基于整體材料攪拌棒固相萃取高效液相色譜聯(lián)用測定飼料和水樣中硝基呋喃類藥物殘留

張 詠， 梅 萌， 黃曉佳， 袁東星

(廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005)

呋喃唑酮(FZD)、呋喃妥因(NFT)和呋喃西林(NFZ)屬于硝基呋喃類(NFA)抗生素，由于具有優(yōu)良的藥效和較長的持藥性而被廣泛用于飼料添加劑、治療藥物或直接投入水體防治病害［1，2］。近幾年來發(fā)現(xiàn)NFA及其代謝物具有強(qiáng)的“三致”毒副作用，歐盟、日本、中國等國家與組織都將其列為禁用藥物。但有研究表明，有不法分子仍在動物飼料及飲用水中非法添加NFA，2002－2003年歐盟在其從葡萄牙、希臘等國進(jìn)口的豬肉中檢測出NFA及其代謝物［3］。因此監(jiān)測飼料和水樣中的硝基呋喃類抗生素可以從源頭上監(jiān)控 NFA的非法使用［4，5］。目前高效液相色譜法是分析NFA的最常用方法［6，7］，但實(shí)際樣品基底的復(fù)雜性要求樣品分析前必須進(jìn)行合適的前處理。固相萃取(SPE)是分析NFA最常用的樣品前處理方法，但其操作繁瑣，同時需要較多的有機(jī)溶劑［8，9］。因此發(fā)展簡便、高富集效率和環(huán)境友好的樣品制備技術(shù)對NFA的監(jiān)測具有重要意義。攪拌棒固相萃取技術(shù)(SBSE)是一種集萃取、富集、凈化為一體的新型樣品前處理技術(shù)，具有操作簡便、溶劑使用量少、富集倍數(shù)高和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)［10，11］。但目前SBSE主要的商品化涂層——聚二甲基硅氧烷(PDMS)只能有效富集中性和弱極性化合物，而NFA均為強(qiáng)極性物質(zhì)(FZD、NFT和NFZ的logKow值分別為－0.04、－0.47和0.23)，因此可以預(yù)計PDMS-SBSE無法直接萃取NFA。

我們在前期研究中制備了以聚(乙烯基咪唑-二乙烯基苯)(VIDB)整體材料為涂層的SBSE，由于極性基團(tuán)咪唑基的存在，VIDB-SBSE可通過包括氫鍵、偶極-偶極及疏水等多重作用力對極性化合物進(jìn)行有效萃?。?2，13］。因此在本研究中，利用 VIDBSBSE來萃取3種極性NFA，同時與高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)聯(lián)用，建立可對飼料和水樣中NFA殘留進(jìn)行有效監(jiān)測的VIDB-SBSEHPLC-DAD分離分析體系。本研究還對比了其他自制的基于整體材料的SBSE(SBSEMs)對上述3種NFA的萃取性能，并計算了目標(biāo)物在這些SBSEMs上的分配系數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜設(shè)備:LC-20AB泵;CBA-20A控制器;SPD-M20A DAD檢測器(Shimadzu，Kyoto，Japan);進(jìn)樣閥:7725i(Rheodyne，USA);定量閥:20 μL。商品化攪拌棒(PDMS-SBSE):涂層材料為PDMS，棒長 20 mm，涂層厚度 1.0 mm(Twister;Gerstel，Müllheim a/d Ruhr;Germany)。自制的基于整體材料的SBSE包括VIDB-SBSE(以聚(N-乙烯基咪唑-二乙烯基苯)整體材料為涂層［12］)、VPDBSBSE(以聚(N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯)整體材料為涂層［14］)、VPDE-SBSE(以聚(N-乙烯基吡啶-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體材料為涂層［15］)和VPDP-SBSE(以聚(N-乙烯基鄰苯亞胺-N，N-二甲基雙丙烯酰胺)整體材料為涂層［16］)。這4種SBSE的棒長均為30 mm，涂層厚度均為1.0 mm。

