均勻設(shè)計法優(yōu)選復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片的半仿生提取工藝

李欽青， 郭 蕾， 柴金苗， 張俊龍

（山西中醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030024）

均勻設(shè)計法優(yōu)選復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片的半仿生提取工藝

李欽青， 郭 蕾*， 柴金苗， 張俊龍

（山西中醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030024）

目的 均勻設(shè)計法優(yōu)選復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片半仿生提取 (SBE) 的最佳工藝條件。 方法 采用均勻設(shè)計，以天麻素、鉤藤總堿、芍藥苷、阿魏酸的量及干浸膏得率為指標(biāo)，綜合評判，優(yōu)選半仿生提取的工藝條件。結(jié)果 兩次提取用水的 pH分別為2.0、 8.5， 加水倍量為12 倍， 提取時間為2 h。 結(jié)論 優(yōu)選出的半仿生工藝條件穩(wěn)定、 可行，適合工業(yè)生產(chǎn)。

均勻設(shè)計；口腔崩解片；半仿生提取

復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片由天麻、鉤藤、白芍、當(dāng)歸等藥味組成，為突出劑型特性，保證療效，以得膏率及天麻素、鉤藤總堿、芍藥苷、阿魏酸的含量為指標(biāo)， 在比較傳統(tǒng)水煎煮、 70%乙醇回流和半仿生溫浸提取3種生產(chǎn)工藝，得出半仿生溫浸提取工藝最優(yōu)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)，通過均勻設(shè)計綜合分析評判，確定最優(yōu)的提取工藝。

1 藥物、 試劑與儀器

天麻素對照品 (110807-200205)、 芍藥苷對照品 (110736-200833)、阿 魏 酸 對 照 品 (110773-200611)，購自中國食品藥品檢定研究院； 鉤藤堿對照品 (10172-080114) 購自南昌貝塔生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

LC—2010A型高效液相色譜儀 (日本島津公司)； UV1100 型紫外分光光度計 (上海天美科學(xué)儀器有限公司)； PL6001-S 型電子天平、 AL204 型電子天平、 AB135-S 型電子天平 (METTLER TOLEDO)； DZKW-D-4 型電熱恒溫水浴鍋 (上海儀器儀表有限公司)； KQ-500E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗設(shè)計 根據(jù) SBE法理論［1］， 在 藥材粒度、提取溫度、濾過、濃縮等條件相同的前提下，采用均勻設(shè)計 U9(91×33) 表， 確定考察的主要因素及水平， 見表1。

表 1 U9（91×33） 實驗設(shè)計Tab.1 Experiment design w ith U9（91×33）

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品貯備液的制備 取處方藥材， 按均勻設(shè)計表安排，分別半仿生溫浸提取兩次，提取液合并， 調(diào)節(jié) pH至近中性， 減壓濃縮至相對密度為1.10 ～1.15(60 ℃) 的浸膏， 加乙醇使含醇量達(dá)70%， 靜置12 h， 濾過， 濾液減壓回收乙醇并調(diào)整至總量為 1 000 mL， 制得 1 ～9 號樣品貯備液。

2.2.2 供試液制備 精密吸取 “2.2.1”項下貯備液 SBE1-9各 10 m L， 分別置蒸發(fā)皿中， 水浴濃縮至近干， 殘渣加乙腈-水 (3 ∶97) 混合溶液溶解， 轉(zhuǎn)移至 5 mL量瓶中， 并用乙腈-水 (3 ∶97) 混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供測定天麻素含量的供試液 A1～9。

精密量取貯備液 SBE1～9各 10 mL， 水浴揮干，殘渣用2%硫酸溶液 10 mL使溶解，濾過， 用 2%硫酸溶液2mL洗滌殘渣和濾紙， 再用5mL以上的pH 3.6 的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖溶液清洗殘渣和濾紙， 合并濾液和洗滌液， 并調(diào) pH至 3.6， 轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中， 用 pH 3.6 的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖溶液稀釋至刻度，即得供測定鉤藤總堿含量的供試液 B1～9。

精密量取貯備液 SBE1～9各 2 mL， 裝入 25 mL量瓶，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得供測定芍藥苷含量的供試液 C1～9。

精密量取貯備液 SBE1-9各 10 m L， 分別置蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至近干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 搖勻， 即得供測定阿魏酸含量的供試液 D1～9。

