白樺丹醌通過抑制PC9細(xì)胞遷移及PC9誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成阻止肺癌骨轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

儲(chǔ)建軍　丁建東

【摘要】 目的：研究白樺丹醌在抗人類肺腺癌細(xì)胞系PC9骨轉(zhuǎn)移中的作用。 方法：采用左心室注射穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶的PC9細(xì)胞構(gòu)建肺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，研究白樺丹醌對(duì)PC9骨轉(zhuǎn)移的抑制作用；采用SRB研究白樺丹醌對(duì)PC9的毒性作用，采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)PC9體外遷移的抑制作用；采用PC9與Raw264.7共培養(yǎng)構(gòu)建肺癌誘導(dǎo)破骨形成并用白樺丹醌處理，研究白樺丹醌對(duì)PC9誘導(dǎo)形成破骨細(xì)的抑制作用。結(jié)果：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，心室注射PC9細(xì)胞40 d后，對(duì)照組5只裸鼠均出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移，而用藥組雖然也出現(xiàn)4只裸鼠轉(zhuǎn)移，但用藥組轉(zhuǎn)移灶的光子值（2 759 200±2 670 290）顯著小于對(duì)照組（8 732 800±6 191 628）（P<0.05）。SRB顯示2 μM白樺丹醌對(duì)PC9無(wú)明顯殺傷作用，但可顯著抑制PC9的遷移能力及顯著抑制PC9誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：白樺丹醌可通過抑制PC9遷移及抑制PC9誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的方式抑制PC9骨轉(zhuǎn)移，顯示其作為抗肺癌骨轉(zhuǎn)移藥物的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】 肺腺癌； 白樺丹醌； 破骨細(xì)胞； 遷移； 骨轉(zhuǎn)移

肺癌是目前全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一。美國(guó)每年大約170 000人死于肺癌，占整個(gè)癌癥死亡總數(shù)的30%[1]。與其他惡性腫瘤一樣，肺癌的轉(zhuǎn)移是造成治療失敗和患者死亡的首要原因[2]。骨是肺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位之一，約30%～40%的進(jìn)展期肺癌出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[3]，其中大部分為溶骨性轉(zhuǎn)移。盡管近年來對(duì)于癌癥骨轉(zhuǎn)移的治療取得了一定的進(jìn)步，但肺癌骨轉(zhuǎn)移的中位生存期仍徘徊在半年左右，成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的一大難題。研制安全高效的癌癥骨轉(zhuǎn)移抑制劑是癌癥治療領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

最近的研究表明，白樺丹醌（Plumbagin）對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移及大細(xì)胞肺癌的化療具有一定的作用[4-5]，但目前還沒有白樺丹醌用于肺腺癌骨轉(zhuǎn)移研究的相關(guān)報(bào)道。Li等[4]的研究表明，白樺丹醌在不明顯影響Raw264.7增殖的濃度下可有效抑制破骨細(xì)胞的形成和活性。鑒于此研究基礎(chǔ)，筆者進(jìn)一步研究白樺丹醌對(duì)于肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光素酶（luciferase）標(biāo)記的人肺腺癌細(xì)胞系PC9及小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7由華東師范大學(xué)—長(zhǎng)征醫(yī)院骨腫瘤聯(lián)合研究中心惠贈(zèng)；白樺丹醌粉末、熒光素酶底物（D-luciferin）購(gòu)自于美國(guó)sigma公司；培養(yǎng)皿購(gòu)自丹麥Corning公司；Trap染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)sigma公司，重組鼠RANKL、M-CSF購(gòu)自美國(guó)R&D公司；磺酰羅丹明B（suHbrhodamine B，SRB）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640及α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Boyden小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SRB檢測(cè)白樺丹醌對(duì)PC9的毒性作用 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種到96孔板，在37 ℃，5% CO2，95% 濕度的條件下培養(yǎng)，使其貼壁。24 h后更換含有不同濃度白樺丹醌的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48 h后加入25 μL/孔的50%三氯醋酸溶液，4 ℃固定1 h；沖洗5遍，室溫晾干；加入SRB染液，室溫染色10 min。倒掉SRB染液，用1%冰乙酸洗5遍，室溫晾干；再加入100 μL/孔10 mM 的Tris堿液，酶標(biāo)儀讀取OD515（optical density，OD）值。

