動物組織內(nèi)殘留β2-受體激動劑的檢測方法研究進展

高照 張援 張亦農(nóng) 謝敏豪

1 廣東省體育科學(xué)研究所（廣州510663）

2 國家體育總局反興奮劑中心

3 北京體育大學(xué)

β2-腎上腺素受體激動劑，又稱為β2-興奮劑，是一類人工合成苯乙胺類藥物， 通常以鹽酸鹽等成鹽形式保存，常見的包括鹽酸克侖特羅、富馬酸福莫特羅、鹽酸馬布特羅、沙丁醇胺、萊克多巴胺等，其藥理作用主要為松弛支氣管平滑肌、提高骨骼肌收縮力、增加肺通氣量、增強支氣管纖毛運動[1]，臨床上常用于防治哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病， 同時也被世界反興奮劑機構(gòu)（WADA）列為禁止運動員使用的一種蛋白同化制劑[2]。 由于β2-受體激動劑具有促進動物肌肉組織增長、減少脂肪沉積、改善肉質(zhì)、提高飼料轉(zhuǎn)化率等作用[1-3]，從上世紀80 年代開始，其被作為飼料添加劑逐漸廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中。 其提高瘦肉率機理在于通過腎上腺受體刺激腺苷酸環(huán)化酶的合成，從而升高環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的濃度以增加激素敏感脂酶活性，加快脂肪分解；另外它還可降低血液中Mg2+濃度，間接促進肌肉興奮，抑制蛋白質(zhì)分解和脂肪合成，進而增加肌肉蛋白合成[3]。

鹽酸克侖特羅（Clenbuterol Hydrochloride），又名氨哮素、氨必妥，俗名“瘦肉精”，化學(xué)名為2-［（叔丁氨基）甲基］-4 氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，是使用最廣泛的人工合成的β2-受體激動劑之一?？诜藖鎏亓_后2～3 h，人體血液濃度達到峰值，半衰期為25～39 h，藥物清除時間約5～8 天（消除97%）。 將克侖特羅作為飼料添加劑， 其使用劑量往往高出治療量5～10 倍，且使用周期較長（3 周以上），在動物肌肉、肝、腎、毛發(fā)等組織中易發(fā)生蓄積，人食用攝入過量該藥的動物后易發(fā)生中毒，可能引發(fā)肌肉震顫、心悸、發(fā)燒及肌肉痛、目眩、嘔吐等較明顯的中毒癥狀。有研究表明， 長期攝入克侖特羅還可能導(dǎo)致染色體畸變進而誘發(fā)惡性腫瘤[4]。而且克侖特羅化學(xué)性質(zhì)極穩(wěn)定，日常烹飪過程如煮沸、燒烤和微波加熱均不能使其分解。鑒于其對食品安全的嚴重威脅，目前多數(shù)國家已經(jīng)禁止在畜牧養(yǎng)殖中使用β2-受體激動劑作為獸藥飼料添加劑， 我國農(nóng)業(yè)部也多次發(fā)布公告禁止將克侖特羅、 沙丁胺醇等β2-受體激動劑及鹽、酯等結(jié)合物用于所有食用動物中[5，6]。 然而克侖特羅等的非法使用現(xiàn)象仍然嚴重，如2007 年9 月，上海市336 人因食用了殘留有克侖特羅的豬肉發(fā)生集體中毒事件[7]；2009 年2 月，廣東省40 多人也因食用殘留克侖特羅的豬內(nèi)臟引起中毒[8]。

