運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對局灶性缺血再灌注大鼠腦梗死和HIF-1α 基因表達(dá)的影響

鄧文騫 王璐 李雪 袁瓊嘉

成都體育學(xué)院（成都610041）

腦血管?。╟erebrovascular disease，CVD）占我國乃至全世界最常見致死和成人殘疾原因的第二位［1，2］。其中腦梗死最常見，它由腦血管阻塞性缺血所致，發(fā)病率為110/10 萬人口， 約占全部腦血管病的60%～80%［3］。如何有效預(yù)防腦梗死以及減少血管阻塞后腦梗死的面積，成為預(yù)防醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。

腦缺血預(yù)處理 （neuronal ischemic preconditioning，NIPC） 是特異性地對大腦進(jìn)行一種或多種低于永久性損害的刺激， 從而引發(fā)機(jī)體內(nèi)在的神經(jīng)保護(hù)措施， 對于隨后更為嚴(yán)重的腦缺血損傷具有保護(hù)作用［4］。 運(yùn)動(dòng)預(yù)處理作為一種特殊形式的缺血缺氧預(yù)處理， 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用及機(jī)制研究尚屬起步階段。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理減少大鼠大腦皮質(zhì)及海馬細(xì)胞凋亡， 對力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的腦細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用［5，6］。 然而，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對更嚴(yán)重的腦缺血梗死是否也有保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī) 制 尚 不 明 了。 低 氧 誘 導(dǎo) 因 子-1α （hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α） 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，因其可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）及一氧化氮合酶（iNOS）等靶基因的轉(zhuǎn)錄而成為機(jī)體缺血缺氧應(yīng)答時(shí)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)中心。 本實(shí)驗(yàn)采用大鼠腦中動(dòng)脈阻塞性缺血（MCAO）模型，觀察運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦梗死體積的影響， 并探討其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及其分組

4 月齡成年雄性SPF 級SD 大鼠60 只， 體重（325±30）克，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2009-09；使用許可 證 編 號：SYXK （川）2009-045， 動(dòng) 物 批 號：20111001。 大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注組 （IR 組，n =24）、假手術(shù)組（sham 組，n = 12）和運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組（EP組，n = 24）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

IR 組參照改良的Longa［7］大腦中動(dòng)脈二次線栓法制作腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。 以10%水合氯醛0.3 ml/kg 腹腔麻醉，頸正中切口，行右側(cè)腦中動(dòng)脈缺血（MCAO）手術(shù)：暴露頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）及頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），將0.26 mm 單絲尼龍魚線頭端0.5 cm 用石蠟包被， 并于20 mm 長處標(biāo)記，結(jié)扎ECA 遠(yuǎn)端，用提拉線暫時(shí)阻斷CCA 及ICA 血流，在結(jié)扎線近端距分叉5 mm 處剪一約0.3 mm 小口，全部大鼠均通過右側(cè)CCA 切口處插入，經(jīng)分叉部進(jìn)入ICA，栓線長度自CCA 分叉處約18～20 mm，根據(jù)動(dòng)物體重而定，栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCA），然后縫合皮膚，栓線尾端部分固定于皮膚上。 缺血達(dá)2 h 后小心抽出栓線，即形成再灌注。在缺血期間及再灌注后2 h 保持體溫在（37±0.5）℃。動(dòng)物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為， 以大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為MCAO 模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

sham 組行假手術(shù)代替缺血再灌注。 不插入尼龍魚線，其余操作步驟同缺血再灌注組。

EP 組前3 天進(jìn)行無負(fù)重適應(yīng)性游泳，10 min/d，從第4 天開始進(jìn)行不負(fù)重中等負(fù)荷游泳訓(xùn)練，60 min/d，6 d/w，持續(xù)4 周；游泳玻璃缸體積為150 cm×60 cm×100 cm，水深> 70 cm，水溫（34±2）℃，室溫25℃。 大鼠運(yùn)動(dòng)后迅速用毛巾擦干皮毛并保暖。 末次運(yùn)動(dòng)后24 小時(shí)制作缺血再灌注模型，方法同IR 組。

