基于冷凍熔煉的液-液萃取/氣相色譜法測(cè)定啤酒中的N-二甲基亞硝胺

彭俏容， 唐 濤， 于淑新， 孫元社，雷 武， 王風(fēng)云， 張維冰， 李 彤*

(1.南京理工大學(xué)，江蘇南京210094;2.大連依利特分析儀器有限公司，遼寧大連116023;3.華東理工大學(xué)，上海200237)

亞硝胺類(lèi)化合物具有強(qiáng)致癌性，迄今已發(fā)現(xiàn)的亞硝胺有300多種。目前在橡膠制品［1］、乳膠兒童用品［2］、腌制水產(chǎn)品［3］、肉制品及啤酒中已檢測(cè)到不同種類(lèi)和濃度的亞硝胺物質(zhì);其中N-二甲基亞硝胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)是極具代表性的物質(zhì)之一［4，5］。啤酒在釀造過(guò)程中生成的微量亞硝胺主要包括二甲基亞硝胺和吡咯烷亞硝胺［6］。對(duì)于啤酒中 NDMA的檢測(cè)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 5009.26-2003［7］采用常規(guī)液-液萃取法。該方法作為一種傳統(tǒng)的前處理技術(shù)，能較好地完成目標(biāo)組分的分離［8］，但通常需要多次萃取才能保證回收率，并需要進(jìn)一步的轉(zhuǎn)移、濃縮，操作較為繁瑣。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，超高壓萃?。?］、超臨界流體萃?。?0］、加速溶劑萃?。?1］等新型萃取技術(shù)得到了較快的發(fā)展。該類(lèi)技術(shù)具有萃取時(shí)間短、效率高、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，但由于裝置專(zhuān)用性及價(jià)格因素的影響，在應(yīng)用上受到限制［12］。

冷凍熔煉液-液萃取是液-液萃取與區(qū)域熔煉技術(shù)的結(jié)合，是一種簡(jiǎn)單、高效的高壓萃取技術(shù)［13］，目前在食品和環(huán)境中農(nóng)藥殘留［14－16］、藥物殘留的分析中常用來(lái)除去雜質(zhì)、富集低濃度水平的目標(biāo)化合物。利用目標(biāo)化合物和脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在熔點(diǎn)上的差別，低溫下這些干擾物會(huì)在水相中凝結(jié)成冰，目標(biāo)化合物則在有機(jī)相中富集，從而可以得到比較干凈的樣品［17］。Goulart等［18］使用低溫分配液-液萃取技術(shù)對(duì)水體中3種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)行提取，僅消耗4 mL有機(jī)溶劑，回收率在90%～96%之間。Rübensam 等［19］利用液-液萃取/冷凍純化前處理方式對(duì)牛奶中5種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素進(jìn)行提取，與普通的液-液萃取方法相比，減少了有機(jī)溶劑中的共萃取物。

本文基于上述冷凍熔煉液-液萃取的原理，采用高壓熔煉萃取釜，建立了一種對(duì)啤酒中NDMA進(jìn)行直接萃取、GC-FID分析的測(cè)定方法;優(yōu)化了前處理?xiàng)l件，完成了方法驗(yàn)證。本文為該種新型前處理技術(shù)的推廣提供了技術(shù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

GC7890Ⅱ氣相色譜儀，配氫火焰離子化檢測(cè)器(上海天美科學(xué)儀器有限公司);高壓熔煉萃取釜(杭州普普科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);氮吹儀(河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司)。

N-二甲基亞硝胺(純度100%，美國(guó) AccuStandard公司);二氯甲烷、無(wú)水乙醇、氯化鈉(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);啤酒(市售)。實(shí)驗(yàn)所用水均為Milli-Q超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用無(wú)水乙醇溶解適量的N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取適量體積的儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇稀釋配成 5.0、10、50、100、150、200 mg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。于避光、4℃下冷藏保存。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 冷凍熔煉液-液萃取法

分別量取90 mL啤酒樣品(預(yù)先脫氣處理)和10 mL二氯甲烷置于250 mL具塞三角瓶中，加9 g氯化鈉，超聲10 min。將混合液加入到高壓熔煉萃取釜中，用二氯甲烷填充以排盡空氣，密封。將萃取釜放入－19℃的冷凍室冷凍16 h后取出;取有機(jī)相，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液供分析。

1.3.2 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 5009.26-2003)

取50 mL啤酒于真空低溫下蒸餾，收集的蒸餾液用60 mL二氯甲烷分3次液-液萃取。合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，氮吹定容至1 mL后供分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:TM-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm×0.5 μm);TM-1毛細(xì)管柱(30 m ×0.53 mm ×0.5 μm);升溫程序:初始溫度為50℃，保持4 min，以5℃/min升至220℃，保持10 min。載氣:高純(純度99.999%)氮?dú)?流速:8 mL/min;進(jìn)樣口溫度:220℃;檢測(cè)器溫度:250℃;進(jìn)樣量:6 μL，不分流進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 冷凍熔煉液-液萃取條件的選擇和優(yōu)化

