鴨源致病性大腸桿菌的分離與藥敏試驗

季崢嶸

摘要：對安徽省鴨場病死鴨的腦、肝臟、和脾臟和心臟進行分離培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色、生化試驗、菌落研究，初步鑒定為大腸桿菌。在致病性試驗中，以3.0×108 CFU/mL劑量感染健康昆明小鼠，小白鼠在8～24 h內(nèi)全部死亡。藥物敏感試驗結果顯示該鴨分離的菌株對鏈霉素、氯霉素、磺胺異惡唑、青霉素、紅霉素、呋喃妥因、四環(huán)素、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林、恩諾沙星、氟苯尼考和強力霉素已經(jīng)產(chǎn)生了很強的耐藥性,為提高臨床合理用藥提供科學依據(jù)。

關鍵詞：鴨大腸桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

Abstract:Duck duck farming in Hubei province died of brain, liver, and spleen and heart were isolated and cultured by Gram staining, biochemical testing, colonies of initially identified as E. coli. In pathogenicity tests to infect healthy dose of 3.0 × 108 CFU/mL mouse, mice in all died within 8～24 h. Drug sensitivity tests revealed that the duck isolates to streptomycin, chloramphenicol, sulfonamides isoxazole, penicillin, erythromycin, nitrofurantoin, tetracycline, amikacin, gentamicin, kanamycin, A amoxicillin, enrofloxacin, florfenicol and doxycycline have produced a very strong resistance, to improve the scientific basis for rational clinical use of the drug.

Key words: duck E.coli; isolation; susceptibility test

近年來，隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，家禽飼養(yǎng)密度不斷增加，集約化程度不斷提高，引種、異地販運日益頻繁，大腸桿菌的交叉污染，給養(yǎng)禽業(yè)帶了了嚴重的經(jīng)濟損失，是禽病調(diào)查中最常見報道的疾病及胴體廢棄的主要原因。只有在研究清楚該菌的特征后才能更好的對癥治療和防治此病,對發(fā)病的鴨子進行用藥，先通過藥敏試驗，選擇合理的藥物進行治療，交叉用藥(以防耐藥)，降低經(jīng)濟損失。運用科學的診斷方法科學的管理手段，降低飼養(yǎng)成本，了解其特征，對癥治療，有效保障鴨殖業(yè)健康的發(fā)展，促進農(nóng)民增收。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1病料及主要試劑[1]

病料，安徽某鴨場病死亡鴨肝臟、心臟和腦；小白鼠，購自湖北省實驗動物研究中心；麥康凱瓊脂，普通肉湯自配，TSA（Tryptic Soy Agar）胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基購自BD公司；生化試驗微量發(fā)酵管和藥敏試紙均購于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.2儀器設備

電熱恒溫鼓風干燥箱、培養(yǎng)箱、電子天平、滅菌鍋、冷藏冰箱、超凈工作臺、生物顯微鏡。

1.2方法

1.2.1 制作培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基[2]、普通肉湯培養(yǎng)基[2]、TSA培養(yǎng)基[3]。

1.2.2分離病原菌

無菌取病死鴨腦、肝臟和心臟組織，直接劃線接種于麥康凱和TSA平板，37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結果。

1.2.3革蘭氏染色

先用滅種環(huán)取少量生理鹽水滴在玻片中央，然后再用接種環(huán)取少量病原菌，在液滴種混合，均勻涂抹成薄層，并讓其自然干燥。將干燥好的涂菌面朝上，使其背面在酒精燈的火上來回烤幾次，以達到殺菌固定的目的。

染色步驟如下：

（1）草酸銨結晶紫染色液，初染1 min，水洗，甩干；

（2）加革蘭碘液頁抹片上，媒染1 min，水洗，甩干；

（3）95%酒精于抹片上脫色5～10 s，水洗，甩干；

（4）沙黃溶液復染1 min，水洗 ，吸干。

用普通顯微鏡觀察，接通電源，先用高倍鏡觀察找到細菌的區(qū)域，然后在玻片上滴一滴香柏油，轉至油鏡進行觀察。觀察完后用二甲苯洗鏡頭，擦拭干凈，拔掉插頭，罩上防塵罩。