1.2.2 遷移實(shí)驗(yàn) 將腫瘤細(xì)胞重懸于無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度調(diào)整為5萬(wàn)/200 μL， 取200 μL接種于穿梭小室的上層，在下面的小室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基600 μL。36 h后使用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)遷移的腫瘤細(xì)胞。

1.2.3 肺腺癌細(xì)胞PC9誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn) 將PC9與Raw264.7按照1：10的比例混合接種于48孔板（細(xì)胞總數(shù)為0.3×104），待細(xì)胞貼壁后更換含不同濃度白樺丹醌的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基添加M-CSF及 RANKL各10 ng/mL，每3天換液。3～5 d后，經(jīng)多聚甲醛固定及Trap染色，統(tǒng)計(jì)破骨細(xì)胞數(shù)目。Trap染色按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 肺腺癌PC9骨轉(zhuǎn)移的檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9細(xì)胞消化、重懸于PBS，密度調(diào)整為1×105/100 μL。通過左心室注射將細(xì)胞接種于4～5周的裸鼠體內(nèi)（購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。小鼠隨機(jī)分為DMSO組和白樺丹醌組（3 mg/kg體重），每組5只，每2天腹腔給藥一次。 30 d后檢測(cè)IVIS活體成像信號(hào)及光子值（美國(guó)Caliper Life Sciences公司），并經(jīng)X線成像儀檢測(cè)骨破壞程度（美國(guó)Kodak公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 白樺丹醌對(duì)PC9骨轉(zhuǎn)移的抑制作用 參照Li等[4]的研究結(jié)果，本研究實(shí)驗(yàn)組小鼠給予3 mg/kg白樺丹醌，每2天給藥1次。30 d后開始拍攝IVIS活體成像跟蹤監(jiān)測(cè)小鼠的骨轉(zhuǎn)移情況并用X線成像儀進(jìn)行確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)白樺丹醌可明顯抑制PC9骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生（圖1）：至左心室注射PC9細(xì)胞后的40 d，對(duì)照組（control）均出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移；而白樺丹醌組（PL）只有4只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，且熒光信號(hào)

（2 759 200±2 670 290）明顯弱于對(duì)照組（8 732 800±6 191 628）（圖1A上、圖1B）；經(jīng)X線確認(rèn)，對(duì)照組小鼠脛骨發(fā)生明顯的溶骨性缺損，而白樺丹醌組的變化不明顯或者明顯弱于對(duì)照組（圖1A下）。以上結(jié)果表明，白樺丹醌可有效抑制PC9的骨轉(zhuǎn)移。大量研究表明，抑制癌細(xì)胞遷移及癌細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞形成和活性可有效治療癌癥骨轉(zhuǎn)移[6-9]，因此，筆者進(jìn)一步研究白樺丹醌抑制PC9骨轉(zhuǎn)移的作用是否也與此兩種方式有關(guān)。endprint

2.2 白樺丹醌對(duì)PC9誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞的抑制作用 為了研究白樺丹醌抑制PC9骨轉(zhuǎn)移是否與抑制肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成有關(guān)，筆者采用PC9與raw264.7細(xì)胞的共培養(yǎng)體系進(jìn)行驗(yàn)證。將PC9與Raw264.7按1：10的比例進(jìn)行接種，同時(shí)添加10 ng RankL、可明顯誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞（圖2A左），而Raw264.7單獨(dú)培養(yǎng)添加10 ng Rankl時(shí)無(wú)明顯破骨細(xì)胞形成。在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步研究白樺丹醌對(duì)PC9誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞的抑制作用，Li等的研究已經(jīng)證明2 μM白樺丹醌對(duì)Raw264.7的增殖無(wú)明顯影響，但明顯抑制破骨細(xì)胞的形成及活性[4]。因此，筆者也檢測(cè)2 μM白樺丹醌對(duì)PC9誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的影響。研究也發(fā)現(xiàn)，2 μM白樺丹醌可明顯抑制PC9誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成（圖2右、圖2B）。