冷凍熔煉液-液萃取是在液-液萃取基礎(chǔ)上，利用密封體系內(nèi)水凝結(jié)成冰產(chǎn)生的壓力來(lái)提高萃取效率。其目標(biāo)化合物的富集效率不僅與樣品的基質(zhì)有關(guān)，而且還受其他多種因素的影響。以加入20 mg/L NDMA標(biāo)準(zhǔn)品的啤酒樣品為研究對(duì)象，探討了兩相比(樣品與萃取溶劑的體積比)和冷凍時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確定適合啤酒中NDMA提取的最佳冷凍熔煉液-液萃取條件。

2.1.1 兩相比的選擇

以二氯甲烷為萃取溶劑，分別考察兩相比為1∶3、1∶1、3∶1、4∶1、9∶1 時(shí)的萃取效果，利用計(jì)算得到的回收率來(lái)度量萃取效果。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 樣品與萃取溶劑的體積比對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Effect of volume ratio of sample and solvent on the extraction yield

由圖1可知，隨著萃取釜內(nèi)樣品體積比例的增大，目標(biāo)化合物的回收率增加。由于水凝固成冰體積會(huì)膨脹增大，使得容器中的壓力增加，從而提高NDMA在有機(jī)溶劑中的溶解度;同時(shí)根據(jù)區(qū)域熔煉的原理，在水凝固成冰的過(guò)程中，水中的NDMA也可進(jìn)一步溶解在有機(jī)溶劑中。從圖1的曲線(xiàn)趨勢(shì)來(lái)看，兩相比繼續(xù)增加，回收率增大。但兩相比大于9∶1時(shí)，一方面會(huì)導(dǎo)致后續(xù)取樣操作不便，另一方面由于水相比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于有機(jī)相，會(huì)使兩相的分離更加困難，會(huì)導(dǎo)致部分有機(jī)相溶于水相中，使回收的有機(jī)相體積減小，導(dǎo)致回收率降低。因此選擇9∶1作為兩相比。

2.1.2 冷凍時(shí)間

以二氯甲烷為萃取溶劑，在兩相比為9∶1的條件下，分別考察冷凍時(shí)間為 8、12、14、16、18、20 h 的萃取效果。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 冷凍時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of freezing time on the extraction yield

冷凍時(shí)間主要關(guān)系到水結(jié)成冰的體積分?jǐn)?shù)。隨著水結(jié)成冰的體積分?jǐn)?shù)的增加，密封體系內(nèi)壓力增大，促進(jìn)目標(biāo)化合物向有機(jī)相轉(zhuǎn)移，從而提高萃取效率。由圖2可知，當(dāng)冷凍時(shí)間小于12 h時(shí)，回收率僅為50%左右;當(dāng)冷凍時(shí)間大于14 h，回收率在80%～90%之間，冷凍時(shí)間高于16 h后回收率變化很小。因此選擇16 h作為冷凍時(shí)間。

另外，可以通過(guò)改變冷凍速率來(lái)調(diào)節(jié)冷凍時(shí)間。增大冷凍速率，可以減少冷凍時(shí)間;但過(guò)快的冷凍速率可能導(dǎo)致回收率降低。因此該因素應(yīng)該通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行選擇。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線(xiàn)性范圍和檢出限

對(duì)于亞硝胺類(lèi)化合物的分析，以FID為檢測(cè)器時(shí)，僅以目標(biāo)化合物在一種極性色譜柱上的保留值來(lái)判斷該化合物的存在，可靠性不高。通常采用雙柱定性法來(lái)提高定性能力。不同的物質(zhì)在同一根色譜柱上可能會(huì)有相同的保留時(shí)間，但在兩根不同極性的色譜柱上一般不可能有相同的保留時(shí)間。雙柱定性就是利用這個(gè)原理來(lái)排除假陽(yáng)性。分別用不同的毛細(xì)管柱獲取兩組對(duì)照數(shù)據(jù)，在原有TM-WAX(極性)毛細(xì)管柱基礎(chǔ)上，結(jié)合TM-1(非極性)毛細(xì)管柱的保留時(shí)間結(jié)果來(lái)定性。

采用外標(biāo)法定量，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。線(xiàn)性方程為Y=1.176X－1.044，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.999 6，說(shuō)明NDMA在5～200 mg/L(測(cè)試濃度)范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