運(yùn)動(dòng)造模實(shí)驗(yàn)在成都體育學(xué)院國家體育總局四川省運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，MCAO 造模、組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)、 熒光定量PCR 及Western blot 實(shí)驗(yàn)均在四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 取材

所有大鼠于MCAO 手術(shù)后24 h 采用股動(dòng)脈放血處死， 剪開皮膚暴露頭及頸段， 從頸椎處剪斷頸髓，分離去除后頸部肌肉，用彎鉗仔細(xì)剔除顱骨，避免硬腦膜劃傷腦組織， 隨后從延髓開始慢慢分離顱底組織取下腦。 各組大鼠腦組織隨機(jī)分為3 小組（sham 組各小組n = 4，IR 組各小組n = 8、EP 組各小組n = 8），有一小組進(jìn)行TTC 染色計(jì)算梗死體積，另一小組進(jìn)行病理學(xué)檢測， 最后一小組進(jìn)行熒光定量RT-PCR 及Western blot 實(shí)驗(yàn)， 分別行-20℃冷凍保存、4%中性多聚甲醛固定和液氮保存。

1.4 TTC 染色

將放入-20℃冰箱中的腦組織速凍20 分鐘，隨后取出切片，每個(gè)腦組織切成5 片，每間隔2 mm 切一片，第一刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。切片后將組織置于2%TTC 溶液中，用錫箔紙蓋住，放入37℃溫箱25 min，每隔5 分鐘翻動(dòng)腦片，使其均勻接觸到染色液。然后用10%甲醛溶液固定，過夜，采用病理圖像分析儀測量腦梗死面積，根據(jù)梯形法則計(jì)算腦梗死體積［8］。

1.5 免疫組化染色

取出多聚甲醛固定標(biāo)本， 常規(guī)石蠟包埋并制成5 mm 切片，每個(gè)腦標(biāo)本取3 張切片，脫蠟至水，梯度酒精脫水，3%H2O2及正常血清處理后， 加入抗鼠HIF-1α 單克隆抗體 （美國Santa Cruz 公司），4℃過夜后，依次滴加山羊抗鼠二抗IgG（美國Cell Signal公司）及SP（工作濃度1∶200），37℃各孵育60 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。 以PBS 代替一抗作為空白對照。 采用計(jì)算機(jī)圖像采集分析系統(tǒng) （美國Nikon & SPO， 軟件為Version3.0）采集圖像，采用Image Pro-Plus 圖像分析軟件定量分析蛋白表達(dá)。 分析每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野的圖像，各組所選部位相同。

1.6 熒光定量RT-PCR 檢測

取部分液氮保存腦組織，按50～100 mg/mlTrizol劑量加入Trizol 提取總RNA。 采用紫外分光光度計(jì)測定RNA 含量、 純度； 采用TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit（大連寶生物）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得 到cDNA； 采 用TaKaRa SYBR Premix Dimer EraserTM（大連寶生物）進(jìn)行Real-time PCR。 引物序列：HIF -1α （ 擴(kuò) 增 長 度 234 bp） 上 游：5′ -CGGCGGCGAGAACGAGAAGAAAAAG-3′， 下游：5′-TTCTCACACGTAAATAACTGATGGT -3′ ；β -actin（擴(kuò)增長度99 bp）上游：5′-CGT AAA GAC CTC TAT GCC AAC A-3′，下游：5′-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TC-3′。 反應(yīng)結(jié)束后，分析PCR 產(chǎn)物融解曲線，確定反應(yīng)的特異性，并根據(jù)各樣本Ct 值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 根據(jù)RT-PCR 儀給出各反應(yīng)孔的Ct 值， 以βactin 基因?yàn)閮?nèi)參， 按照公式ΔΔCt =（待測樣品目的基因平均Ct 值-待測樣品管家基因平均Ct 值）-（基準(zhǔn)樣品目的基因平均Ct 值-基準(zhǔn)樣品管家基因平均Ct 值）計(jì)算出ΔΔCt 值，各組樣本HIF-1α 基因的相對表達(dá)水平=2-ΔΔCt。

