建立攜帶左旋天門冬酰胺酶的紅細胞特異性表達系統(tǒng)

潘欣，曾思良，宋維，余秀珍，張俊，張鴻聲，方偉，陳敏，廖萬清

1.上?？【S寓醫(yī)館，上海 200433；2.上海市中原中學，上海 200438；3.同濟大學，上海 200433；4.第二軍醫(yī)大學，上海 200433

左旋天門冬酰胺酶（L-asparaginase，L-ASNase）是治療淋巴細胞白血病等惡性血液病的重要藥物之一[1]。某些類型的腫瘤細胞表達的L-天門冬酰胺合成酶（L-asparagines synthetase，L-AS）活性遠遠低于正常細胞，難以在胞內(nèi)將氨或L-Glu的酰胺基在ATP和Mg2+存在時有效地轉(zhuǎn)移至L-Asp的β羧基生成L-Asn，因而迫使這類腫瘤細胞利用外源Asn以維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成與細胞增殖[2]；而L-ASNase可水解Asn（必需氨基酸）為Asp和氨，由于人體內(nèi)不存在天然L-ASNase，若向患者體內(nèi)引入L-ASNase，全身性降解Asn，可使這類腫瘤細胞因L-AS活性低，不能獨立合成Asn，造成Asn饑餓，導致蛋白質(zhì)的生物合成紊亂而死亡，達到在不影響正常細胞生理功能的前提下殺傷腫瘤細胞的目的[3]。但L-ASNase是異源酶，免疫原性易致人體產(chǎn)生滅活酶的抗體，且不良反應較大，因此亟待研發(fā)低免疫原性L-ASNase給藥方案。目前有臨床試驗將L-ASNase用急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）復發(fā)患者的自體紅細胞（red blood cell，RBC）封裝后再自體回輸[4]，該給藥方案在理論上可消弱L-ASNase的抗原性，阻礙治療性酶被宿主蛋白水解酶降解；在臨床上也觀察到可降低ALL復發(fā)患者抗-L-ASNase抗體的形成，明顯減弱過敏反應、凝血功能障礙和肝功能失常，改善了病患的健康狀況。然而，這種用非基因修飾方法將藥物封裝進RBC的方案或多或少均改變了RBC的形態(tài)和細胞膜特征（如易碎、變形性下降等），增加了機體清除這部分RBC的機率[5]。由于造血干細胞在體外向紅細胞定向分化需時較長，若向造血干細胞中引入L-ASNase基因，可以使其在定向分化過程中開始表達L-ASNase，克服紅細胞生命力短暫、難以在體外長期存活之弱點，延長藥物時效，為尋找合適的分化期導入體內(nèi)遏制ALL奠定基礎。

在本研究中，我們用攜帶L-ASNase的紅細胞特異性重組慢病毒載體系統(tǒng)包裝出自滅活（self-inacti?vation，SIN）重組慢病毒，以小鼠紅白血?。╩urine erythroleukemia，MEL）細胞經(jīng)誘導可向紅細胞終端分化為模型，探討重組慢病毒感染后MEL細胞在分化過程中表達L-ASNase目的基因，延長藥物時效的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎（human embryonic kidney，HEK）293T細胞、MEL細胞、小鼠成纖維細胞NIH/3T3和穩(wěn)定表達對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細胞、人宮頸癌HeLa細胞為本課題組保存；大腸桿菌DH5α、包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMTHS4-IVS2（-）、RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry和RRL-sEF1α-2A-mCherry為本課題組保存。

