農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉醇ELISA檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用

王東　王剛　饒力群

摘要 [目的]建立快速、有效檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉醇（ZER）殘留量的方法。[方法]試驗(yàn)以人工合成的ZER為包被原，ZER為競(jìng)爭(zhēng)半抗原，兩者與一定量的抗玉米赤霉醇單克隆抗體反應(yīng)，應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法建立玉米赤霉醇單克隆抗體快速檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中ZER含量的半定量檢測(cè)，同時(shí)對(duì)該ELISA試劑盒進(jìn)行了調(diào)試。[結(jié)果]試驗(yàn)建立檢測(cè)ZER的ELISA方法，其最適包被濃度為1∶5 000，抗體最適工作濃度為1∶2 500，酶標(biāo)二抗的最適工作濃度為1∶5 000。試劑盒檢測(cè)限為0.5 ng/ml，添加回收率在70.0%～116.0%，變異系數(shù)小于20%，在2～8 ℃條件下可保存90 d。[結(jié)論]該試驗(yàn)建立的方法可應(yīng)用于玉米、小麥、高粱等中的玉米赤霉醇的檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。

關(guān)鍵詞 玉米赤霉醇；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)；檢測(cè)限；ELISA

中圖分類號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06764-03

Development and Application of Zeranol and ELISA Kit in Agricultural Products

WANG Dong et al

（College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

Abstract [Objective] To establish a method for rapidly and effectively detecting ZER in agricultural products. [Method] With ZER package as original， ZER as hapten for competition， both with a certain amount of resistance to zeranol monoclonal antibody response. The indirect competitive ELISA method was used to establish the zeranol monoclonal antibody rapid detection ZER content in the semiquantitative detection of agricultural products. At the same time the ELISA kit was tested. [Result] ELASA method was established to detect ZER， the optimal concentration of package， IgGHRP are 1∶5 000，the optimal concentration of antibody is 1∶2 500. The detection limit of kit is 0.5 ng/ml， adding recovery rate 70.0%-116.0%， variation coefficient is less than 20%， which can be stored for 3 months under 2-8 ℃. [Conclusion] The method can be used in detection of ZER in maize， wheat， sorghum with broad prospect.

Key words Zeranol； Monoclonal antibody； Indirect competition； Detection limit； ELISA

玉米赤霉醇（ZER）屬雌性激素[1]，具有維持副性征和代蛋白同化效應(yīng)，除用于一般治療用途外，還作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑應(yīng)用于反芻動(dòng)物（尤其是牛羊）[2]。20世紀(jì)90年代末，人們發(fā)現(xiàn)食用含有玉米赤霉醇?xì)埩舻霓r(nóng)產(chǎn)品會(huì)引起人體性機(jī)能紊亂，影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘導(dǎo)下還可能致癌。其次，ZER排出動(dòng)物體外后，還可經(jīng)飲水和食物造成二次污染。1998年，歐盟禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告明確規(guī)定玉米赤霉醇禁用于所有食品，判定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為2 ng/ml[3]。目前國(guó)際上農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉醇?xì)埩魴z測(cè)方法[4]主要有液-質(zhì)聯(lián)用法和氣-質(zhì)聯(lián)用法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。此類儀器檢測(cè)方法，準(zhǔn)確度高，精密度好，可作為藥殘檢測(cè)的最終確證，但其樣本前處理復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要昂貴的儀器設(shè)備，且對(duì)試驗(yàn)操作人員要求高。同酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA）比較，后者具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、儀器化程度低和樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)試驗(yàn)人員要求也相對(duì)容易掌握等優(yōu)點(diǎn)，特別適于殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大樣本篩查，故建立一種準(zhǔn)確、快速的ELISA檢測(cè)方法極為重要。筆者開(kāi)發(fā)的玉米赤霉醇ELISA檢測(cè)試劑盒可應(yīng)用玉米、小麥、高粱以及飼料等中的玉米赤霉醇的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