2.3 白樺丹醌對(duì)PC9遷移能力的抑 制作用 為了進(jìn)一步研究白樺丹醌抑制PC9骨轉(zhuǎn)移是否與抑制肺癌細(xì)胞的遷移有關(guān)，筆者采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，白樺丹醌2 uM時(shí)可顯著抑制PC9的體外遷移能力（圖3）。

2.4 白樺丹醌對(duì)PC9細(xì)胞的毒性作用 為了排除白樺丹醌對(duì)PC9骨轉(zhuǎn)移的抑制作用是由白樺丹醌的毒性作用造成，筆者進(jìn)一步研究2 μM白樺丹醌對(duì)PC9增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，2 μM白樺丹醌對(duì)PC9無(wú)明顯殺傷作用（圖4），當(dāng)2 μM白樺丹醌作用于PC9時(shí)約90%的腫瘤細(xì)胞存活。以上實(shí)驗(yàn)說明，2 μM白樺丹醌對(duì)PC9及Raw264.7均無(wú)明顯的毒性作用，白樺丹醌對(duì)PC9遷移及其誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞的抑制不是主要通過抑制PC9增殖所引起。

3 討論

骨是肺癌最為常見的轉(zhuǎn)移部位之一，肺癌一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，常導(dǎo)致骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、脊髓壓迫甚至癱瘓等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及生存期，加速患者的死亡進(jìn)程，給患者及其家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[10-11] 。但是目前對(duì)于癌癥骨轉(zhuǎn)移的治療方案有限，主要為雙磷酸鹽和針對(duì)RankL的單克隆抗體德尼單抗（Denosumab），其中德尼單抗過于昂貴；而雙磷酸鹽雖然對(duì)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收有一定效果，但是對(duì)癌癥治療的作用存在較大爭(zhēng)議。鑒于此，美國(guó)腫瘤臨床學(xué)會(huì)對(duì)于尚未發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的癌癥患者不推薦使用雙磷酸鹽進(jìn)行治療[12]。因此，若能開發(fā)一種既能抗肺癌遷移又能抑制肺癌在骨中生長(zhǎng)侵襲的藥物，將大大提高肺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防及治療效果。

白樺丹醌，是維生素K3的類似物，是白花丹（（Plumbago zeylanica）根的提取物。白花丹已經(jīng)在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中安全使用了幾個(gè)世紀(jì)，用于治療多種疾病，包括微生物感染和過敏反應(yīng)等。大量研究表明，白樺丹醌有顯著的抗腫瘤作用，包括促進(jìn)腫瘤相關(guān)的凋亡、侵襲、血管新生等[13-17]。最近的研究表明，白樺丹醌可有效抑制破骨細(xì)胞的形成及抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移[4]，而在肺癌骨轉(zhuǎn)移領(lǐng)域還未見報(bào)道。本研究采用白樺丹醌處理人肺腺癌細(xì)胞系PC9及其骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，觀察其對(duì)肺癌骨轉(zhuǎn)移的影響，并研究其作用機(jī)制，為將其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Li等[4]的研究顯示，2 μM的白樺丹醌可明顯抑制破骨細(xì)胞的形成及骨吸收能力，而對(duì)腫瘤細(xì)胞及raw264.7細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)，2 μM的白樺丹醌對(duì)PC9細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用。而此濃度可有效地抑制PC9的遷移及抑制PC9與raw264.7共培養(yǎng)形成的破骨細(xì)胞形成；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示白樺丹醌可有效抑制PC9骨轉(zhuǎn)移。

綜上所述，白樺丹醌可通過抑制肺腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞及抑制肺癌的遷移兩種方式阻止肺癌骨轉(zhuǎn)移，筆者將進(jìn)一步研究其具體的分子機(jī)制。

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（收稿日期：2014-01-02） （本文編輯：陳丹云）endprint

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