各種限制性內(nèi)切酶為New England Biolabs公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、AIM-V XIVIVO-5培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）為Invitrogen Gibco公司產(chǎn)品，O6-芐基鳥嘌呤（O6-benzylguanine，BG）、雙氯乙亞硝脲［1，3-bis（2-chloroethyl）-1-nitrosourea，BCNU；商品名為卡莫司?。荨⒘鶃喖谆阴０罚∟，N'-hexameth?ylene bisacetamide，HMBA）、聚乙烯亞胺（polyethyl?enimine，PEI）和聚凝胺（polybrene）為Sigma公司產(chǎn)品；兔抗大腸桿菌L-ASNase多抗為GeneTex公司產(chǎn)品；小鼠抗mCherry單克隆抗體為EarthOx公司產(chǎn)品；青霉素和鏈霉素溶液（以下簡稱雙抗）為Hyclone公司產(chǎn)品；InstaGene Matrix為Bio-Rad公司產(chǎn)品；熒光定量（TaqMan）快速PCR混合試劑盒（2×）為ABI公司產(chǎn)品；哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑（mammali?an protein extraction reagent，M-PER）、2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和鍵合了Alexa 488的山羊抗兔IgG為Affinity Biologicals公司產(chǎn)品；標準品LASNase為日本協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社產(chǎn)品。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)移載體的設計和制備

RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMTHS4-IVS2（-）的結(jié)構(gòu)（圖1）中，為方便監(jiān)測目的基因的表達，將編碼L-ASNase的cDNA通過2A聯(lián)接體技術(shù)與編碼紅色單體熒光蛋白mCherry的cDNA連接，同受β-珠蛋白啟動子（promoter，P）、β-珠蛋白3'端增強子（enhancer，E）和β-珠蛋白位點控制區(qū)（locus control regions，LCR）DNaseⅠ高敏位點（hypersensi?tive site，HS）中具有較強增強子活性的HS2和具有染色質(zhì)開放活性的HS3調(diào)控[6]。2A為源于一點褐翅蛾病毒的2A短肽（Thosea asigna virus 2A，T2A），當核糖體快速處理2A肽C端甘氨酰-脯氨酰之間的肽鍵合成時，會引起2A肽與其下游肽之間發(fā)生自裂解，該序列允許在同一讀框中通過2A的自裂解表達多種非融合的獨立的目的蛋白[7]。位于載體3'端可以非組織特異性地表達甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶變異體（methylguanine methyltransferase，MGMT）P140K的耐藥基因由人磷酸甘油酸激酶啟動子（phospho?glycerate kinase promoter，PGK-P）控制，這樣可以通過使用化療藥物BG和BCNU富集基因修飾的陽性細胞，并確保在篩選富集細胞的過程中目的基因受到有效控制，不會表達。為提高載體制備的有效性，增加慢病毒滴度和轉(zhuǎn)染率，刪除了慢病毒載體LCR區(qū)域中功能待定的HS1和有增強子活性的HS4，同時刪除了β-珠蛋白中具內(nèi)含子增強子活性的第 2個內(nèi)含子（intervening sequence 2，IVS2）[8]。由于LCR主要的功能是激活β-珠蛋白基因簇，限制珠蛋白基因僅在紅系細胞中表達，確保受調(diào)控基因在發(fā)育或分化過程中以一定的時序和模式正確表達，因而賦予該載體具有紅系組織特異性[9]。

為快速測定慢病毒載體所攜帶的目的基因可否在靶細胞中表達，我們還構(gòu)建了非組織特異性慢病毒載體 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry，利用2A聯(lián)體技術(shù)將L-ASNase基因和mCherry報告基因置于短的延長因子 1α（short elongation factor 1α，sEF1α；刪除了第一內(nèi)含子）啟動子控制下，在聯(lián)體基因的3'端增加了土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional reg?ulatory element），以提升mRNA的polyA加尾效率。為驗證2A是否影響下游報告基因的正常表達，還構(gòu)建了僅表達2A-mCherry的非組織特異性慢病毒載體RRL-sEF1α-2A-mCherry。