因此，建立動物組織中β2-受體激動劑快捷有效的定量確證方法， 對于保障我國動物源性食品的安全性，避免運動員食源性違禁藥物誤用有重要意義。

1 樣品的選擇及提取

除克侖特羅、溴布特羅等，常見的結(jié)構(gòu)中含有苯酚及間苯二酚的β2-受體激動劑如沙丁胺醇等在動物組織中主要以硫酸軛合物及葡萄糖苷酸軛合物等穩(wěn)定形式存在（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），而受軛合物提取回收率的影響，通常要先進行水解，使待測目標物呈游離態(tài)后進行提取和凈化。 測定動物體內(nèi)克侖特羅殘留的試樣基質(zhì)主要有肝臟、肌肉、尿液、血液、糞便、毛發(fā)、視網(wǎng)膜等。 Meyer 等[9]通過對牛喂養(yǎng)含量相當(dāng)于每公斤體重5μg 克侖特羅的飼料后發(fā)現(xiàn)， 首次劑量后2～9 h 血藥濃度才達到峰值（0.5 ng/ml），而連續(xù)食用21 天后血藥濃度達到1.1 ng/ml，血藥濃度的雙峰值現(xiàn)象表明克侖特羅在動物體內(nèi)隨時間積累。有研究表明在動物肝臟中克侖特羅平均濃度可達45 mg/kg，人食用100 g 被克侖特羅污染的動物肝臟即相當(dāng)于攝入一次克侖特羅治療劑量 （0.18 μg/kg）的10 倍以上[10]。 張建麗等[11]對肉食豬六個部位組織中克侖特羅殘留量進行定量分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其肝臟和腎臟克侖特羅含量明顯高于前腿、后腿、腹肉及里脊， 且豬肉組織中克侖特羅殘留量與其受試劑量及受試時間長短呈正相關(guān)。

圖1 β2-受體激動劑化學(xué)結(jié)構(gòu)式

由于分子結(jié)構(gòu)中均含有苯乙醇胺結(jié)構(gòu) （具體見表1），克侖特羅、沙丁胺醇等常見β2-受體激動劑均易溶于酸性溶液中， 而甲醇對于極性相差較大的不同藥物具有較好的溶解性， 所以通常采用甲醇及酸化甲醇水等溶液進行提取[12，13]。 尿液、血液等液體試樣通常先進行沉淀蛋白后離心，取上清液進行提取。對于肝臟、肌肉等固體試樣，具有代表性的方法為：首先將樣品組織用稀酸溶液及弱酸甲醇混合溶液勻漿提取，之后經(jīng)水浴超聲，調(diào)上清液pH 至堿性，進一步沉淀蛋白，經(jīng)高速離心，進行后續(xù)提取和凈化。Zhang[12]等對動物飼料中的β2-腎上腺素受體激動劑進行了固相萃取凈化和液質(zhì)聯(lián)用儀分析， 分別比較了5%鹽酸甲醇溶液、0.5%偏磷酸-甲醇溶液（1:4，v/v）、0.2 mol/L 磷酸-甲醇溶液（1:4，v/v），結(jié)果表明0.2 mol/L 磷酸-甲醇溶液（1:4，v/v）的提取效果最好，對沙丁胺醇、 萊克多巴胺和克侖特羅的平均回收率在83%～110%之間。

表1 β2-受體激動劑常見種類及結(jié)構(gòu)中的特征基團

2 樣品凈化方法

樣品的凈化和待測組分的有效富集直接影響到檢測方法的穩(wěn)定性和靈敏度， 目前食品中藥物測定除了傳統(tǒng)的液-液萃取方法外，還有近來發(fā)展的固相萃?。⊿PE）、分子印跡固相萃?。∕IPs）、免疫親和色譜技術(shù)（IAC）和凝膠滲透色譜（GPC）等一系列提取凈化方法[13]。

2.1 液-液萃取（liquid-liquid extraction）

液-液萃取是從生物樣品中溶解提取藥物的最基本方法， 鹽酸克侖特羅在酸性溶液中易溶于水和甲醇，而在堿性溶液中可溶于乙醚、乙酸乙酯等有機溶劑。 常用的萃取溶劑有：乙酸乙酯-異丙醇（9:1，v/v）、乙醚、二氯甲烷等[14]，但堿性條件下溶劑直接萃取，不僅使克侖特羅提取率較低，且專屬性差，基質(zhì)干擾較強。