FZD、NFT和NFZ標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司;乙腈(ACN)和甲醇(色譜純)購自Tedia公司(Fairfield，USA);全部實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(Millipore，Bedford，MA，USA)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取2.5 mg各標(biāo)準(zhǔn)樣品，以甲醇溶解并定容于25 mL棕色瓶中，配制成100 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4℃的冰箱中保存。使用時，用甲醇為稀釋液，取各單標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用稀釋液配制成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

飼料樣品購自廈門市場;實(shí)際水樣采自廈門淡水養(yǎng)殖場，置于冰箱冷藏待用。

1.3 色譜條件

色譜分離柱:Kromasil LC-18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:水/乙腈(體積比為 75∶25)二元溶液;流速:1.0 mL/min;檢測波長:366 nm;進(jìn)樣體積:20 μL。

1.4 實(shí)際樣品前處理

飼料樣品:準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于離心管中，加入2.5 mL乙腈，漩渦振蕩混勻5 min，然后超聲提取5 min，高速離心10 min，取上清液。用2.5 mL乙腈再重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。取1.0 mL提取液于250 mL燒杯中，加入99 mL水，將溶液pH 值調(diào)到10.0，并加入15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的 NaCl。放入攪拌棒以300 r/min的速度進(jìn)行攪拌萃取2.0 h。萃取完成后，取出攪拌棒，將其放置于3.0 mL乙腈中，在同樣的攪拌速度下解吸1.5 h，解吸液直接進(jìn)行色譜分析。

實(shí)際水樣:將水樣過0.45 μm濾膜，然后取100 mL濾液于250 mL燒杯中，余下步驟(調(diào)pH，加入NaCl，萃取，解吸)同飼料樣品的處理。

1.5 目標(biāo)物在整體材料涂層和水中分配系數(shù)(KMC/W)的計算

根據(jù)文獻(xiàn)［17］，F(xiàn)ZD、NFT 和 NFZ 的 KMC/W計算如方程(1)所示。

其中，KMC/W為萃取達(dá)平衡時，目標(biāo)物在整體材料涂層中的濃度(CMC)和水中的濃度(CW)之比，即等于目標(biāo)物在整體材料涂層中的質(zhì)量(mMC)和水中的質(zhì)量(mW)之比與相比的乘積。在本研究中，所使用的以整體材料為涂層的4根攪拌棒相比均為1 062。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

在SBSE過程中，萃取和解吸時間、樣品基底pH值和離子強(qiáng)度對目標(biāo)物的富集性能有較大影響。為了得到VIDB-SBSE對3種NFA的最佳萃取條件，本研究對上述萃取條件進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化。

2.1.1 萃取和解吸時間的優(yōu)化

圖1為萃取時間對萃取效率的影響。由圖1可見，在其他實(shí)驗(yàn)條件保持不變時，萃取時間在0.5～2.0 h之間時，隨著萃取時間的增加，VIDB-SBSE對3種目標(biāo)物的萃取量逐漸增大，在2.0 h時，吸附達(dá)到平衡。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇2.0 h為最佳萃取時間。解吸時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有較大影響。本研究考察了解吸時間在15～120 min之間時解吸效果的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在90 min的時候，目標(biāo)化合物可以從VIDB-SBSE中被完全解吸，因此解吸時間確定為1.5 h。

圖1 萃取時間對萃取效率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction efficiencyConditions:desorption time was 1.0 h;the pH value of sample matrix was unadjusted;no salt was added;the spiked concentration of each analyte was 50 μg/L.