應用不同的限制性內(nèi)切酶及DNA重組技術(shù)構(gòu)建上述慢病毒轉(zhuǎn)移載體。

1.3 重組慢病毒包裝

用三質(zhì)粒系統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞制備重組慢病毒顆粒[9]。當HEK 293T細胞在10 cm細胞培養(yǎng)皿中生長達80%～90%匯合時，棄含雙抗（青霉素終濃度為50 U/mL，鏈霉素終濃度為50 mg/mL）的完全DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS），將PEI轉(zhuǎn)染三質(zhì)?；鞈乙海ㄙ|(zhì)粒總量為8 μg/皿，pMD2.G、psPAX2和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒按1∶2∶3的質(zhì)量比例混懸于1 mL無血清無抗生素 DMEM 中，再加 24 μL pH7.0 的 1 μg/μL PEI）加至用9 mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基覆蓋的HEK 293T細胞中，24 h后棄上清，換預熱的新鮮完全培養(yǎng)基，分別于48和96 h收獲細胞培養(yǎng)上清中的病毒液，500 r/min離心10 min除去脫落的細胞和大的細胞碎片，用0.45 μm的濾器過濾上清，濾液經(jīng)8500 r/min離心12 h濃縮病毒顆粒，用無血清的AIM-V XIVIVO-5培養(yǎng)基重懸病毒顆粒，分裝至凍存管，-80℃保存?zhèn)溆谩⒅亟M慢病毒以載體名稱命名。

1.4 重組慢病毒滴度測定

用終質(zhì)量濃度為8 μg/mL的Polybrene介導重組病毒顆粒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞NIH/3T3，培養(yǎng)7 d后用InstaGene Matrix抽提基因組DNA。以穩(wěn)定表達對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細胞基因組為對照，2套引物-探針聯(lián)合使用，采用多重TaqMan PCR檢測病毒滴度[9]。慢病毒序列檢測所用正向引物為GAG-F（5'-GGAGCTAGAACGATTC GCAGTTA-3'），反向引物為 GAG-R（5'-GGTTGTA GCTGTCCCAGTATTTGTC-3'），探針為 GAG-P（5'-［FAM］ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG［TAMRA］-3'）。小鼠β-actin（簡稱BAC）為內(nèi)源性對照，正向引物為BAC-F（5'-GGCACCACACCTTC TACAATG-3'），反向引物為 BAC-R（5'-GGGGTGT TGAAGGTCTAAAC-3'），探針為 BAC-P（5'-［HEX］TGTGGCCCCTGAGGAGCACCC［BHQ1］-3'）。 用Applied Biosystems公司的7500 PCR儀，每個定量PCR反應中基因組DNA共使用100 ng（1×TaqMan快速PCR混合試劑，500 nmol/L基因特異性正、反向引物和探針），每組反應設3個重復。在SDS 2.1軟件中設置定量PCR反應程序為95℃ 10 min熱啟動；PCR反應94℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)[10]。

已知穩(wěn)定表達對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3每個細胞中有1個慢病毒載體拷貝數(shù)（vector copy number，VCN），其基因組DNA用未感染慢病毒的NIH/3T3細胞基因組DNA進行1/5系列稀釋后，通過定量PCR獲得慢病毒轉(zhuǎn)染的VCN回歸曲線。根據(jù)該曲線，計算未知樣品中感染重組慢病毒GAG基因的拷貝數(shù)。病毒滴度（titer，T）計算公式：T（U/mL）=VCN×稀釋率的倒數(shù)×起始細胞數(shù)[11]。

1.5 免疫染色

人宮頸癌HeLa細胞接種于6孔培養(yǎng)板的無菌蓋玻片上，非組織特異性重組慢病毒RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry按 1∶10稀釋感染 HeLa細胞，24 h后換新鮮完全培養(yǎng)基，96 h后用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗后用含0.5%Triton X-100的PBS透化30 min，用Image-iT FX信號增強劑封閉30 min，加入1∶500稀釋的兔抗大腸桿菌L-ASNase多抗室溫孵育2 h，PBS洗后，加入1∶1000稀釋的鍵合了Alexa 488的山羊抗兔IgG，室溫避光孵育60 min，PBS洗后，晾干的蓋玻片用抗褪色金牌介質(zhì)在載玻片上裝片，指甲油封片。

1.6 BG/BCNU篩選與報告基因檢測

為有效富集陽性轉(zhuǎn)染細胞，MEL細胞經(jīng)重組慢病毒感染后，先與50 μmol/L BG孵育1 h，再加50 μmol/L BCNU于37℃共孵育1 h，1 h后換預熱的不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，以后每3 d換1次培養(yǎng)液，移除懸浮細胞，篩選14 d后進行后續(xù)實驗。