2.2 固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）

固相萃取是當(dāng)前復(fù)雜基質(zhì)中痕量殘留檢測最為常用的一種樣品預(yù)處理凈化技術(shù)。 它是利用固體吸附劑，將樣品中目標化合物吸附，使其與樣品基質(zhì)及干擾化合物分離，再用洗脫液洗脫下來，從而達到分離和富集的目的。 固相萃取技術(shù)由于具有操作簡單快速、消耗有機溶劑少、樣品回收率高、易于自動化等優(yōu)點， 目前已在食品等復(fù)雜基體前處理中廣泛應(yīng)用[15，16]。 Spisso[17]等比較了豬尿中克侖特羅的兩種不同提取方法，樣品分別在弱酸性（pH≈6）條件下通過Bond Elut 混合型陽離子交換萃取柱（填料為辛基和丙苯磺酸基鍵合到硅膠基體），甲醇淋洗后用乙酸乙酯-氨水（97∶3，v/v）洗脫；樣品通過XAD-2 大孔樹脂柱凈化（填料為苯乙烯-二乙烯基苯共聚物），用甲醇洗脫并濃縮后復(fù)溶，再在堿性條件下（pH=10）經(jīng)乙醚提取測定， 結(jié)果表明用混合型陽離子交換萃取柱提取克侖特羅的平均回收率為85.9%， 檢出限為0.5 ng/ml，而XAD-2 大孔樹脂柱的提取平均回收率為78.4%，檢出限為20 ng/ml，且重現(xiàn)性較差，證實了混合型陽離子交換萃取柱對復(fù)雜基質(zhì)中β2-受體激動劑的檢測有良好的提取效率和專屬性。

2.3 基質(zhì)固相分散萃取 （matrix solid phase dispersion，MSPD） 和 分 子 印 跡 聚 合 物 萃 取 柱（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）

分子印跡聚合物的制備主要是通過模板分子（印跡分子）與聚合物單體鍵合，進而使聚合作用記錄聚合物中形成的與模板分子空間構(gòu)型相匹配的空穴，在用洗脫等方法除去聚合物中的模板分子后，聚合物中就留下了空間大小和構(gòu)型都與模板分子匹配的具有高度選擇識別性的空間， 從而能夠選擇性地識別模板分子或其類似物[18]。 Baker 等[19-21]首次將固相分散技術(shù)與反相鍵合填料吸附原理相結(jié)合， 建立基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)。 首先通過不規(guī)則形狀的硅藻土或者聚合物等固相吸附劑顆粒與樣品基質(zhì)進行研磨，分散制備樣品，再將制備的樣品填入層析柱后根據(jù)分離目標物的要求， 以特定比例的混合溶劑或者不同極性的溶劑分別對填充的樣品進行洗脫。 基質(zhì)固相分散提取過程將組織破解、 目標物提取和凈化在同一操作中完成，并避免了離心、沉淀、濃縮等環(huán)節(jié)造成的目標物損失，操作簡單快速，適用于固體樣品的處理， 目前在食品分析中得到越來越廣泛的應(yīng)用[22]。

2.4 免疫親和色譜法（immunoaffinity column，IAC）

免疫親和色譜（IAC）是基于色譜分離和抗原—抗體反應(yīng)特異性相結(jié)合原理[23]，對待測物進行凈化和濃縮的方法，目前已在食品藥品分析、免疫耗竭實驗及免疫色譜法分析等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 Wang[24]等通過耦合溴化氰活化瓊脂糖凝膠 （CNBr-activated Sepharose-4B）和辛酸-硫酸銨凈化后的沙丁胺醇多克隆抗體, 制備了一種可以從豬肉樣品中選擇性提取沙丁胺醇的免疫親和色譜柱， 其偶聯(lián)率和動態(tài)柱容量分別為98.6%和400 ng/ml IAC 凝膠。 通過空白豬肉樣品添加沙丁胺醇， 分別制備2 ng/g、10 ng/g、20 ng/g 和50 ng/g 濃度水平的基質(zhì)加標樣品。 經(jīng)液相色譜儀檢測，各濃度樣品回收率均在83.3%～92.2%之間，相對標準偏差范圍為2.8%～7.0%（n = 5）；方法的檢出限和定量限分別為0.25 ng/g 和0.5 ng/g。 Wang等[25]通過免疫親和色譜與氣相色譜-質(zhì)譜建立了豬肝臟組織及尿液中萊克多巴胺殘留的檢測方法。 首先通過萊克多巴胺與戊二酸酸酐耦合制成半抗體，再采用混合酸酐法將半抗體與牛血清蛋白（BSA）及雞卵清蛋白（OVA）共價偶聯(lián)，分別合成免疫抗原和包被抗原[26]；將抗原以弗氏完全佐劑注射入8 周齡的Balb/c 鼠背部（100 μg/kg 體重），兩周后再以弗氏不完全佐劑進行4 次皮下注射（每次間隔2 周），期間分別收集小鼠血漿進行血清抗體滴度監(jiān)測。 免疫注射結(jié)束后切除脾臟并將脾細胞和SP2/O 骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞制備單克隆抗體，再經(jīng)過溴化氰活化瓊脂糖凝膠耦合制備免疫親和柱。 結(jié)果通過氣質(zhì)聯(lián)用測定方法的檢出限為0.5 ng/g，定量限為2.0 ng/g；空白尿液/肝臟樣品添加濃度在2.5～20 ng/ml（ng/g）的范圍內(nèi)，回收率分別在76.2%～83.1% 和68.2%～78.6%之間。