2.1.2 pH 值的影響

由于硝基呋喃類藥物分子結(jié)構(gòu)中含有豐富的氮原子，同時整體材料結(jié)構(gòu)中存在著咪唑基團(tuán)，因此樣品基底pH值會影響NFA和咪唑基團(tuán)的存在形式，從而影響VIDB-SBSE對NFA的萃取性能。在其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)不變的條件下，基底pH值從2.0增加到12.0，其對萃取效率的影響如圖2所示。從圖2中可以看出，當(dāng)pH值較低時，VIDB-SBSE主要通過疏水作用對NFA進(jìn)行吸附，但此時NFA和整體材料的咪唑基團(tuán)中的氮原子均被質(zhì)子化而產(chǎn)生電荷排斥作用，因而減弱了VIDB-SBSE對目標(biāo)物的吸附能力。隨著pH值的升高，質(zhì)子化程度減弱，電荷排斥作用減小，因此萃取性能提高。隨著pH值的繼續(xù)增加，氮原子完全去質(zhì)子化，此時除了疏水作用外，咪唑基團(tuán)和NFA還存在著氫鍵和偶極-偶極作用，在多重作用力下，VIDB-SBSE對NFA的萃取能力進(jìn)一步增強(qiáng)。但當(dāng)pH提高到10以上時，溶液中過多的OH－嚴(yán)重削弱了氫鍵和偶極-偶極作用，導(dǎo)致萃取性能下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇10.0為最優(yōu)pH值。

圖2 樣品pH值對萃取效率的影響Fig.2 Effect of pH value of sample matrix on extraction efficiencyConditions:extraction and desorption times were 2.0 h and 1.5 h，respectively;no salt was added;the spiked concentration of each analyte was 50 μg/L，and the sample pH values were adjusted by 0.1 mol/L HCl or 0.1 mol/L NaOH.The symbols are the same as in Fig.1.

2.1.3 離子強(qiáng)度的影響

根據(jù)文獻(xiàn)［14－17］，對于極性化合物的萃取，由于存在鹽析作用及靜電相互作用，因此離子強(qiáng)度對萃取效率有很大影響。本實(shí)驗(yàn)通過添加不同量的NaCl來改變基底的離子強(qiáng)度，添加量從0到35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(0、5%、10%、15%、20%、25%、30% 和35%)。從圖3可以看出，當(dāng)NaCl含量為15%時，VIDB-SBSE對目標(biāo)物的萃取性能均達(dá)到最大值，因此選擇15%為最佳的NaCl添加量。

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，VIDB-SBSE對3種NFA的最佳萃取條件為:吸附2.0 h，解吸1.5 h，基底pH值調(diào)為10.0，NaCl的含量為15%。

2.2 與其他SBSE的對比

在最佳萃取條件下，VIDB-SBSE對FZD、NFT和NFZ顯示出理想的萃取性能。從圖4可以看出，與加標(biāo)水樣富集前(圖4a)相比，經(jīng)過VIDB-SBSE富集后，3種目標(biāo)物的色譜峰明顯增高(圖4c)，VIDB-SBSE對FZD、NFT和NFZ的富集效率分別為76.5%、82.2%和80.1%，而商品化的 PDMSSBSE則對目標(biāo)物沒有富集效果(圖4b)。

圖3 離子強(qiáng)度對萃取效率的影響Fig.3 Effect of ionic strength in sample matrix on extraction efficiencyConditions:pH value was adjusted to 10.0.The other conditions were the same as in Fig.2.

圖43 種硝基呋喃類藥物經(jīng)VIDB-SBSE和PDMS-SBSE萃取后的色譜圖Fig.4 Chromatograms of FZD，NFT and NFZ after enrichmentwithVIDB-SBSEandPDMSSBSEa.direct injection of spiked water sample with each analyte at 50 μg/L;b.spiked water sample with each analyte at 50 μg/L and treated with PDMS-SBSE;c.spiked water sample with each analyte at 50 μg/L and treated with VIDB-SBSE.