分別在指定時間收獲1×105經(jīng)篩選富集的感染非組織特異性重組慢病毒的MEL細胞，用流式細胞儀檢測mCherry紅色熒光強度，以評估BCNU有效篩選情況。

用熒光顯微鏡監(jiān)測感染組織特異性重組慢病毒的MEL細胞分別在5 mmol/L HMBA誘導前、后報告基因mCherry的表達情況，以評估調(diào)控因子對目的基因組織特異性表達的控制效果。

同時用流式細胞儀監(jiān)測感染或未感染重組慢病毒的MEL細胞經(jīng)5 mmol/L HMBA誘導前、后報告基因mCherry的表達情況，以評估MEL細胞向紅系終端分化過程中攜帶目的蛋白的能力。

1.7 免疫印跡

在指定時間收獲感染或未感染或誘導的MEL細胞，用哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑抽提細胞總蛋白，用Bradford法進行蛋白定量，取等量總蛋白（每孔60 μg/20 μL）進行12%SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，膜與1∶1000稀釋的一抗于4℃孵育過夜，洗膜后與HRP標記的二抗于37℃溫育1 h，ECL顯色，獲取圖像。檢測L-ASNase印跡膜使用的一抗為兔抗大腸桿菌L-ASNase多克隆抗體，二抗為山羊抗兔IgG；檢測mCherry的印跡膜使用的一抗為鼠抗mCherry單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG；檢測看家基因GAPDH表達的印跡膜使用的一抗為鼠抗GAPDH單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建和鑒定

為增加慢病毒滴度和轉(zhuǎn)染率，在不影響重組蛋白表達的組織特異性和預期可以維持目的基因需要的表達水平的基礎上，采用優(yōu)化的基因調(diào)控因子，即選擇較短的β-珠蛋白啟動子，并去除β-珠蛋白IVS2和LCR中的HS1和HS4，構(gòu)建了結(jié)構(gòu)正確的含目的基因及報告基因的紅細胞組織特異性的慢病毒載體RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）、非組織特異性慢病毒載體RRL-sEF1α-LASNase-2A-mCherry和 RRL-sEF1α-2A-mCherry（圖1），并經(jīng)限制性酶譜鑒定和測序分析驗證。

2.2 重組慢病毒滴度檢測

重組慢病毒載體分別與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G經(jīng)PEI介導瞬時共轉(zhuǎn)染293T細胞獲得重組慢病毒，經(jīng)8500 r/min離心濃縮，用多重TaqMan PCR測得重組慢病毒RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）的滴度為（4.21±0.58）×107U/mL，RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry的滴度為（7.6±2.5）×106U/mL，RRL-sEF1α-2A-mCherry的滴度為（2.05±0.67）×107U/mL。

2.3 重 組 慢 病 毒 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry在HeLa細胞中表達攜帶基因的檢測

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

為快速鑒定采用2A聯(lián)體技術(shù)可實現(xiàn)重組慢病毒在感染細胞中同時表達目的基因及報告基因，將非組織特異性重組慢病毒RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry按1∶10稀釋后感染HeLa細胞。在激發(fā)光為587 nm、發(fā)射譜為610 nm的熒光顯微鏡下檢測到mCherry報告基因主要在感染細胞核中表達（紅色熒光）（圖2B），L-ASNase基因主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達，L-ASNase可與多抗結(jié)合，用鍵合了Alex 488的二抗可顯示綠色熒光（圖2C），提示mCherry與LASNase表達時自2A處自裂解，各自獨立成像，無共定位（圖2D）。

