸Φ闹匾獑栴}，食品添加劑或非食用物質(zhì)的違規(guī)、超量使用是許多食品安全問題的原因。因此，分析化學(xué)能夠提供的對于食品添加劑或非食用物質(zhì)的定性定量檢測是保障食品安全的重要基礎(chǔ)。

食用色素是為了改善食品色澤而在食品和部分藥品加工過程中添加的物質(zhì)［1］。通常的色素為水溶性物質(zhì)。為了適應(yīng)非水體系或疏水體系(如糖衣、肉腸、糕點等)對著色的要求，水溶性色素被制成色淀使用，即將可溶性色素吸附、沉降在不溶性基質(zhì)上形成的色淀染料?？捎玫幕|(zhì)有氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鋇等，相應(yīng)地稱為鋁色淀、鈣色淀、鋇色淀等，其中鋁色淀應(yīng)用最為廣泛。合成色素多以芳香烴等經(jīng)過磺化、硝化、偶氮化等一系列有機反應(yīng)而成，往往含有偶氮、芳環(huán)、氧雜蒽結(jié)構(gòu)等［2］，因此多具有一定毒性。有研究指出，長期食用含有色素或色淀的食物存在引起過敏、哮喘、DNA損傷、致畸、致癌等后果的風(fēng)險［3］，故色素、色淀的使用范圍和用量受到嚴格限制。我國許多標準對此有嚴格要求［4］。例如對于檸檬黃及其鋁色淀的限量為0.04 g/kg(蛋卷)～0.5 g/kg(果醬等)，對日落黃及其鋁色淀的限量為0.02 g/kg(谷類甜品等)～0.6 g/kg(固體飲料)(限量均指色素的質(zhì)量)。

一般認為，色淀中的色素與基質(zhì)通過配位作用或離子鍵等結(jié)合，色淀沒有確定的化學(xué)組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)式，并且色淀化過程不破壞色素本身的分子結(jié)構(gòu)。在色淀質(zhì)量和限量標準中針對其色素含量有嚴格的要求［5-8］，且法規(guī)中對于色淀的使用限量規(guī)定均是指換算后的色素質(zhì)量，因此色淀的分析方法必須能夠測定所添加的色淀中色素的含量，而非色淀總含量。

針對水溶性色素的分析方法較為容易，高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳(CE)方法均有報道，且已形成國家標準［9-12］。但是針對色淀的分析方法卻鮮有報道，更無國家標準方法。究其原因，鋁色淀的分析必須使其中的色素與鋁基質(zhì)分離。在針對鋁色淀進行分析的為數(shù)不多的文獻中，有3種分離色素和鋁基質(zhì)的方法。(1)采用酸性溶液溶解色淀，然后調(diào)整pH使鋁離子沉淀并離心除去，得到色素溶液［13］；(2)用堿性溶液直接提取色淀中的色素［3］；(3)將色淀溶解后用聚酰胺粉吸附色素［10］，再洗脫進行分析。分析主要采用HPLC方法，但有不足之處。例如沉淀除去鋁離子的不完全性、沉淀過程中色素的損失、堿性溶液提取過程導(dǎo)致鋁基質(zhì)的部分溶解帶來的干擾等，并且HPLC也具有其自身的不足，比如分析成本高、色譜柱壽命有限等。本文從鋁色淀的性質(zhì)出發(fā)，探索將其處理成適合CE進樣的樣品前處理方法，然后采用毛細管區(qū)帶電泳(CZE)進行分析。我們希望能夠利用CE高效率、高速度、低消耗等特點彌補HPLC方法的不足，成為色淀分析的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 7100高效毛細管電泳儀，配備二極管陣列檢測器(DAD)(Agilent Technologies，美國)；熔融石英毛細管(內(nèi)徑50 μm，總長度48.50 cm，有效長度40.00 cm，邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司)。檸檬黃鋁色淀、日落黃鋁色淀(食品用，色素含量30.4%(質(zhì)量分數(shù))，上海嘉匯精細化工有限公司)；聚酰胺粉(聚己內(nèi)酰胺，100～200目，常州長豐化工有限公司)；樣品濾膜(0.22 μm，混合纖維素(MCM)和聚四氟乙烯(PTFE)材質(zhì)，天津博納艾杰爾科技有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；十水合四硼酸鈉(北京益利精細化學(xué)品有限公司)；氫氧化鈉(分析純，西隴化工股份有限公司)；硫酸(優(yōu)級純，北京化工廠)；乙腈(色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；乙酸、磷酸鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na)、乙酸銨、乙酸鈉、乙醇、甲醇、丙酮均為分析純(北京化工廠)；實驗用水為娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。實際樣品為綠箭無糖薄荷糖(茉莉花茶味)(箭牌糖果(中國)有限公司)。

