整體柱固相萃取-高效液相色譜法在線分析水果中的氯吡脲

羅偉強(qiáng)， 肖小華， 杜 卓， 李攻科

(1.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州510275;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530006)

氯吡脲(forchlorfenuron，CPPU)又名調(diào)吡脲，化學(xué)名稱為1-(2-氯-4-吡啶基)-3-苯基脲，是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的新型高效植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。由于長(zhǎng)期接觸CPPU會(huì)引起體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的紊亂、肺氣腫和體形消瘦，歐盟、日本、美國(guó)等已對(duì)其殘留量進(jìn)行嚴(yán)格限制，不同作物中CPPU最大殘留限量(MRL)為 10 ～100 μg/kg［1，2］。我國(guó)規(guī)定西瓜和黃瓜中CPPU的MRL為0.1 mg/kg，而獼猴桃和葡萄中為0.05 mg/kg。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)CPPU殘留分析的研究主要包括溶劑萃?。?］、固相萃取［4－7］等有效的樣品前處理方法，以及靈敏的氣(液)相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［8］、液相色譜［9］、放射免疫方法［10］等分析方法。由于蔬果中CPPU殘留含量通常很低，樣品基質(zhì)和待測(cè)組分具有不確定性等因素的影響，其分析檢測(cè)要求具有精細(xì)的操作手段、較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性?，F(xiàn)有的離線樣品處理與色譜分析等方法存在樣品易受污染、損失以及分析靈敏度不高等缺點(diǎn)，難以滿足復(fù)雜基體中痕量CPPU殘留的分析要求。

有機(jī)聚合物整體柱具有單體多元化且易得、易制備、易被修飾、通透性和耐溶劑性能好等優(yōu)點(diǎn)，在整體柱的制備及應(yīng)用中備受青睞，已成功地應(yīng)用在食品、環(huán)境、催化、生物等眾多領(lǐng)域中［11，12］;另外，整體柱也可作為色譜分離柱使用，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基體中痕量分析物的快速檢測(cè)和快速分離［13］。不銹鋼基質(zhì)的硬度高、尺寸均一，可以避免玻璃毛細(xì)管整體柱易折斷的現(xiàn)象，適合作為整體柱管材［14］。目前不銹鋼管整體柱前處理技術(shù)在蔬果樣品CPPU在線分析中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

本文制備了不銹鋼管基材的固相萃取整體柱，結(jié)合HPLC/UV建立了整體柱固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法?？疾炝溯腿∪軇┑膒H值及其流速、溶劑解吸時(shí)間及其流速等因素對(duì)CPPU萃取率的影響，并用于水果中CPPU的在線分析檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料和試劑

1.1.1 儀器

LC-10Avp高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)，Cary100紫外光譜儀(Varian，美國(guó))，紅外光譜儀Thermo Scientific Nicolet 330，Hitachi 4300冷場(chǎng)電子掃描顯微鏡(SEM)(Hitachi，日本)，Diamonsil(TM)鉆石 C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Dikma)，離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，冰箱(－20℃，青島海爾公司)，分析天平(0.1 mg，梅特勒-托利多公司)，渦旋機(jī)(上海精科儀器有限公司)。

1.1.2 材料

黑葡萄、獼猴桃和西瓜等樣品購(gòu)于中山大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。樣品新鮮，表面無(wú)蟲(chóng)害，冷藏保鮮。對(duì)易腐壞的樣品需冷凍保存，測(cè)定時(shí)避免反復(fù)解凍。

1.1.3 試劑

甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、聚乙二醇-6000(PEG-6000)均購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)購(gòu)自廣州千湖貿(mào)易有限公司。甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純;二氯甲烷為分析純。氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%)購(gòu)于北京百靈威公司。水為純凈水(深圳怡寶食品飲料有限公司)。

CPPU標(biāo)準(zhǔn)溶液(200.0 mg/L):稱取20.0 mg氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容到100 mL容量瓶中，置于－20℃冰箱中保存。