1.7 Western blot 檢測

從液氮中取出腦組織， 標(biāo)本放入預(yù)冷研缽充分短時(shí)研磨，按500 μl/100mg 標(biāo)準(zhǔn)加入蛋白裂解液至研缽沖洗研磨好的組織，充分混勻后將懸液放入EP管中，蛋白裂解液購自北京百泰克生物試劑公司，使用前加蛋白酶抑制劑：PMSF［174 mg/10ml（異丙醇）］1%；Leupeptin（1 mg/ml）1/500；Pepstatin A（5 mg/ml）1/1000。 將懸液放在冰上冰浴20 min， 確保裂解充分，隨后14000 r/min、4℃離心20 min，收集上清，即大鼠腦組織總蛋白。 采用BCA 蛋白定量試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司） 定量檢測各標(biāo)本總蛋白。 各標(biāo)本取20 μg 總蛋白加入上樣緩沖液后于熱板上煮10 分鐘，隨后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，X 線膠片曝光進(jìn)行免疫印記信號檢測。 Western-blot 所用抗體同免疫組化實(shí)驗(yàn)抗體。 電泳結(jié)果采用Quantity One 圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示， 組間差異采用t 檢驗(yàn)兩兩比較，P < 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TTC 染色結(jié)果

TTC 染色后，正常腦組織呈磚紅色，而缺血梗死區(qū)為蒼白色，與正常組織邊界清晰，顯示出明顯的梗死區(qū)域。IR 組大鼠腦組織梗死體積較大；EP 組大鼠腦梗死體積較IR 組明顯縮小，有顯著性差異（P <0.05）；sham 組未見梗死灶形成（見表1，圖1）。

表1 各組大鼠MCAO 腦梗死體積比較

圖1 各組大鼠MCAO 大腦TTC 染色結(jié)果

2.2 HIF-1α 免疫組化結(jié)果

sham 組偶見HIF-1α 表達(dá)，但因表達(dá)量少，無法進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。 IR 組和EP 組均可見較多的HIF-1α 陽性表達(dá)細(xì)胞，光鏡下胞核呈黃褐色，也有部分為胞漿陽性，在腦組織大部分區(qū)域有表達(dá)，圖像分析顯示EP 組HIF-1α 表達(dá)強(qiáng)于IR 組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01，見表2，圖2）。

圖2 各組大鼠腦組織HIF-1α 免疫組化結(jié)果（×200，×400）

表2 各組大鼠腦組織免疫組化檢測HIF-1α 表達(dá)結(jié)果

2.3 HIF-1α 熒光定量RT-PCR 檢測結(jié)果

各組標(biāo)本HIF-1α 及β-actin 擴(kuò)增融解曲線均只有一個(gè)峰，表明引物特異性好，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增發(fā)生。表3 結(jié)果顯示，IR 組和EP 組HIF-1α 基因表達(dá)水平較sham 組均明顯升高（P < 0.05），而EP 組HIF-1α 基因表達(dá)水平高于IR 組， 差異具有顯著性（P < 0.05）。

表3 各組大鼠腦組織熒光定量RT-PCR 檢測HIF-1α 表達(dá)結(jié)果

2.4 HIF-1α 蛋白Western blot 檢測結(jié)果

從圖3 可以看出，IR 組和EP 組大鼠腦組織HIF-1α 蛋白表達(dá)水平均較sham 組明顯上調(diào)，EP 組升高幅度大于IR 組。圖像分析軟件測得各條帶灰度值比較見表4。

圖3 各組大鼠腦組織HIF-1α 蛋白Western blot 檢測結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織HIF-1α 蛋白Western blot 條帶灰度值比較