1.2 樣品前處理

稱取檸檬黃鋁色淀、日落黃鋁色淀固體，分別置于容量瓶中用0.10 mol/L H2SO4溶解，使色淀的質(zhì)量濃度分別為0.493 g/L和0.503 g/L；以色淀中色素含量為30.4%(質(zhì)量分數(shù))計，檸檬黃和日落黃色素的質(zhì)量濃度分別為0.150 g/L和0.153 g/L。將此濃度的色淀溶液以0.10 mol/L H2SO4稀釋，使基濃度為原濃度的 8.00×10-1、6.00×10-1、4.00×10-1、2.00 × 10-1、1.00 × 10-1、8.00 × 10-2、6.00 ×10-2、4.00 × 10-2、2.00 × 10-2、1.00 × 10-2、8.00 ×10-3、6.00 ×10-3、4.00 ×10-3、2.00 ×10-3倍，并在每個濃度的溶液中添加無水乙酸鈉固體使乙酸鈉的濃度為0.100 mol/L。用1.0 mol/L NaOH溶液將上述各濃度溶液的pH調(diào)至4.98～5.02。取調(diào)整pH后的各濃度色淀溶液，分別與等體積的0.160 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液混合后，于60℃水浴中加熱60 min。

在1 mL注射器管中填入聚酰胺粉，每支注射器中填入0.120 g，壓緊粉末使之填至0.3 mL刻度處，制成固相萃取小柱。依次用H2O、0.1 mol/L H2SO4、H2O通過小柱，然后移取1.00 mL前述水浴處理后的色淀溶液通過小柱。再依次用H2O、0.1 mol/L H2SO4、H2O通過小柱進行沖洗。減壓盡量除去沖洗所用溶液，然后用0.1 mol/L NaOH溶液對色素進行洗脫。將NaOH溶液緩慢通過小柱，棄去前150 μL流出液，收集第150至450 μL流出液(共300 μL)，以0.22 μm PTFE 濾膜過濾后作為樣品進行CZE分析。對各個濃度的色淀溶液均如此處理；聚酰胺粉小柱、PTFE濾膜均為一次性使用。

對實際樣品進行前處理時需依據(jù)樣品性質(zhì)開發(fā)不同的處理方法。對可溶性樣品(如糖果等)可按上述方法直接溶解處理；對不溶性樣品(如糕點等)則需增加研磨、除去蛋白質(zhì)等步驟，此處不予詳述。

1.3 CZE 條件

檸檬黃鋁色淀的分析條件:運行溫度為20.0℃；壓力進樣5 kPa(50 mbar)×10.0 s；緩沖液為混合磷酸鹽溶液(磷酸鈉和磷酸氫二鈉)，總磷酸鹽濃度為0.015 mol/L，pH 11.45；分離電壓為29.0 kV；檢測波長為263 nm。

日落黃鋁色淀的分析條件:運行溫度為20.0℃；壓力進樣5 kPa(50 mbar)×10.0 s；緩沖液為混合磷酸鹽溶液(磷酸鈉和磷酸氫二鈉)，總磷酸鹽濃度為0.025 mol/L，pH 11.45；分離電壓為25.0 kV；檢測波長為240 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 定量分析方法學(xué)

針對檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀的CZE分析方法學(xué)評價數(shù)據(jù)見表1。

表1 檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀的CZE方法學(xué)評價數(shù)據(jù)*Table 1 Method validation of the proposed CZE method for tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake*

在優(yōu)化的實驗條件下，檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀的CZE譜圖見圖1。

圖1 (a)檸檬黃鋁色淀和(b)日落黃鋁色淀的CZE譜圖Fig.1 Electropherograms of(a)tartrazine aluminum lake and(b)sunset yellow aluminum lake by CZE

2.2 前處理條件的選擇和優(yōu)化

1.2節(jié)的樣品前處理條件是優(yōu)化后的結(jié)果，主要包括鋁色淀的酸溶解、用EDTA·2Na處理、過聚酰胺粉小柱3個步驟。我們還嘗試過其他前處理方法，如(1)直接將鋁色淀溶解進樣；(2)將鋁色淀溶解后過聚酰胺粉小柱；(3)將鋁色淀溶解后用EDTA·2Na處理等。實驗結(jié)果證明這些前處理方法的電泳結(jié)果均不好。鋁色淀溶解后直接測試所得典型電泳結(jié)果見圖2。分析其原因認為，雖然色淀樣品能夠被強酸或強堿性體系溶解，但其鋁基質(zhì)溶解后的存在形式很可能為膠體形式(氫氧化鋁膠體)。此外，即使溶解后的樣品為溶液，在毛細管內(nèi)進行電泳時由于運行緩沖液的pH不如溶解樣品時溶劑的pH那么極端，樣品在毛細管內(nèi)可能進一步膠體化。此推斷后被證實:用激光照射色淀溶液時明顯可見光路。由于膠體粒子并無固定的分子質(zhì)量和電荷，從而在CZE分離時在較長的時間里都有攜帶了色素分子的膠體粒子通過毛細管的檢測窗口，使得峰寬且響應(yīng)低。過聚酰胺粉小柱亦無法完全分離膠體粒子和色素分子，故無法獲得較好的電泳結(jié)果。