1.2 不銹鋼管固相萃取整體柱的制備與表征

1.2.1 不銹鋼管的預(yù)處理

內(nèi)徑1.2 mm的不銹鋼管先用1 mol/L NaOH溶液浸泡1 h，再用1 mol/L的HCl溶液浸泡1 h，然后用超純水清洗并于120℃干燥1 h，待用。

1.2.2 甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯(MAA-co-EGDMA)整體柱(50 mm ×1.2 mm)的制備

參照文獻(xiàn)［15］方法，將功能單體 MAA 47 μL、交聯(lián)劑 EGDMA 400 μL、PEG-6000 160 mg、致孔劑甲醇1 100 μL和引發(fā)劑AIBN 4.5 mg混合均勻并超聲10 min得到預(yù)聚液;將預(yù)聚液注入已處理的不銹鋼管中，用硅橡膠封堵兩端并在60℃下反應(yīng)24 h。待反應(yīng)完成后，將整體柱中的致孔劑及未反應(yīng)的試劑用甲醇沖洗除去。將整體柱截成50 mm左右長(zhǎng)度保存待用。

1.2.3 MAA-co-EGDMA 整體柱的表征

采用冷場(chǎng)電子掃描顯微鏡觀察不銹鋼管整體柱截面結(jié)構(gòu)及形貌特征;通過(guò)萃取量計(jì)算表征其萃取性能，通過(guò)流速與壓力關(guān)系表征其通透性。其中，萃取量N的計(jì)算公式為:

式(1)中，N為目標(biāo)物的萃取量，A為目標(biāo)物在整體柱-HPLC在線分析時(shí)的色譜峰面積，a1及b1分別為氯吡脲采用直接進(jìn)樣分析時(shí)進(jìn)樣量(ng)與峰面積線性方程的斜率及截距。

1.3 樣品分析

準(zhǔn)確稱取切碎的水果樣品2.0 g置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈渦旋振蕩萃取4 min，再超聲波輔助萃取10 min;重復(fù)萃取1次，合并2次萃取液于離心管中，以4 000 r/min離心10 min。將上層清液置于125 mL分液漏斗中，加入10 mL水和4.8 mL二氯甲烷，強(qiáng)烈振蕩，收集上層有機(jī)相并濃縮至干，殘留物用20.00 mL甲醇-水溶液(1∶99，v/v)復(fù)溶，過(guò)0.45 μm濾膜，制得樣品溶液。將樣品溶液引入整體柱后，以甲醇-水(1∶99，v/v)為溶劑，以0.8 mL/min速率進(jìn)行萃取;然后用0.4 mL乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v)為溶劑解吸，解吸液在線轉(zhuǎn)入HPLC中進(jìn)行分析。HPLC條件:色譜柱為 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為261 nm。

水果中CPPU的回收率R按以下公式計(jì)算:

式(2)及(3)中，N和A分別為整體柱固相萃取-HPLC分析時(shí)CPPU的萃取量(ng)和色譜峰面積，a2及b2為整體柱固相萃取-HPLC分析方法線性方程的斜率及截距，CS及VS為實(shí)際樣品中CPPU的加標(biāo)濃度(μg/L)及體積(mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取整體柱的性能

2.1.1 固相萃取整體柱的形態(tài)表征

參照文獻(xiàn)［15］方法制備得到的 MAA-co-EGDMA整體柱通過(guò)SEM表征其形貌特征，如圖1所示。其中圖1a為放大60倍時(shí)整體柱的截面圖，圖1b為放大2 000倍時(shí)整體柱的內(nèi)部形貌圖。從圖1可見(jiàn)固相萃取整體柱具有比較疏松的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)較均勻，既有小顆粒與“簇”之間形成的中孔，也有小顆粒之間形成的微孔，保證了整體柱有良好的通透性。

圖1 不銹鋼管固相萃取整體柱的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of stainless steel solid-phase extraction monolithic column