包被原：玉米赤霉醇與卵清蛋白偶聯(lián)的抗原。

抗體：玉米赤霉醇與蛋白質(zhì)偶聯(lián)抗原的單抗。

稀釋液：抗原稀釋液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液；

抗體稀釋液為0.05 mol/L含有0.05 ml牛血清白蛋白、保護(hù)劑的磷酸鹽緩沖液；

封閉液為含有0.5%酪蛋白、1%小牛血清、5‰防腐劑（疊氮鈉）的磷酸鹽緩沖液；

酶標(biāo)記物稀釋液為含有5%小牛血清和保護(hù)劑的緩沖液。

酶標(biāo)二抗：羊抗鼠抗抗體，杭州隆基生物技術(shù)有限公司。

底物顯色液：2 mol/L四甲基聯(lián)苯胺和4 mol/L過(guò)氧化氫。

終止液：2 mol/L濃硫酸。

空白牛尿樣本來(lái)源于湖南省飼料監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 反應(yīng)原理。

該試驗(yàn)采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物玉米赤霉醇與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗玉米赤霉醇的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含玉米赤霉醇的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出殘留物玉米赤霉醇的含量[5]。

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)歷程為：1包被過(guò)程→2包被原與抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體→3酶與結(jié)合在微孔上的抗體結(jié)合→4酶催化底物顯色（圖1）。

1.2.2 試驗(yàn)條件體系建立。

在文獻(xiàn)[6]的基礎(chǔ)上，利用棋盤法測(cè)定包被原、稀釋液等。在文獻(xiàn)[7-9]的基礎(chǔ)上，確定試驗(yàn)條件、試劑盒的靈敏度和準(zhǔn)確度的驗(yàn)證、試劑盒的保存等試驗(yàn)。試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[7]，如圖2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適包被液濃度分析

由表1可見(jiàn)，隨著包被原濃度的降低，IC50的變化幅度不大，但最大吸光值降低。1∶20 000稀釋時(shí)最大吸光值較低。當(dāng)做1∶5 000稀釋（濃度為0.2 ng/ml）的包被原IC50和吸光值均較好（根據(jù)朗伯-比爾定律以及試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)得出：最大吸光值理想范圍為1.500～2.000）。

2.2 單抗稀釋液的選擇

試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），選擇最大吸光值較大，IC50較低，添加回收率較高的較符合的單抗稀釋液作為試劑盒的單抗稀釋液，故選擇單抗稀釋液D。

2.3 包被條件的確定

試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），選擇最大吸光值較大，IC50較低，空白本底較低，添加回收率較高的包被條件作為試劑盒的包被條件，4 ℃過(guò)夜雖IC50較低，但最大吸光值和添加回收率也相應(yīng)降低，說(shuō)明包被原未能很好地吸附于酶標(biāo)板上；37 ℃溫育1 h，再4 ℃過(guò)夜與37 ℃溫育2 h，再4 ℃過(guò)夜差異不顯著，從節(jié)省時(shí)間考慮，故選擇37 ℃溫育1 h，再4 ℃過(guò)夜（表3）。

2.4 封閉時(shí)間的確定

試驗(yàn)結(jié)果顯示（表4），選擇最大吸光值較大，IC50較低，空白本底較低，添加回收率較高的封閉條件作為試劑盒的封閉條件，封閉30 min雖空白本底較低，但I(xiàn)C50升高，可見(jiàn)非特異性反應(yīng)增加；封閉60 min與封閉120 min差異不顯著，從節(jié)省時(shí)間考慮，故選擇封閉60 min。

2.5 試劑盒靈敏度分析

評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)反應(yīng)靈敏度的方法，常用的有IC50抑制濃度（指零標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的50%處所對(duì)應(yīng)的藥物濃度）和最低檢測(cè)限，兩者值越低說(shuō)明試劑盒的靈敏度越高。最低檢測(cè)限的定義有多種，一般規(guī)定20份空白樣品或零標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為試劑盒的最低檢測(cè)限。最低檢測(cè)限與樣品的種類、采樣地區(qū)和樣品的前處理方法等密切相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)檢測(cè)方法靈敏度的指標(biāo)，但不宜作為檢驗(yàn)試劑盒靈敏度的指標(biāo)，而IC50不受樣本影響，其值相對(duì)恒定，常用作評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒靈敏度的指標(biāo)。