2.4 重組慢病毒感染MEL細胞后報告基因表達水平的測定

MEL細胞以MOI=10分別感染各包裝濃縮的重組慢病毒，用流式細胞儀在指定時間點監(jiān)測化療藥物BG/BCNU對重組慢病毒感染MEL細胞的選擇富集效果（圖3），對照為未感染慢病毒的MEL細胞。非組織特異性重組慢病毒感染MEL細胞中mCherry報告基因表達的陽性率經(jīng)篩選后均有所提升，陽性細胞得到有效富集；組織特異性重組慢病毒感染MEL細胞中mCherry報告基因未表達。提示紅系特異性調(diào)控因子對基因表達控制較嚴格。多重Taq?Man PCR檢測結(jié)果表明，用BG/BCNU篩選16 d誘導0 d的MEL細胞中，組織特異性病毒的滴度是未經(jīng)BG/BCNU篩選培養(yǎng)細胞的3.2倍（P=0.0025）。

紅細胞特異性重組慢病毒感染的MEL細胞，經(jīng)BG/BCNU富集16 d后，用5 mmol/L HMBA誘導，MEL細胞在向紅系終端分化的過程中，在激發(fā)光為587 nm、發(fā)射光為610 nm的熒光顯微鏡下檢測到mCherry報告基因在感染細胞中得到逐步增高的表達（紅色熒光）（圖4）。

圖2 重組RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry慢病毒在HeLa細胞中的表達A：明場下感染的HeLa細胞；B：在激發(fā)光為587 nm、發(fā)射光為610 nm下感染的HeLa細胞，表達的紅色單體熒光蛋白mCherry主要在細胞核內(nèi)；C：L-ASNase與多抗結(jié)合，用鍵合了Alex 488的二抗顯示綠色熒光，激發(fā)光為495 nm，發(fā)射光為519 nm，表達的L-ASNase主要在細胞質(zhì)內(nèi)；D：2種熒光通道與明場融合，mCherry與L-ASNase各自獨立表達，無共定位

用流式細胞儀對誘導的MEL細胞進行監(jiān)測，結(jié)果如圖5，紅細胞組織特異性重組慢病毒表達報告基因mCherry的細胞數(shù)量隨誘導時間的延長而增多，非組織特異性的則相反。對照為未感染重組慢病毒，但用HMBA誘導同樣時間的MEL細胞。

2.5 重組慢病毒攜帶目的基因及報告基因的表達鑒定

Western印跡分析顯示，重組慢病毒RRL-sEF1α-2A-mCherry感染的MEL細胞裂解物中，2A肽N端的部分序列通過自裂解作用游離出來，2A肽C端的部分序列與紅色單體熒光蛋白mCherry的N端結(jié)合；而重組慢病毒RS9-L-ASNase-2A-mCher?ry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）感染的MEL細胞經(jīng)BG/BCNU選擇和HMBA誘導7 d后，細胞內(nèi)表達的L-ASNase的C端結(jié)合了2A肽自裂解作用產(chǎn)生的N端部分序列（圖6）。

3 討論

在抗癌研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)多種代謝異常的惡性腫瘤依賴某些外源性氨基酸，例如兒童ALL、卵巢癌、成人非霍奇金淋巴瘤不能合成L-Asn，需要從血液中吸收Asn供其生長，因而耗竭腫瘤必需氨基酸而對正常細胞不良反應最小的癌細胞選擇性療法誕生了[12]。利用L-ASNase靶向性酶解L-Asn在治療兒童ALL中取得了顯著成功，患兒5年生存率已提高到80%以上，也能明顯減小非霍奇金淋巴瘤[13]。然而，由于人體內(nèi)不存在天然L-ASNase，而異源LASNase在臨床應用中受限的主要原因是其免疫原性，以及由此引發(fā)的過敏反應、過敏性休克及酶的免疫抑制與清除[14]。因此，降低異源酶的免疫原性，突破臨床應用的局限性，成為研究人員需要解決的主要問題。

圖3 流式細胞儀監(jiān)測化療藥物BG/BCNU選擇對MEL細胞中mCherry報告基因表達的影響

目前供臨床使用的細菌源天門冬酰胺酶制劑有3種類型，一種是大腸桿菌-天門冬酰胺酶（E.coli-asparaginase，EcA）[15]，第二種是聚乙二醇-天門冬酰胺 酶（polyethylene glycol-asparaginase，PEGA）[16]。EcA或PEGA是治療ALL的一線方案。第3種歐文菌-天門冬酰胺酶（Erwinia-asparaginase，ErA）與EcA具有不同的免疫學特性，在歐洲和美國用作過敏患者的二線或三線治療方案[17]。