2.3 天麻素的測定

2.3.1 色 譜 條 件［2］Kromasil C18色 譜 柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)； 流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液 (3 ∶97)； 檢測波長220 nm；柱溫 30 ℃；體積流量 1 m L/min； 進(jìn)樣量 10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取天麻素對照品適量，精密稱定 (11.95 mg)， 置 25 mL量瓶中，加甲醇至刻度， 搖勻， 作為貯備液 (0.478 mg/mL)； 精密量取 5.0 m L置 25 mL量瓶中， 加流動相至刻度，搖勻，即得天麻素對照品溶液 (天麻素質(zhì)量濃度為 95.6 μg/mL)。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取 “2.3.2”項下天麻素對照品貯備液 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、5.0、 6.0 mL， 分別置于 25 m L量瓶中， 加流動相至刻度， 搖勻。 分別進(jìn)樣 10 μL， 測得峰面積，計算回歸方程 y=885 321 x-7 264.9， r=0.999 9，天麻素進(jìn)樣量在0.191 2 ～1.147 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取 “2.3.2”項下天麻素 對 照 品 溶 液 (95.6 μg/mL)10 μL， 按“2.3.1” 項下色譜條件， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 天麻素峰面 積 分 別 為 8 328 763、 8 310 438、 8 343 845、8 264 765、 8 330 487、 8 273 854， 平 均 值 為8 308 692， RSD為 0.39%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 A1，分別于 0、 1、 2、 4、 6、 8 h 按 “2.3.1” 項下色譜條件 測 定。 天 麻 素 峰 面 積 分 別 為 8 557 638、8 533 279、8 418 474、8 504 743、8 464 738、8 514 765， 平均值為8 498 939.5， RSD為 0.59%。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 A16 份， 按 “2.3.1”項下色譜條件， 進(jìn)行測定。 供試液中天麻素質(zhì)量濃度分別為 97、 97、 96、 97、96、 96 μg/mL， 平 均 質(zhì) 量 濃 度 為 96.5 μg/mL，RSD為 0.57%。

2.3.7 加樣回收試驗 精密吸取 “2.2.1” 項下貯備液 SBE16 份， 每 份 5 mL(含天麻素 48.25 μg/mL)， 每份分別加入天麻素對照品溶液 (47.8 μg/m L)5 mL按 “2.2.2” 項下天麻素供試液的制備方法平行制備 6 份，按 “2.3.1” 項下色譜條件， 進(jìn)行含量測定。加樣回收率分別為 97.74%、99.23%、 97.21%、 99.05%、 99.67%、 96.39%，平均回收率為 98.215%， RSD為 1.32%。

2.3.8 含量測定 取供試液 A1～9， 用 0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液各 10 μL進(jìn)樣， 結(jié)果見表 2。

2.4 鉤藤總堿的測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取鉤藤堿對照品適量，精密稱定 (6.92 mg)， 置 25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻， 精密量取2.0mL置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得鉤藤堿對照品溶液(鉤藤堿質(zhì)量濃度為 11.072 μg/m L)。

2.4.2 線性關(guān)系考察［3］分別精密量取 “2.4.1”項下 鉤 藤 堿 對 照 品 溶 液 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、5.0、 6.0 m L， 揮干甲醇， 殘渣加入 pH 3.6 鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液 5.0 m L， 再加入溴甲酚綠酸性染料溶液 5.0 mL， 搖勻， 加入三氯甲烷 4 mL，振搖 2 min， 靜置 5 min，分出下 層，反復(fù)萃 取 3次， 合并三氯甲烷萃取液， 加入 0.4 g無水硫酸鈉脫水， 轉(zhuǎn)移至 25 mL量瓶中， 并加三氯甲烷至刻度， 搖勻；另取 1.0 mL蒸餾水如法操作后作為空白對照， 照紫外-可見分光光度法 ( 《中國藥典》2010 年版一部部附錄 V A)， 在 412 nm波長處測定吸光度。 回歸方程 為 y=0.008 9 x-0.002 1，r=0.999 1，在 11.072 ～66.432 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取 “2.4.1” 項下鉤藤堿 對 照 品 溶 液 (11.072 μg/m L)5 mL， 按“2.4.2” 項下方法測定， 連續(xù)測定 6 次， 吸收度分 別 為 0.497、 0.497、 0.497、 0.497、0.496、0.497， 平均值為0.496 8， RSD為 0.08%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 B15 mL， 按 “2.4.2” 項下方法制備樣品，分別于 0、0.5、1、 1.5、2、 2.5 h 測 定。吸 收 度 分 別 為0.480、 0.480、 0.479、 0.479、 0.478、 0.477， 平均值為0.478 8， RSD為 0.24%。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 B15 mL， 按 “2.4.2” 項下方法平行制備 6 份供試品液，并測定。供試液中鉤藤總堿質(zhì)量濃度分別為51、 51、 52、 50、 50、 51 μg/mL， 平均質(zhì)量濃度為 50.83 μg/mL， RSD為 1.48%。