IC50值與抗體和酶結(jié)合物的質(zhì)量及檢測(cè)方法有關(guān)，分別測(cè)定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50抑制濃度（表5），玉米赤霉醇通過(guò)20次空白樣本（空白樣本來(lái)自獸藥監(jiān)察所，已用液質(zhì)聯(lián)用儀器檢測(cè)確定）。

2.6 試劑盒特異性分析

表6結(jié)果表明，玉米赤霉醇單抗與β玉米赤霉醇、α玉米赤霉烯醇、β玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的交叉反應(yīng)率分別為100.0%、36.25%、52.73%、0.67%、74.36%、53.70%；與己烯雌酚、雌二醇、睪酮、克倫特羅的交叉反應(yīng)率均小于0.1%。ZER單抗與其結(jié)構(gòu)相似的同系物有一定的交叉反應(yīng)，但與功能相似的激素類藥物無(wú)交叉反應(yīng)。

2.7 試劑盒準(zhǔn)確度分析

由表7可見(jiàn)，以10、21、35 ng/ml 3個(gè)濃度添加空白牛尿中，測(cè)得回收率在59.5%～111.6%，變異系數(shù)在6.4%～17.5%，符合準(zhǔn)確度的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

2.8 試劑盒保存試驗(yàn)分析

同一批次試劑盒在37 ℃條件下保存時(shí)間0、1、3 d的變化，以及在2～8 ℃保存時(shí)間0、14、30、90、180 d的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

3 討論

在此次試驗(yàn)研究過(guò)程中，反應(yīng)體系中的有機(jī)溶劑、反應(yīng)環(huán)境pH及離子強(qiáng)度、反應(yīng)溫度等的影響，集中表現(xiàn)在對(duì)各種

工作液的篩選工作上，試驗(yàn)研究工作主要對(duì)最適包被濃度的

確定、稀釋液對(duì)單抗和酶標(biāo)二抗稀釋的倍數(shù)確定、樣品溶液與單抗溶液體積比例的確定、封閉液的確定等工作，為后期體系的建立提供必要的試驗(yàn)要素。試驗(yàn)研究對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)物的量進(jìn)行了篩選，為了達(dá)到ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒最終快速，在保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性前提下，最終確定了單抗反應(yīng)時(shí)間和酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間均為1 h；單抗與標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的體積比為50 μl∶50 μl。

添加溶液比例、包被原、單抗、酶的濃度以及包被液和封閉液的選擇直接影響試劑盒的IC50、靈敏度和精確度。在綜合考慮原材料的用量試驗(yàn)效果以及對(duì)原料的合理應(yīng)用條件下，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)對(duì)照，包被原選擇1∶5 000，單抗選擇1∶2 500稀釋，酶選用1∶5 000稀釋，一般濃度提高IC50提高、靈敏度降低。試驗(yàn)操作反應(yīng)的適宜溫度以及時(shí)間與試驗(yàn)結(jié)果的最佳值密切相關(guān)，如反應(yīng)溫度偏低，反應(yīng)時(shí)間偏少，試劑盒處于極端條件下（如放在貼著冰箱壁，試劑凍傷）等都會(huì)造成試驗(yàn)的OD值偏低，繼而影響試驗(yàn)數(shù)值的準(zhǔn)確性，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)對(duì)比驗(yàn)證確定：?jiǎn)慰狗磻?yīng)時(shí)間為60 min，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間為60 min，底物顯色條件37 ℃顯色10 min以及試劑盒的保存試劑盒在2～8 ℃條件下可保存90 d。

該試劑盒檢測(cè)限為0.5 ng/ml，添加回收率在70.0%～116.0%，變異系數(shù)小于20%，在2～8 ℃條件下可保存90 d。整個(gè)體系反應(yīng)時(shí)間為130 min，比儀器方法（氣相、液相方法等）節(jié)省很多時(shí)間，玉米赤霉醇ELISA快速檢測(cè)方案試驗(yàn)體系建立成功，達(dá)到了檢測(cè)體系快速、定性半定量的目的并具有很廣泛的前景。

參考文獻(xiàn)

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