1.2.4純化病原菌

從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上挑選紅色、圓形凸起、表面光滑的單個菌落劃線于新的麥康凱瓊脂平板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結果再次染色、鏡檢。若菌體形態(tài)和染色形態(tài)符合大腸桿菌的形態(tài)和染色特征時，挑選剩余半個菌落接種麥康凱斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，然后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 生化試驗

將菌株接種液體培養(yǎng)基，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后用接種針接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、木糖、棉子糖、肌醇、亞硝酸鹽、水楊素、衛(wèi)矛醇、側金盞花醇、阿拉伯糖、蛋白胨、硫化氫、鼠李糖和尿素微量發(fā)酵管，放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后生化反應結果。

1.2.6藥敏試驗

以1999年美國臨床實驗室標準華委員會（NCCLS）下設的紙片擴散法敏感試驗分委員會推薦的標準方法，Kirby-Bauer（K-B）方法進行。將菌株接種到液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，在無菌操作臺里，用滅菌生理鹽水稀釋至其濁度相當于0.5號麥氏標準，即肉湯中細菌數(shù)約為1×108 CFU/mL。用無菌棉簽吸取調(diào)好濃度的菌液,在營養(yǎng)瓊脂平板表面均勻涂 ,在瓊脂平板上貼加抗菌藥紙片：用滅菌尖頭鑷子夾取鏈霉素、氯霉素、磺胺異惡唑、青霉素、紅霉素、呋喃妥因、四環(huán)素、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林、恩諾沙星、頭孢膚肟、氟苯尼考、強力霉素多粘菌素B和環(huán)丙沙星的抗菌藥藥敏試紙片，按一定的密度分別貼在上述已涂滿細菌的平板表面，用鑷子輕壓，確保藥敏試紙與瓊脂面充分接觸。紙片貼完15 min，后將平板翻轉過來，放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取出觀察[4]。

1.2.7 致病性試驗

小白鼠致病性實驗：取已經(jīng)分離純化的病原菌用接種環(huán)接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h，用滅菌生理鹽水稀釋其濃度為1.5號麥氏標準，即肉湯中細菌數(shù)約為3×108 CFU/mL，用1 mL的注射器對18～25 g小白鼠進行腹腔接種，0.3 mL/只，接種8只；對參照組經(jīng)相同途徑接種0.3 mL的滅菌生理鹽水，接種2只。接種后飼養(yǎng)觀察，記錄小白鼠死亡時間并從死亡小白鼠的肝臟、心臟分離致病菌[5]。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及剖解特征

自然感染鴨大腸桿菌的病鴨表現(xiàn)為:精神沉郁，喜臥，不愿走動, 食欲下降, 排黃綠色糞便。剖檢可見纖維性心包炎、肝炎、氣囊炎、腦炎特征。腹膜炎嚴重，卵巢上卵泡變性，輸卵管粘膜出血，水腫平伴有干酪樣凝乳塊沉積。圖1 為自然感染鴨大腸桿菌病鴨的解剖照片，圖中可見典型的纖維素性肝周炎、心包炎、氣囊炎病理變化[6]。

2.2 致病菌的特征

經(jīng)培養(yǎng)需分離的病原菌在麥康凱瓊脂平板上形成圓形、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大菌落, 菌落邊緣整齊, 打開后具有特殊的糞便樣臭味，稍有凸起，表面光滑濕潤，直徑1.5～2 mm，呈紅色或粉紅色；在普通瓊脂斜面上為灰白色菌落；在普通肉湯中呈均勻混濁, 管底有灰白色沉淀,輕搖試管, 沉淀緩緩上升；在TSA培養(yǎng)基上形成圓形、光滑濕潤、邊緣整齊的白色菌落[7]。經(jīng)革蘭氏染色觀察到細菌呈桿狀，兩端鈍圓，菌體為粉紅色，故此菌為革蘭氏陰性菌，符合大腸桿菌的形態(tài)和染色特征時。