2.4.6 加樣回收試驗 精密吸取 “2.2.1” 項下貯備液 B16 份， 每份 2 m L(含鉤藤總堿 590.83 μg/mL)， 每 份 分 別 加 入 鉤 藤 堿 對 照 品 溶 液(55.36 μg/mL)2mL， 按 “2.4.2” 項下方法平行制備6份供試品液，并測定。加樣回收率分別為95.82%、 98.29%、 95.21%、 99.88%、 98.85%、96.12%， 平 均 回 收 率 為97.378%， RSD為 1.96%。

2.4.7 含量測定 取供試液 B1～9， 按 “2.4.2”項下方法測定， 結(jié)果見表2。

2.5 芍藥苷的測定

2.5.1 色 譜 條 件［4］Kromasil C18色 譜 柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)； 流動相為乙腈 -0.1%磷酸溶液 (14 ∶86)； 檢測波長為 230 nm； 柱溫 25 ℃；體積流量 1 m L/min； 進(jìn)樣量 10 μL。

2.5.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定 (10.60 mg)， 置 25 mL量瓶中，加甲醇至刻度， 搖勻， 作為貯備液 (0.424 mg/m L)； 精密量取2.0 mL置 25 mL量瓶中， 加甲醇至刻度，搖勻，即得芍藥苷對照品溶液 (芍藥苷質(zhì)量濃度為 33.92 μg/mL)。

2.5.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取 “2.5.2”項下芍藥苷對照品貯備液 1.0、 3.0、 5.0、 7.0、9.0 mL，分別置于 25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。 分別進(jìn)樣 10 μL， 測得峰面積， 計算回歸方程 y=1 491 458.2x+6 075.8， r=0.999 9， 芍藥苷進(jìn)樣量在0.169 2 ～1.526 4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.4 精密度試驗 精密吸取 “2.5.2”項下芍藥苷 對 照 品 溶 液 (33.92 μg/mL)10 μL， 按“2.5.1” 項下色譜條件， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 芍藥苷峰 面 積 分 別 為 507 354、506 947、 508 543、505 440、 504 686、 509 831， 平均值為507 133.5，RSD為 0.38%。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 C1，分別于 0、 1、 2、 4、6、 8 h 按 “2.5.1” 項下色譜條件 測 定。芍 藥 苷 峰 面 積 分 別 為 557 785、559 658、 556 833、 552 542、 558 314、 551 771，平均值為 556 150.5， RSD為 0.58%。

2.5.6 重復(fù)性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 C16份供試品液， 按 “2.5.1”項下色譜條件， 進(jìn)行測定。 供試液中芍藥苷含有量分別為 37、 37、 37、38、 37、 37 mg/m L， 平 均 質(zhì) 量 濃 度 為 37.167 μg/mL， RSD為 1.10%。

2.5.7 加樣回收試驗 精密吸取 “2.2.1” 項下貯備液 SBE16 份， 每份 1 m L(含芍藥苷464.587 5 μg/mL)， 每份分別加入芍藥苷對照品溶液 (424 μg/mL)1 mL按 “2.2.2” 項下芍藥苷供試液的制備方法平行制備 6 份，按 “2.5.1” 項下色譜條件， 進(jìn)行含量測定。 加樣回收率分別為 95.77%、99.69%、 98.59%、 98.08%、 97.85%、 96.01%，平均回收率為 97.665%， RSD為 1.55%。

2.5.8 含量測定 取供試液 C1～9， 用 0.45 μm微孔濾膜濾過， 取濾液各 10 μL進(jìn)樣， 結(jié)果見表 2。

2.6 阿魏酸的測定

2.6.1 色 譜 條 件［5］Kromasil C18色 譜 柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)； 流動相乙腈 -0.1%磷酸溶液 (17:83)； 檢測波長 316 nm； 柱溫 35 ℃； 體積流量 1 m L/min； 進(jìn)樣量 10 μL。

2.6.2 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定 (10.10 mg)， 置 100 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 搖勻， 作為貯備液 (0.101 mg/mL)；精密量取3.0 m L置50 m L量瓶中， 加甲醇至刻度，搖勻，即得阿魏酸對照品溶液 (阿魏酸質(zhì)量濃度為 6.06 μg/mL)。