圖2 檸檬黃鋁色淀溶解后直接測定的電泳圖Fig.2 Electropherogram of tartrazine aluminum lake injected directly after dissolving

配位試劑被應(yīng)用到前處理過程中以更好地分離色素與鋁基質(zhì)。改進后，鋁色淀樣品先被強酸溶液溶解，然后調(diào)整pH至5以適合EDTA與鋁離子的配位反應(yīng)，再與過量的EDTA·2Na溶液混合加熱以使配位反應(yīng)完成。此時的溶液為色素與鋁配合物的混合液，經(jīng)過聚酰胺粉小柱后色素被吸附于柱上(在酸性環(huán)境下)，沖洗后再以堿性溶液洗脫，即可獲得較純的色素溶液，可用于CZE分析。經(jīng)過對配位反應(yīng)方式、溫度、時間、EDTA用量、聚酰胺粉用量、吸附、洗滌方式等的條件優(yōu)化后，最終確定了本文1.2節(jié)的前處理條件。

2.3 CZE條件的選擇和優(yōu)化

采用CZE方法時需優(yōu)化的條件一般為緩沖液種類、pH、緩沖液濃度、有機添加劑、運行溫度、分離電壓、進樣量等。本實驗中，首先嘗試了系列不同種類和pH的緩沖液，包括乙酸-乙酸鈉體系(pH 5.01)、硼砂(pH 9.17)、磷酸鹽體系(pH 6.85、7.54、8.28、9.24、10.72、11.45、12.49)、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸體系(pH 8.42)等，根據(jù)樣品的分離情況，以及色譜峰峰高和峰形情況，最終確定采用pH 11.45的磷酸鹽緩沖體系。

采用正交試驗優(yōu)化了緩沖液濃度、運行溫度、分離電壓和有機添加劑(乙腈)的使用。由于多數(shù)物質(zhì)在200 nm處均有響應(yīng)，為了更好地體現(xiàn)體系中雜質(zhì)和其他參數(shù)不穩(wěn)定造成的影響，正交實驗中在該波長下進行測定。表2和表3為L9(34)正交試驗結(jié)果。

表2 檸檬黃鋁色淀CZE條件的正交試驗結(jié)果Table 2 R esults of orthogonal experiments for the CZE conditions of tartrazine aluminum lake

表3 針對日落黃鋁色淀的正交試驗結(jié)果Table 3 R esults of orthogonal experiments for sunset yellow aluminum lake

表2和表3中最右一列(峰高)為檢測波長為200 nm時的樣品峰高度。此處選擇峰高而非峰面積是因為峰高可以更好地反映峰形的優(yōu)劣。表的最下端3行(T1～T3)為對應(yīng)因素在3個測試水平下的峰高之和，用于反映該因素在何水平下效果最好。根據(jù)實驗結(jié)果顯示的趨勢，并且考慮到實驗經(jīng)驗和儀器參數(shù)的可控范圍，最終確定了1.3節(jié)的檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀測定的電泳條件。

2.4 實際樣品的測定

采用建立的方法分析了實際樣品綠箭無糖薄荷糖(配料中含檸檬黃鋁色淀)。將其研磨成粉末狀后取3份，1份用于樣品中含有的檸檬黃鋁色淀的檢測，測得檸檬黃鋁色淀含量為0.002 g/L；另2份分別添加一定量的檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀標準品后進行加標回收率的測定，結(jié)果如表4所示。圖3為一個實際樣品的電泳譜圖。

表4 實際樣品中檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀的檢測和加標回收率結(jié)果Table 4 R esults of real samples and spiked recoveries of tartrazine aluminum lake and sunset yellow aluminum lake

圖3 實際樣品(含檸檬黃鋁色淀)的電泳譜圖Fig.3 Electropherogram of a real sample containing tartrazine aluminum lake

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種新的CZE分析檸檬黃鋁色淀和日落黃鋁色淀的方法。前處理方法采用EDTA處理酸溶解后的鋁色淀使其中的鋁基質(zhì)形成配合物，使用聚酰胺粉凈化。本方法較好地使色素與鋁基質(zhì)得到分離，使其后續(xù)可采用多種儀器分析手段。實驗結(jié)果可見將CZE用于色淀的分析達到了與HPLC相當?shù)撵`敏度，并且具有足夠的線性范圍。盡管如此，本方法的前處理步驟仍然較為復(fù)雜，且需要針對不同性質(zhì)的實際樣品開發(fā)不同的前處理方法。但本方法仍為色淀的CE分析提供了可能性，且有良好的應(yīng)用前景。

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