此外，聚合物顆粒的紅外光譜結(jié)果顯示，在3 437 cm－1出現(xiàn)了單體甲基丙烯酸中的－OH特征伸縮振動(dòng)峰，在2 951 cm－1處出現(xiàn)了－C－H的伸縮振動(dòng)峰，在1 730 cm－1處出現(xiàn)了羰基的伸縮振動(dòng)峰(這是甲基丙烯酸中的羧基以及二甲基丙烯酸乙二醇酯中酯的羰基峰)，在1 630 cm－1處出現(xiàn)雙鍵的伸縮振動(dòng)峰。這些紅外譜圖中的特征峰與制備過(guò)程中添加試劑的紅外譜圖相吻合。

2.1.2 固相萃取整體柱的通透性

以水為流動(dòng)相，采用流速實(shí)驗(yàn)測(cè)試制備的整體柱的通透性，得到其流速-壓力曲線。結(jié)果表明，整體柱的壓力(Y)與流動(dòng)相流速(X)之間具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為Y=0.342 1X+0.362 9，相關(guān)系數(shù) R2=0.997 5。在流動(dòng)相流速超過(guò) 2.5 mL/min時(shí)，整體柱的柱壓不超過(guò)1.3 MPa。當(dāng)柱壓為0.7 MPa時(shí)，該整體柱的流速可以達(dá)到1.0 mL/min，說(shuō)明該不銹鋼管整體柱具有很好的通透性。

2.2 整體柱固相萃取-HPLC在線分析裝置

采用2個(gè)六通閥和整體柱構(gòu)建了整體柱固相萃取-HPLC在線聯(lián)用系統(tǒng)，其中六通閥Valve 1主要實(shí)現(xiàn)樣品引入功能，Valve 2主要實(shí)現(xiàn)在線萃取、解吸和分析進(jìn)樣功能，通過(guò)兩閥切換實(shí)現(xiàn)在線萃取解吸和分析檢測(cè)(見(jiàn)圖2)。在實(shí)際樣品分析中，先將樣品引入Valve 1的定量環(huán)中，然后通過(guò)泵1推動(dòng)萃取溶劑將樣品引入Valve 2中的整體柱進(jìn)行萃取和凈化;然后通過(guò)泵2將流動(dòng)相引入整體柱進(jìn)行解吸進(jìn)樣，完成樣品溶液在線萃取、解吸和分析過(guò)程。

圖2 整體柱固相萃取-HPLC在線聯(lián)用裝置示意圖Fig.2 Schematic representation of on-line device based on monolithic column solid-phase extraction coupled with HPLC

2.3 固相萃取整體柱的萃取條件的優(yōu)化

固-液兩相之間的萃取和解吸是待測(cè)目標(biāo)物在固-液相間分配、傳質(zhì)、平衡循環(huán)的一系列過(guò)程，因此萃取和解吸條件對(duì)在線萃取過(guò)程影響很大。本文分別考察了萃取溶劑的pH值及其流速、解吸溶劑的體積及其流速等主要因素對(duì)CPPU萃取量的影響。

2.3.1 萃取溶劑的pH值及其流速

根據(jù)氯吡脲的極性及文獻(xiàn)［4］的結(jié)果，本文以9 mL甲醇-水(1∶99，v/v)作為整體柱的萃取溶劑，考察了溶劑的pH值及其流速等因素對(duì)氯吡脲萃取效率的影響?？疾煲圆煌琾H的甲醇-水(1∶99，v/v)為萃取溶劑時(shí)CPPU在固相萃取整體柱上的萃取量，結(jié)果如圖3a所示。隨著萃取溶劑pH的增加，CPPU的萃取量沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，表明溶液pH值對(duì)CPPU萃取量的影響較小?？紤]到萃取溶劑的經(jīng)濟(jì)成本以及環(huán)保等因素，最后選用了pH 6.0～7.0(即不調(diào)節(jié)pH，直接用)的甲醇-水(1∶99，v/v)作為萃取溶劑。