3 討論

腦梗死是腦血管阻塞造成腦細(xì)胞缺血缺氧所致的一類嚴(yán)重的腦血管病。 雖然哺乳動(dòng)物對大腦缺血缺氧高度敏感，但大量研究表明，哺乳動(dòng)物大腦具有獨(dú)特的適應(yīng)能力，即腦缺血預(yù)適應(yīng)。 非致死性血管阻塞誘導(dǎo)腦產(chǎn)生缺血耐受，在腦嚴(yán)重缺血缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制已有大量報(bào)道［9-11］，結(jié)果均證實(shí)腦缺血預(yù)處理對大腦產(chǎn)生了明顯的保護(hù)作用。

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理作為一種特殊的腦缺血缺氧預(yù)處理形式，對重要器官如心臟、腦產(chǎn)生的影響受到廣泛關(guān)注。Ding 等［12］發(fā)現(xiàn)，前期持續(xù)3 周的運(yùn)動(dòng)預(yù)處理能改善卒中后大鼠腦微血管完整性，這與Kang 等［13］的研究相符。 Curry 等［14］也報(bào)道，持續(xù)3 周的跑臺運(yùn)動(dòng)抑制了大鼠腦梗后的炎癥反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，大鼠再發(fā)生局灶性腦缺血再灌注，其腦梗死體積較未進(jìn)行運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的IR 組明顯減小，表明4 周中等負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)在一定程度上抵抗嚴(yán)重缺血缺氧，對阻塞性腦梗死產(chǎn)生保護(hù)作用。

低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是在1992 年由Semenza 等［15］首 先在Hep3B 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。 HIF-1α 是HIF 的亞單位，其在機(jī)體抵抗缺血缺氧方面發(fā)揮重要作用［16］。 研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)刺激同樣能夠影響HIF-1α 表達(dá)，范錦勤等［17］研究發(fā)現(xiàn)單純訓(xùn)練刺激會(huì)引起大鼠腦組織HIF-1α 升高。 徐建方等［18］發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練和低氧均能顯著提高肝組織HIF-1α表達(dá)。 本研究中，大腦局灶性缺血2 小時(shí)再灌注后，EP 組和IR 組大鼠大腦HIF-1α mRNA 水平和蛋白水平均較sham 組升高，表明急性缺血缺氧激活腦神經(jīng)細(xì)胞HIF-1α 基因表達(dá)， 使細(xì)胞處于一種特殊的代謝狀態(tài)，對抗劇烈的能量缺失刺激。 而EP 組在進(jìn)行了為期4 周的中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，免疫組化、熒光定量RT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，無論在基因轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白表達(dá)水平， 其HIF-1α 均明顯高于未進(jìn)行預(yù)處理的IR 組， 表明運(yùn)動(dòng)作為一種特殊的、輕微的腦缺氧缺血刺激，促進(jìn)了HIF-1α 表達(dá)，調(diào)動(dòng)機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制， 使腦細(xì)胞產(chǎn)生了一定的缺氧耐受，從而抵抗更嚴(yán)重的缺血缺氧刺激。

關(guān)于預(yù)處理與缺血事件之間的間隔， 有研究發(fā)現(xiàn)， 腦缺血預(yù)處理產(chǎn)生快速耐受和延遲耐受兩種作用［19，20］。 本研究采用4 周運(yùn)動(dòng)預(yù)處理結(jié)束后24 小時(shí)進(jìn)行大腦局灶性缺血再灌注， 主要考慮到雖然中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)造成的大鼠腦缺血缺氧刺激不大， 但持續(xù)時(shí)間較長， 很可能造成體內(nèi)尤其是缺血缺氧較明顯的器官細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化， 而這些蛋白可能參與到產(chǎn)生延遲耐受保護(hù)的過程中。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理確實(shí)對24 h 后的局灶性腦缺血梗死產(chǎn)生了保護(hù)作用。在接下來的研究中，我們將重點(diǎn)考慮運(yùn)動(dòng)預(yù)處理是否產(chǎn)生快速耐受以及對比兩種耐受保護(hù)效果。 此外，由于HIF-1α 基因調(diào)節(jié)的下游因子種類繁多，功能復(fù)雜，具體是通過哪些信號通路產(chǎn)生保護(hù)作用，仍有待于研究。

4 總結(jié)

本研究結(jié)果表明，4 周中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)預(yù)處理減少局灶性缺血引起的大鼠大腦梗死體積， 可能通過上調(diào)HIF-1α 表達(dá)產(chǎn)生作用。

［1］ Bonita R，Mendis S，Truelsen T，et al. The global stroke initiative. Lancet Neurol，2004，3（7）：391-393.