圖5 不同SBSEMs富集3種硝基呋喃類藥物后的色譜圖Fig.5 Chromatograms of FZD，NFT and NFZ after enrichment with different SBSEMs

圖5為自制的不同SBSEMs對 FZD、NFT和NFZ萃取性能比較，從圖5中可見，不同SBSEMs對FZD、NFT和NFZ有不同的萃取性能。VIDB-SBSE對FZD和NFZ的萃取性能優(yōu)于其他3種SBSEMs，而VPDB-SBSE則對NFT有最高吸附能力，這說明不同涂層的SBSE對不同化合物具有不同的萃取性能。表1列出了呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林在不同SBSEMs上的分配系數(shù)，分配系數(shù)越大，說明該SBSEM對目標(biāo)物的吸附能力越強(qiáng)。表1數(shù)據(jù)表明，3種目標(biāo)物在4種SBSEMs的K值均高于KPDMS/W，說明這4種自制的SBSEMs對3種目標(biāo)物的吸附能力均優(yōu)于商品化的PDMS-SBSE，其原因主要是這幾種SBSEMs涂層中含有極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)，因此可通過多重作用力對NFA進(jìn)行有效萃取，而PDMS-SBSE則只能通過較弱的疏水作用萃取目標(biāo)物，因此萃取性能較低。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

用標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制不同濃度梯度的溶液，在最佳萃取條件下，考察方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及日內(nèi)和日間重復(fù)性，結(jié)果見表2。

表1 呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林在不同SBSEMs上的分配系數(shù)Table 1 Distribution coefficients(K)of FZD，NFT and NFZ on different SBSEMs

表2 3種NFA的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限、定量限、萃取效率及日內(nèi)和日間重復(fù)性Table 2 Linear ranges，correlation coefficients(R2)，LODs and LOQs，extraction efficiencies，inter-day and intra-day precisions achieved for the three NFA

從表2中的數(shù)據(jù)可知，呋喃唑酮的線性范圍為0.5～200 μg/L，呋喃妥因和呋喃西林的線性范圍為0.25～200 μg/L，3種目標(biāo)化合物均具有良好的線性關(guān)系(R2＞0.99)。同時研究取得了與 MS檢測［18，19］在同一級別的靈敏度，其 LOD 在 0.068 ～0.11 μg/L 之間，LOQ 在 0.22 ～0.36 μg/L 之間，所建方法的日內(nèi)和日間的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好(RSD＜6%)。表明本方法具有較高的靈敏度和重復(fù)性。

2.4 實(shí)際樣品測定及加標(biāo)回收率試驗(yàn)

將所建的VIDB-SBSE-HPLC-DAD方法用于飼料和實(shí)際水樣中NFA的測定，其結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，在一個水樣中測得低濃度的NFT，而飼料樣品均未檢出NFA。實(shí)際樣品中復(fù)雜基底可能對萃取效率產(chǎn)生影響，為了考察所建立的方法用于實(shí)際樣品中3種NFA物質(zhì)測定的可行性，測定了飼料和實(shí)際水樣中不同加標(biāo)量的回收率。從表3可以看出，對于兩種不同質(zhì)量濃度加標(biāo)量(5.0和100 μg/L)，在不同飼料和水樣中均取得了理想的回收率，3種目標(biāo)物的回收率在80.6%～108%之間。同時實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好，所有RSD值均小于10%。

表3 實(shí)際飼料和水樣中3種目標(biāo)物的測定結(jié)果及加標(biāo)回收率(n=3)Table 3 R esults of determination and recoveries of water and feed samples spiked with the three target analytes(n=3)

3 結(jié)論

本研究利用自制的以聚(N-乙烯基咪唑-二乙烯基苯)整體材料為涂層的SBSE萃取飼料和水樣中的3種硝基呋喃類化合物，由于萃取介質(zhì)可與目標(biāo)物產(chǎn)生多種作用力，因此VIDB-SBSE可對3種目標(biāo)物進(jìn)行直接有效萃取。在此基礎(chǔ)上，建立了可對實(shí)際飼料和水樣中硝基呋喃類藥物進(jìn)行有效監(jiān)測的VIDB-SBSE-HPLC-DAD分離分析方法。研究結(jié)果表明，所建方法具有萃取效率高、操作簡便、檢出限低、重現(xiàn)性好、環(huán)境友好等特點(diǎn)。

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