萃取溶劑的流速與系統(tǒng)承受的壓力有關(guān)，并直接影響CPPU的萃取效率?？疾炝瞬煌腿∪軇┝魉?0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL/min)對(duì) CPPU 萃取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3b所示。在萃取溶劑流速為0.5 mL/min時(shí)CPPU的萃取量最大;流速為0.7 mL/min時(shí)CPPU的萃取量較流速為0.5 mL/min時(shí)減少了4.6%;相比流速為0.5 mL/min，流速為0.8 mL/min時(shí)萃取量只減少8.0%。這可能是由于不銹鋼管整體柱的通透性較好，樣品溶液以滲透的形式接觸到整體柱的吸附位點(diǎn)，從而使溶劑流速對(duì)CPPU的吸附量影響較小。為了加快分析速度，減少整體柱長(zhǎng)時(shí)間承受較大壓力，選取0.8 mL/min為萃取溶劑流速。

2.3.2 解吸溶劑的體積及其流速

解吸溶劑的體積及其流速對(duì)整體柱的萃取性能及其與HPLC在線分析的溶劑和時(shí)間匹配性關(guān)系密切。解吸溶劑的體積過(guò)大、流速太高或太低都容易導(dǎo)致HPLC的譜峰展寬。本文考察了以流動(dòng)相(乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v))作為解吸溶劑，其體積和流速對(duì)CPPU解吸效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3c、3d。隨著解吸溶劑的體積從0.4 mL增加到1.2 mL，CPPU 的萃取量略有增加，但0.4 mL的解吸溶劑基本可使整體柱內(nèi)吸附的CPPU解吸完全。而隨著解吸流速由0.2 mL/min增大到0.3 mL/min，CPPU的萃取量明顯增大;再繼續(xù)增大流速觀察，發(fā)現(xiàn)解吸溶劑的流速影響較小。為了縮短分析時(shí)間和減小HPLC中的峰展寬現(xiàn)象，選擇0.4 mL/min作為最優(yōu)的解吸溶劑流速。

圖3 整體柱固相萃取條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of extraction conditionsa.pH of extraction solution;b.flow rate of extraction solvent;c.volume of desorption solvent;d.flow rate of desorption solvent.

綜上所述，CPPU萃取和解吸的優(yōu)化條件為:萃取溶劑為9.0 mL甲醇-水(1∶99，v/v)溶液;萃取流速為0.8 mL/min;解吸溶劑為乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v);體積為 0.4 mL，流速為 0.4 mL/min。

2.3.3 固相萃取整體柱吸附容量的考察

吸附容量是評(píng)價(jià)整體柱性能的重要指標(biāo)。在最優(yōu)的整體柱萃取和解吸條件下，用200 μg/L的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)改變標(biāo)準(zhǔn)溶液體積考察固相萃取整體柱的吸附容量，結(jié)果見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)萃取體積達(dá)21 mL后，整體柱的吸附容量基本保持不變，此時(shí)整體柱的吸附容量為1 163 ng。

2.4 整體柱固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法

2.4.1 分析方法的建立

配制不同濃度的CPPU標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的萃取、凈化和分析條件下，采用整體柱固相萃取-HPLC在線聯(lián)用方法對(duì)其分析定量。在0.01～50.00 μg/L之間，以CPPU的峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X，μg/L)進(jìn)行線性回歸，得到的線性方程為Y=5.24×104X+61，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，表明線性關(guān)系良好。以信噪比為3確定方法的檢出限為25 ng/L。采用1.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)樣品考察方法的精密度(n=5)，其RSD為3.9%，滿足痕量分析要求。

實(shí)驗(yàn)中CPPU的富集因子為采用整體柱萃取富集后經(jīng)HPLC分析得到的CPPU濃度和20 μL直接進(jìn)樣的CPPU濃度的比值，結(jié)果表明在優(yōu)化條件下，CPPU的富集倍數(shù)可達(dá)214倍。

圖4 200 μg/L氯吡脲在整體柱上的吸附容量實(shí)驗(yàn)曲線Fig.4 Adsorption capacity of 200 μg/L CPPU at flow rate of 0.8 mL/min

2.4.2 實(shí)際樣品分析

采用建立的方法測(cè)定了市售黑葡萄、獼猴桃和西瓜等3種水果樣品，未檢出CPPU(見(jiàn)圖5)。分別對(duì)這些水果樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)CPPU的回收率為87.0%～120.7%，RSD為0.6%～9.2%，表明基體對(duì)測(cè)定結(jié)果基本不產(chǎn)生干擾，方法的準(zhǔn)確度較高，適合水果等復(fù)雜基體中痕量CPPU殘留分析檢測(cè)。