［2］ 衛(wèi)生部. 中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒，2006：45.

［3］ 饒明俐，王志文，黃如訓(xùn)，等. 中國腦血管病防治指南（試行版）. 衛(wèi)生部疾病控制司、 中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)，2005：30.

［4］ Nandagopal K，Dawson TM，Dawson VL. Critical role for nitric oxide signaling in cardiac and neuronal ischemic preconditioning and tolerance. J Pharmacol Exp Ther，2001，297（2）：474-478.

［5］ 王璐， 袁瓊嘉. 運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的大鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響. 體育科學(xué)，2009，29（3）：52-57.

［6］ 王璐，鄧文騫，袁瓊嘉.運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響. 中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2012，31（7）：602-606，622.

［7］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Rebersible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20（2）：84-91.

［8］ Yin D，Zhou C，Kusaka I，et al. Inhibition of apoptosis by hyperbaric oxygen in a rat focal cerebral ischemic model. J Cereb Blood Flow Metab，2003，23（2）：855-864.

［9］ Ebrahimi SM，Aboutaleb N，Nobakht M. Consequences of ischemic preconditioning of kidney：Comparing between male and female rats. Iran J Basic Med Sci，2012，15 （6）：1148-1153.

［10］ Fang B，Li XM，Sun XJ，et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.Int J Mol Sci，2013，14（5）：10343-10354

［11］ Narayanan SV，Dave KR，Perez -Pinzon MA. Ischemic preconditioning and clinical scenarios. Curr Opin Neurol，2013，26（1）：1-7.

［12］ Ding YH，Ding Y，Li J，et al. Exercise pre-conditioning strengthens brain microvascular integrity in a rat stroke model. Neurol Res，2006，28（2）：184-9.

［13］ Kang KA，Seong H，Jin HB，et al. The effect of treadmill exercise on ischemic neuronal injury in the stroke animal model： potentiation of cerebral vascular integrity. J Korean Acad Nurs，2011，41（2）：197-203.

［14］ Curry A，Guo M，Patel R，et al. Exercise pre-conditioning reduces brain inflammation in stroke via tumor necrosis factor-alpha，extracellular signal-regulated kinase 1/2 and matrix metalloproteinase-9 activity. Neurol Res，2010，32（7）：756-762.

［15］ Semenza GL，Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol，1992，12 （12）：5447-5454.

［16］ Gidday JM. Cerebral preconditioning and ischemic tolerance. Nat Rev Neuro Sci，2006，7（6）：437-448.

［17］ 范錦勤，林文弢，翁錫全. 低氧訓(xùn)練對大鼠腦組織Ngb、HIF-1α、Bax 和Bcl-2 的影響. 體育學(xué)刊，2012，19（1）：129-133.

［18］ 徐建方，馮連世，路瑛麗，等. 不同模式低氧耐力訓(xùn)練對大鼠肝組織HIF-1α、HO-1 mRNA 表達(dá)的影響. 中國體育科技，2011，47（1）：126-129，136.

［19］ Lin WY，Chang YC，Lee HT，et al. CREB activation in the rapid, intermediate, and delayed ischemic preconditioning against hypoxic-ischemia in neonatal rat. J Neurochem，2009，108（4）：847-859.

［20］ Zhang J，Yang ZJ，Klaus JA，et al. Delayed tolerance with repetitive transient focal ischemic preconditioning in the mouse. Stroke，2008，39（3）：967-974.