2.5 凝膠滲透色譜萃取 （gel permeation chromatography，GPC）

凝膠滲透色譜是基于體積排阻的原理進行分離，利用樣品中物質(zhì)分子大小的不同，以及在凝膠中滯留時間的不同實現(xiàn)分離，能有效去除油脂、天然色素等高分子質(zhì)量的干擾。由于其具有步驟簡單、操作方便、回收率較高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留分析[27]。 盧劍等[28]通過凝膠凈化串聯(lián)固相萃取，對豬肉樣品中的9 種β2-受體激動劑進行富集和凈化，樣品經(jīng)β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解和叔丁基甲醚超聲提取后，濃縮提取液，殘渣用10 ml 乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，v/v）溶解，經(jīng)凝膠凈化串聯(lián)固相萃取柱凈化，收集餾分通過超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果對克侖特羅的檢出限為0.1 μg/kg，在0.3 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg 3 種添加水平的平均回收率為79.35%～109.80%，相對標準偏差為2.12%～9.11%。 該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，較為適合豬肉組織的檢測。

2.6 其他樣品提取及凈化方法

超臨界流體萃取法 （supercritical fluid extraction，SFE）是利用壓力和溫度對超臨界流體溶解力變化的影響，有選擇性地把極性、沸點及分子量不同的成分提取和分離。 目前研究較多的超臨界流體是二氧化碳，其具有無毒、無污染、惰性環(huán)保、可避免產(chǎn)物氧化和萃取溫度低等優(yōu)點，尤其適合食品中藥物及活性物質(zhì)的分離提取。 而對于極性化合物，適當(dāng)加入少量極性溶劑能夠大大提高萃取效率。 O’keeffe 等[29，30]采用此技術(shù)對牛肝中克侖特羅及沙丁胺醇進行提取， 在流體中加入甲醇作為修飾劑以降低克侖特羅的極性、提高萃取效率。提取物不經(jīng)凈化直接旋轉(zhuǎn)蒸干后復(fù)溶， 用酶聯(lián)免疫法檢測， 結(jié)果回收率均達到80%以上，定量限為0.1 ng/g，日內(nèi)日間精密度良好（<15% ）。 雙 相 滲 析 膜 分 離 技 術(shù) （bipolar electrodialysis membrane separation）是一種半透膜分離技術(shù)， 適用于分子量較小化合物的分離及提取。Gonzalez 和Fente 等[31,32]利用裝有提取溶劑叔丁基甲醚、 二氯甲烷的滲析管對動物肝臟及毛發(fā)中的克侖特羅進行分離提取，37°C 以下以150 r/min 轉(zhuǎn)速連續(xù)滲析提取4 小時， 然后將滲析管中的有機相經(jīng)無水硫酸鈉脫水后以氮氣濃縮至干， 肝臟樣品克侖特羅加標水平在2 ng/g 時， 以氣質(zhì)聯(lián)機法測定的回收率達99.13%。 此方法節(jié)省了液-液提取及凈化步驟，具有操作簡便、節(jié)省時間和提取效率高等優(yōu)點。但由于操作條件的限制， 目前以上幾種方法尚未應(yīng)用于批量樣品處理中。