按3倍信噪比計(jì)算儀器的檢出限(LOD)為0.51 mg/L;在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品，以10倍信噪比計(jì)算方法的定量限(LOQ)為1.26 mg/kg。

2.2.2 回收率和精密度

在空白啤酒樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定。加標(biāo)水平分別為20、10、5 mg/L，采用1.3.1節(jié)所述的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定7次。由表1可知，NDMA的加標(biāo)回收率可以滿(mǎn)足痕量分析的要求，說(shuō)明所建立的方法可行。

表1 空白啤酒樣品中不同添加水平下NDMA的回收率及R SD(n=7)Table 1 R ecoveries and R SDs of NDMA spiked in a blank beer sample at different levels(n=7)

2.3 方法比較

按照1.3節(jié)所述的2種前處理方法(即冷凍熔煉液-液萃取和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法)對(duì)啤酒樣品進(jìn)行處理，對(duì)比考察實(shí)際樣品的前處理效果。

由表2可知，90 mL啤酒經(jīng)10 mL二氯甲烷一次冷凍熔煉液-液萃取可以達(dá)到60 mL二氯甲烷分3次液-液萃取的效果，且穩(wěn)定性更好。實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，啤酒樣品直接經(jīng)二氯甲烷液-液萃取，兩相界面存在嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，需采取必要的破乳方法才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟。

表2 兩種前處理方法的比較Table 2 Comparison of two pretreatment methods

從樣品整個(gè)前處理過(guò)程來(lái)看，2種前處理方法的差別主要表現(xiàn)在4個(gè)方面。

(1)前處理步驟。冷凍熔煉液-液萃取同時(shí)起到凈化和濃縮的作用，冷凍過(guò)程結(jié)束后可直接取樣進(jìn)行分析。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中，液-液萃取后需要后續(xù)的濃縮步驟來(lái)富集目標(biāo)化合物。由于NDMA易揮發(fā)，無(wú)論是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮或者氮吹濃縮，都容易造成損失。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中采用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溫度為55℃，但在該水浴溫度下回收率偏低，目標(biāo)化合物損失達(dá)60%，可能是由于蒸發(fā)速率過(guò)快所致;實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水浴溫度為30℃和39℃下，氮吹濃縮平均回收率僅為80%左右，損失都達(dá)到了約20%。減少前處理操作步驟，有利于獲得可靠、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(2)溶劑消耗量。液-液萃取需要3次單獨(dú)的萃取過(guò)程，消耗60 mL有機(jī)溶劑。冷凍熔煉液-液萃取僅消耗10 mL萃取溶劑，這不僅降低了分析成本，同時(shí)還減少了操作人員與有害試劑的接觸。

(3)操作時(shí)間。冷凍熔煉液-液萃取需要16 h的冷凍過(guò)程，但此期間冷凍裝置可自動(dòng)控制溫度，操作人員可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行處理，從而使單個(gè)樣品的分析時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于8 h。而常規(guī)的液-液萃取以及后續(xù)的濃縮步驟需對(duì)操作溫度、壓力、氮吹速率嚴(yán)格控制。

(4)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。冷凍熔煉液-液萃取只需使用冷凍熔煉萃取釜，省去了常規(guī)分析中使用的玻璃儀器。

由上述比較可知，相比于常溫液-液萃取，冷凍熔煉液-液萃取是一種簡(jiǎn)單、高效的高壓萃取技術(shù)。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用建立的方法對(duì)啤酒樣品、啤酒加標(biāo)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 冷凍熔煉液-液萃取方法處理后的實(shí)際啤酒樣品及樣品加標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.3 Chromatograms of a beer sample，the beer sample spiked with standard and the standard after the treatment by frozen zone melting liquid-liquid extraction

在市售的4種啤酒樣品中均未檢出NDMA。從圖3可知，啤酒樣品經(jīng)冷凍熔煉液-液萃取法處理后，可以得到較干凈的色譜圖;NDMA的出峰位置附近沒(méi)有雜質(zhì)峰干擾，滿(mǎn)足定性和定量分析要求。采用此種前處理方法，即使樣品基質(zhì)中有大量的干擾物，例如蛋白質(zhì)、氨基酸等，由于它們的凝固點(diǎn)較低，均可在水相中凝固，也能使有機(jī)相中的共萃取物大大減少。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)冷凍熔煉液-液萃取條件的優(yōu)化，建立了一種簡(jiǎn)單、高效的測(cè)定啤酒中NDMA的氣相色譜檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:NDMA的添加回收率為83.24%～85.14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.63%～3.19%。與常溫液-液萃取相比，冷凍熔煉液-液萃取技術(shù)所用裝置簡(jiǎn)單、操作方便，同時(shí)起到凈化和富集的目的，大大減少了有機(jī)溶劑的消耗量。

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