圖4 重組RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）慢病毒在MEL細胞中mCherry的表達情況

由于RBC的壽命和大小明顯超過其他藥物遞送載體[18]，近年來已有50多種抗感染藥物、抗炎癥藥物、抗腫瘤藥物、解毒作用的酶甚至遺傳物質(zhì)，或采取藥物誘導的細胞內(nèi)吞作用、電穿孔、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）和低滲透壓的方法把藥物在體外封裝到RBC內(nèi)[18]，或通過生物素-親和素結(jié)合的方法把藥物與RBC表面偶聯(lián)的方式進入了臨床研究[19]。近年來，采用基因修飾的方法使攜帶目的基因的造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）在向終端分化成為紅細胞的過程中表達而發(fā)揮治療作用的方案，已在B型血友病研究中展開[20]。我們擬借鑒此系統(tǒng)，利用基因修飾后表達L-ASNase的紅細胞開展惡性血液病的治療研究。

圖5 流式細胞儀監(jiān)測MEL細胞誘導分化期間報告基因mCherry的表達

圖6 重組慢病毒感染MEL細胞表達產(chǎn)物的免疫印跡分析

熒光顯微觀察結(jié)果提示，通過2A聯(lián)體技術(shù)連接的L-ASNase和mCherry在細胞的不同區(qū)域表達，即mCherry不會干擾L-ASNase行使功能。流式細胞術(shù)和多重TaqMan PCR法結(jié)果顯示，用50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU可以有效富集重組慢病毒感染的陽性細胞。由于血紅蛋白是由α-珠蛋白、β-珠蛋白和血紅素組成的結(jié)合蛋白，紅細胞組織特異性慢病毒載體使用的是β-珠蛋白基因調(diào)控序列，可以預計當感染該重組慢病毒的MEL細胞經(jīng)誘導向紅系終端分化的過程中，隨著血紅蛋白表達的增高，紅細胞組織特異性重組慢病毒攜帶的目的基因及報告基因的表達也將增高。非組織特異性慢病毒載體使用的是非組織特異性的sEF1α啟動子，可以預計當感染該重組慢病毒的MEL細胞向紅系終端分化過程中，目的基因的表達會隨著血紅蛋白表達的增加而逐漸受到抑制。結(jié)果顯示，分別用紅細胞組織特異性重組慢病毒RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）、非組織特異性重組慢病毒 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry和 RRL-sEF1α-2A-mCherry感染MEL細胞，經(jīng)化療藥物BG/BCNU選擇和HMBA誘導紅細胞分化后，紅細胞組織特異性重組慢病毒表達報告基因mCherry的陽性MEL細胞百分率隨誘導時間的延長而增多，非組織特異性的則相反，與預計吻合。提示本研究建立的紅細胞組織特異性重組慢病毒更適合于基因修飾紅細胞開展惡性血液病的治療。Western印跡結(jié)果顯示L-ASNase和mCherry表達時在2A處發(fā)生了自裂解，所得表達產(chǎn)物與預計相符；與梯度稀釋的標準品L-ASNase的灰度值相比較，在60 μg/孔總蛋白上樣量中，計算出 L-ASNase量為 0.0179 U，即約為 0.3 U/mg總蛋白。參考非基因修飾方法將L-ASNase封裝進RBC，給荷L5178Y淋巴瘤動物模型一次輸注8 U[5]，本項目預計需要制備大量攜帶L-ASNase的基因修飾紅細胞才可能達到體內(nèi)治療效應。盡管MEL細胞模型比較經(jīng)濟，然而MEL細胞可使小鼠發(fā)生類似于紅白血病的病征，輸注由其衍生的紅細胞風險較大，因此仍須選擇造血干細胞進行基因修飾，我們還將繼續(xù)探索。

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