3 儀器分析方法

3.1 免疫分析法（immunoassays，IAs）

免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、 可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)檢測各種物質(zhì)的分析方法。 由于免疫法選擇性較好，且具有前處理簡單、靈敏度高等優(yōu)點， 故在快速篩選大批量樣品中獸藥殘留方面有廣泛應(yīng)用。根據(jù)標記物及檢測體系的不同，免疫法主要分為酶免疫測定法、 膠體金免疫測定法、 免疫傳感器、化學(xué)發(fā)光酶免疫法等[33]，其中應(yīng)用最廣泛的即為酶免疫測定法。

3.1.1 酶免疫測定法（enzyme immunoassay，EIA）

酶免疫測定法是使用酶進行標記的免疫分析方法， 由于避免了同位素標記的放射性污染和標記物易衰變等問題，且操作方便、儀器簡易，目前EIA 在藥物殘留分析中得到很快的發(fā)展， 其中應(yīng)用最廣的是酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）。 國內(nèi)使用最多的進口酶免檢測試劑盒產(chǎn)品包括德國r-Biopharm 公司和英國Randox Laboratories Ltd 公司生產(chǎn)的試劑盒[34]。 陳穗等[35]使用克侖特羅試劑盒（德國r-Biopharm 公司），從方法的檢出限、校正曲線的線性范圍、精密度、加標回收率測定等方面對酶聯(lián)免疫法檢測豬尿中克侖特羅殘留量的質(zhì)量控制方法進行了探討，結(jié)果表明，該試劑盒的樣品檢測下限為0.03 ng/ml， 定量下限為0.1 ng/ml。當(dāng)克侖特羅標準添加水平為0.5 ng/ml、1.0 ng/ml時，平均回收率分別約為84%和90%，均符合殘留分析質(zhì)量控制要求[36]。

3.1.2 膠體金免疫層析技術(shù)測定法 （colloidal gold immunoassay，CGIA）

膠體金免疫層析測定法是一種利用膠體金顆粒作為標記物、簡單快速的免疫分析方法[37]。 其最關(guān)鍵的是制備出特異性強和純度高的單克隆抗體， 使用原理是將人工合成的抗原先固定于條狀纖維層析材料的試紙條上， 膠體金標記試劑 （抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，樣品溶液借助毛細作用在試紙條上移動， 待測物與人工合成的抗原競爭結(jié)合膠體金標記的抗體，并直接以顏色顯示檢測結(jié)果。 Zhang等[38]使用多克隆抗體——膠體金標記免疫層析法對豬尿液中的克侖特羅和萊克多巴胺同時進行測定，結(jié)果顯示該方法對豬尿液中克侖特羅和萊克多巴胺的檢出限均為0.1 ± 0.01 ng/ml， 光密度掃描儀測定半抑制濃度（IC50）分別為0.56 ±0.08 ng/ml 和0.71 ±0.06 ng/ml，肉眼觀測水平的臨界值均為1.0 ng/ml，且與氣相色譜法-質(zhì)譜法檢測平行實驗結(jié)果具有一致性。 該法檢測程序可在5 min 內(nèi)完成，具有操作快速方便、結(jié)果易于判斷的特點，適用于豬尿中鹽酸克侖特羅和萊克多巴胺殘留的現(xiàn)場快速篩查測定。

3.1.3 化學(xué)發(fā)光免疫法 （chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）

化學(xué)發(fā)光免疫法是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，先用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標記抗體或抗原，待與待測的抗原或抗體反應(yīng)后再將游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標記物分離并加入其它相關(guān)物進行化學(xué)發(fā)光， 進而通過反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光強度來進行抗原抗體定性定量的分析方法[39]。 Chen 等[40]采用過氧化脲作為luminol-CH4N2O·H2O2-HRP （魯米諾-過氧化脲-辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光體系） 的氧化劑， 聯(lián)苯硼酸作為增強劑， 并通過對魯米諾及聯(lián)苯硼酸的濃度進行優(yōu)化來增強化學(xué)發(fā)光信號和提高發(fā)光增敏作用， 再以重現(xiàn)性較好的流動注射化學(xué)發(fā)光法檢測免疫反應(yīng)后的酶標復(fù)合物。結(jié)果在最優(yōu)條件下，克侖特羅檢測的線性范圍達到0.05～9 μg/L（r2= 0.9959），方法檢出限為0.02 μg/L。 此方法結(jié)合了化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高特異性， 因此在食品分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