表1 水果樣品中氯吡脲的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 R ecoveries of CPPU spiked in differentfruits(n=3)

2.4.3 方法對(duì)比

表2給出了文獻(xiàn)報(bào)道的采用固相萃取-HPLC測(cè)定水果中CPPU的結(jié)果對(duì)比。結(jié)果表明，與現(xiàn)有方法相比，本文新建方法的靈敏度較高，更適合復(fù)雜體系中痕量氯吡脲殘留的分析檢測(cè)。

圖5 整體柱固相萃取-HPLC在線聯(lián)用分析實(shí)際樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of real fruit samples by monolith column SPE-HPLC in online modea.original sample;b.spiked sample with 0.6 μg/L CPPU.

表2 本文方法與文獻(xiàn)報(bào)道的固相萃取-HPLC方法測(cè)定水果中氯吡脲的對(duì)比Table 2 Comparison of the proposed method with other methods from the references for the determination of CPPU in fruits

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用原位聚合法研制了高通透性MAA-co-EGDMA不銹鋼管整體柱，整體柱的吸附容量達(dá)1 163 ng，富集倍數(shù)為214倍。建立了整體柱固相萃取在線富集-HPLC聯(lián)用方法并在線分析了黑葡萄、獼猴桃和西瓜等水果中CPPU的殘留量。方法的線性范圍為0.01～50.00 μg/L，檢出限為25 ng/L，RSD 3.9%。黑葡萄、獼猴桃和西瓜中氯吡脲的加標(biāo)回收率為87.0%～120.7%，RSD為0.6%～9.2%，滿足水果樣品中痕量氯吡脲分析的要求。

［1］ Chen W J，Jiao B N ，Su X S，et al.Bull Environ Contam Tox，2013，90:756

［2］ Shi X M，Jin F，Huang Y T，et al.J Agric Food Chem，2012，60:60

［3］ Shi X M，Jin F，Huang Y T，et al.Food Industry Science＆Technology(史曉梅，金芬，黃玉婷，等.食品工業(yè)科技)，2012，33(4):417

［4］ Valverde A，Aguilera A，F(xiàn)errer C，et al.J Agric Food Chem，2010，58:2818

［5］ Yang L，Lu J，Zhu J L，et al.Journal of Northwest Forestry University(楊柳，陸軍，朱杰麗，等.西北林學(xué)院學(xué)報(bào))，2013，28(2):156

［6］ Hu J T，Sheng Y，F(xiàn)ang Z，et al.Chinese Journal of Chromatography(胡江濤，盛毅，方智，等.色譜)，2007，25(3):441

［7］ Zhao L，Ma Q，Ma L.Journal of Analytical Science(趙莉，馬青，馬琳.分析科學(xué)學(xué)報(bào))，2013，29(4):583

［8］ Zhang J，Du P.Chinese Journal of Chromatography(張軍，杜平.色譜)，2011，29(11):1133

［9］ Wang J，Chow W，Leung D，et al.J Agric Food Chem，2012，60:12088

［10］ Suarez-Pantaleon C，Turrillas F A，Mercader J V，et al.Anal Bioanal Chem，2012，403:2019

［11］ Liu J J，Gong P，Zhang X M，et al.Chinese Journal of Chromatography(劉靖靖，宮萍，張曉梅，等.色譜)，2012，30(10):1012

［12］ Liu J，Wang J F，Lin H，et al.Anal Chem，2013，85:2847

［13］ Mou Y L，Guo D H，Ding Z P.Chinese Journal of Chromatography(牟艷莉，郭德華，丁卓平.色譜)，2013，31(10):1016

［14］ Martinez-Hansen V，Latorre N，Royo C，et al.Cat Today，2009，147:S71

［15］ Hu Y L，F(xiàn)an Y F，Li G K.J Chromatogr A，2012，1228:205