3.2 電化學(xué)檢測法

3.2.1 毛細管區(qū)帶電泳法 （capillary electrophoresis，CE）

毛細管電泳是根據(jù)不同組分的帶電粒子在高壓直流電場的作用下遷移速率的不同而實現(xiàn)各組分分離的分析方法。 根據(jù)分離模式可分為毛細管區(qū)帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等電聚焦等，可以滿足基質(zhì)復(fù)雜的食品分析要求，且具有分離效果好、分析速度快、樣品用量少的特點[41]。 毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用[42]及與核磁共振儀聯(lián)用[43]技術(shù)的不斷完善，大大提高了檢測的靈敏度，并且縮短了分析時間，使毛細管電泳在藥物殘留分析中得到更廣泛應(yīng)用。 顏流水等

[44]建立了毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，測定豬肝臟中克侖特羅和沙丁胺醇。 處理后的樣品電泳分離時間小于6 min，在優(yōu)化的毛細管電泳分離和質(zhì)譜檢測條件下， 基質(zhì)加標克侖特羅和沙丁胺醇的檢出限分別為0.4 μg/kg 和0.3 μg/kg。 方法靈敏度高、特異性強，測定結(jié)果準確可靠，可用于食品中克侖特羅和沙丁胺醇殘留的確證性檢測。

3.2.2 電化學(xué)生物傳感器（electrochemical biosensor）

生物傳感器主要包括敏感元件和信號轉(zhuǎn)換元件（換能器）兩部分，該技術(shù)是將生物活性物質(zhì)作為敏感元件（生物識別系統(tǒng)），在與分析物特異性結(jié)合后引起物化性質(zhì)改變，經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換為次級可用信號，從而實現(xiàn)對待測分析物結(jié)構(gòu)及濃度進行分析[45]。 He等[46]制作了基于碳納米管的無標記電化學(xué)免疫傳感器， 使用1-[3-（二甲胺基）-丙基]-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸作為交聯(lián)劑，將克侖特羅共價鍵合到多壁碳納米管（MWCNTs）表面。 通過吸附作用將軛合物聚合到玻璃碳電極表面， 在循環(huán)伏安法和微分脈沖伏安測量下，使用K3Fe（CN）6的氧化還原探針監(jiān)控免疫反應(yīng)步驟。在克侖特羅單克隆抗體存在時，[Fe（CN）63-/4-]氧化還原反應(yīng)的峰電流值下降，可能是由于抗體在溶液中可以結(jié)合電極表面的軛合物。該實驗中單克隆抗體對溶液中鹽酸克侖特羅具有很高的敏感性及特異性， 檢出限達到0.32 ng/mL，并通過與酶聯(lián)免疫法及液質(zhì)聯(lián)用法平行測定空白加標飼料結(jié)果的比較證實了方法的準確性。 Wang 等[47]采用以銀鈀合金納米顆粒為載體的電化學(xué)生物傳感器對豬肉樣品進行檢測， 以經(jīng)還原的氧化石墨烯（RGO）來固定人工抗原和增強電化學(xué)信號，銀鈀合金納米粒子用于標簽抗體及在無其他底物的磷酸緩沖液（PBS）中產(chǎn)生強電化學(xué)信號，并引入絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE），避免電極之間的干擾，實現(xiàn)了在0.01～100 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)同時檢測萊克多巴胺、克侖特羅以及沙丁胺醇， 檢出限分別為1.52 pg/ml、1.38 pg/ml 和1.44 pg/ml，方法有較好的靈敏度，滿足復(fù)雜基質(zhì)中β2-受體激動劑的檢測。

3.3 色譜質(zhì)譜分析

3.3.1 高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography，HPLC）

高效液相色譜在經(jīng)典液相色譜理論的基礎(chǔ)上引入了高壓泵、 高效固定相及靈敏度較高的紫外陣列檢測器及熒光檢測器等，具備分析效率高、靈敏度高及操作易自動化等優(yōu)點[48]。Zhang 等[49]結(jié)合固相萃取和高效液相色譜紫外檢測器對魚肉中的克侖特羅殘留進行分析，樣品勻漿后經(jīng)過超聲提取和固相萃取柱凈化，以磷酸二氫鈉水溶液（pH=6） 和甲醇為流動相，在210 nm 紫外波長下檢測， 方法檢出限為0.01 μg/ml，在0.1～1.0 μg/ml 空白添加范圍內(nèi)回收率均在75%以上。 王琦等[50]采用液-液萃取和固相萃取提取純化動物組織樣品，以含0.1%甲酸的乙腈溶液和0.1%甲酸的乙酸銨水溶液（25:75，v/v） 為流動相，在244 nm波長下以外標法定量。 此方法檢出限為0.05 mg/kg，方法日間精密度RSD = 4.46%， 回收率為88. 0%～93.4%，具有較好的精密度和準確度。 但由于紫外檢測器的基質(zhì)影響較大， 限制了方法的靈敏度和專屬性，目前已較少作為確證分析方法。

3.3.2 氣相色譜質(zhì)譜/高分辨質(zhì)譜法 （GC-MS，GCHRMS）

氣相色譜質(zhì)譜法是β2-受體激動劑在復(fù)雜樣品中殘留測定中最常用的定量和確證方法。 GC-MS 具有較高的特異性，由于β2-受體激動劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有不易氣化的羥基和氨基， 因此需要對處理后的樣品衍生化，常用的衍生化試劑有N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺（MSTFA）和N，O-雙（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（BSTFA）。 苗虹等[51]對動物性食品中克侖特羅用高氯酸提取后， 用乙酸乙酯-異丙醇（6∶4，v/v）萃取，然后進一步用弱陽離子交換萃取柱進行富集凈化，再以乙醇-濃氨水（98∶2，v/v）洗脫并濃縮，經(jīng)N-O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后進行氣質(zhì)聯(lián)用檢測， 方法定量限為0.5 ng/g。Schnzer 等[52]通過氣相色譜—高分辨質(zhì)譜儀對馬匹毛發(fā)中的克侖特羅進行分析，選取6～12 厘米長的毛發(fā)（代表3～6 個月的生長周期）用甲醇-水（1∶1，v/v）清洗，再用0.5 mol/L 的KOH 溶液60°C 超聲水浴堿解，提取液經(jīng)HLB 固相萃取柱凈化后濃縮，再使用MSTFA 衍生化為N，O-bis-TMS 衍生物通過高分辨質(zhì)譜檢測，方法的檢出限達到0.9 ng/g。

3.3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）

液相色譜質(zhì)譜由于其具有靈敏性高、 準確性高、選擇性高、分析檢測范圍寬以及定性、定量準確等特點，且減少了衍生化步驟的影響，目前被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品，尤其是食品中痕量藥物的篩查和確證[53，54]。Fan 等[55]通過液相色譜串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜，對豬肉、 豬肝及雞肉中的25 種β2-受體激動劑和23 種β-受體阻滯劑同時進行定性定量測定， 樣品先經(jīng)5%濃度的三氯乙酸提取， 再通過MCX 陽離子交換萃取柱凈化濃縮后進樣， 三級離子碎片連續(xù)反應(yīng)監(jiān)測模式下檢測。 結(jié)果所有藥物的回收率均在46.6～118.9%之間，相對偏差在1.9～28.2%之間；方法的檢出限在0.05～0.49 μg/kg 之間，可以滿足同時檢測復(fù)雜基質(zhì)中多種藥物殘留的要求。 Lehner 等[56]對馬血漿中克侖特羅的測定進行了固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的開發(fā)， 結(jié)果該方法對克侖特羅的確證及定量能力達到10 pg/ml。

4 相關(guān)檢測標準

目前執(zhí)行的克侖特羅殘留檢測國家標準方法主要包括： 農(nóng)業(yè)部1025 號公告-18-2008 動物源性食品中β2-受體激動劑殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法[57]，該方法對于克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、馬布特羅等9 種β2-受體激動劑在豬肉、豬肝、雞蛋和牛奶中的檢出限均達到0.25 μg/kg；國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局國家標準GB/T5009.192-2003 動物性食品中克侖特羅殘留量的氣相色譜質(zhì)譜、 高效液相色譜、酶聯(lián)免疫檢測法[58]，這三種方法對于動物組織、尿液、血液的檢出限均為0.5 μg/kg；國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局SN/T 1924-2011 進出口動物源食品中克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法[59]，該方法對于動物組織、 內(nèi)臟及牛奶和奶粉中的克侖特羅檢出限為0.05 μg/kg，對于萊克多巴胺、沙丁胺醇及特布他林的檢出限均為0.5 μg/kg。

由于目前歐盟對于動物肌肉中克侖特羅最大殘留限量為0.1 μg/kg[60]，日本和國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）允許的最大殘留量為0.2 μg/kg[61]。 所以只有新出臺的SN/T 1924-2011—進出口動物源食品中克侖特羅等的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法達到了上述檢測要求。

5 小結(jié)

綜上所述， 目前對于動物組織等復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量藥物的提取和富集方法，固相萃取等專屬性、重現(xiàn)性良好的提取方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用， 并在提高分析的靈敏度及準確性方面發(fā)揮著較傳統(tǒng)提取方法更明顯的優(yōu)勢；而近期發(fā)展的分子印跡固相萃取、超臨界流體萃取、 免疫親和色譜萃取和凝膠滲透色譜萃取等一系列新的樣品提取凈化方法， 可以滿足更高精度要求以及多種藥物的同時提取富集， 從而為高靈敏度儀器的有效分析提供可靠保證。 而隨著儀器分析技術(shù)的不斷更新， 痕量藥物分析儀器也更加多樣化和系統(tǒng)化。 免疫分析方法不僅有較好的靈敏度，且具有高通量、操作簡單、檢測成本低，能夠較好滿足基層實驗室、現(xiàn)場監(jiān)控檢測、臨時快速抽樣檢測的要求。但是由于提供的分子結(jié)構(gòu)信息較少，尚不能作為確證方法， 而且金標免疫技術(shù)等由于需采用單克隆抗體研制，費用較高不適合大批量樣品檢測；電化學(xué)分析及毛細管分析技術(shù)有較好的特異性和靈敏度，但由于檢測條件和方法重現(xiàn)性等因素，對大樣本量克侖特羅殘留篩查的應(yīng)用并不十分廣泛。 色譜質(zhì)譜技術(shù)作為主要的確證分析和精確定量方法，在動物組織中β2-受體激動劑檢測中的應(yīng)用日趨完善，并被采納為國家標準的儀器方法。

鑒于目前食品安全形勢嚴峻和WADA 興奮劑檢查力度的不斷加強及其認證實驗室檢測能力的顯著提高， 各國對于動物體內(nèi)違禁藥物殘留監(jiān)控管理不斷加強，對數(shù)據(jù)精準性的要求越來越高，監(jiān)測范圍及樣本數(shù)量也越來越大， 這都要求獸藥殘留檢測技術(shù)進一步發(fā)展以滿足其需要。 藥物殘留檢測技術(shù)的發(fā)展方向主要可概括為：（1）更高的靈敏度、更低的檢出限和定量限；（2）高通量，即單位時間內(nèi)分析更多樣品；（3） 更高的選擇性、 特異性和抗干擾能力；（4）分析儀器更高的穩(wěn)定性，更多聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展；（5）減少污染和消耗，降低分析成本。由此可見，動物體內(nèi)違禁藥物克侖特羅等的分析技術(shù)仍有待進一步改進和完善，需建立更有效和實用的檢測體系，從而更好地維護和保證我國運動員食品安全。

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