2.6.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取 “2.6.2”項下阿魏酸對照品貯備液 1.0、 3.0、 5.0、 7.0、9.0 mL，分別置于 50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。 分別進(jìn)樣 10 μL， 測得峰面積， 計算回歸方程 y=4 054 482.7x-168 9.8， r=0.999 9， 阿魏酸進(jìn)樣量在0.020 2 ～0.181 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.4 精密度試驗 精密吸取 “2.6.2”項下阿魏酸 對 照 品 溶 液 (6.06 μg/mL)10 μL， 按“2.6.1” 項下色譜條件， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 阿魏酸峰 面 積 分 別 為 242 523、244 061、 244 795、243 794、 244 850、 243 103， 平均值為 243 854.3，RSD為 0.38%。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 D1，分別于 0、 1、 2、 4、6、 8 h 按 “2.6.1” 項下色譜條 件 測 定。阿 魏 酸 峰 面 積 分 別 為 250 835、251 479、250 632、249 260、247 094、248 758，平均值為249 676.3， RSD為 0.65%。

2.6.6 重復(fù)性試驗 取 “2.2.2” 項下供試液 D16 份供試品液， 按 “2.6.1” 項下色譜條件， 進(jìn)行測定。 供試液中阿魏酸含量分別為 6.25、 6.24、6.39、 6.20、6.26、6.31 μg/mL， 平均質(zhì)量濃度為 6.275 μg/mL， RSD為 1.06%。

2.6.7 加樣回收試驗 精密吸取 “2.2.1” 項下貯備液 SBE16 份， 每 份 5 mL( 含阿魏酸 6.275 μg/mL)， 每 份 分 別 加 入 阿 魏 酸 對 照 品 溶 液(6.06μg/m L)5 mL按 “2.2.2” 項下阿魏酸供試液的制備方法平行制備 6 份， 按 “2.6.1” 項下色譜條件，進(jìn)行含量測定。加樣回收率分別為99.90%、 97.99%、 97.09%、 95.67%、 96.67%、98.64%， 平均回收率為 97.66%， RSD為 1.54%。

2.6.8 含量測定 取供試液 D1～9， 用 0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液各 10 μL進(jìn)樣， 結(jié)果見表 2。

2.7 干浸膏量的測定 精密量取 “2.2.1” 項下貯備液 SBE1～9各 10 mL， 分別置恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中， 水浴蒸干， 105 ℃烘干 3 h 以上至恒質(zhì)量［2］，計算干浸膏得率， 結(jié)果見表2。

2.8 工藝條件的優(yōu)化［3］將天麻素、 鉤藤總堿、芍藥苷、阿魏酸、得膏率等5項指標(biāo)匯總按下列公式進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn) 化 處 理/sj式 中為 標(biāo)準(zhǔn)化后的值，xij為樣品液 i中成分 j的含量，為各種樣品液 i中成分 j的平均值， sj為成分 j的標(biāo)準(zhǔn)偏差。將標(biāo)準(zhǔn)化后的值根據(jù)各指標(biāo)在工藝選擇中的主次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，得綜合評價指標(biāo)Y值，Y= ［ (天麻素 +芍藥苷 +阿魏酸) ÷3］ ×5+鉤藤總堿 ×3+干浸膏 ×2， 結(jié)果見表 2。

表2 各指標(biāo)成分含量、 標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果Tab.2 Values of the samples and the corresponding standardized values

將以上結(jié)果輸入計算機(jī)，用沈陽藥科大學(xué)編寫的均勻設(shè)計軟件處理，進(jìn)行平方項的逐步回歸，得回 歸 方 程:F=-210.85+50.233B+ 0.024 286AC-0.946 08 AD-0.232 92 BC+ 1.206 3BD-2.983 2 B2+0.104 09D2，F(xiàn)(7，1)= 3.843 ×105， 查 F值表 F0.05(7，1)=236.8， F0.05(7，1)＜F， P＜0.05， 所以 F檢驗通過， 回歸方程有意義。再將方程在計算機(jī)上進(jìn)行優(yōu)化處理，Y的期望值方向大者為佳。得出的優(yōu)化條件為 A=2.0，B= 8.355 3， C=12， D=2， (預(yù)測值 Y=9.322 0)。結(jié)合生產(chǎn)實際，確定復(fù)方天麻鉤藤口腔崩解片半仿生法提取的工藝條件為兩煎用水 pH分別為 2.0、8.5；加水倍量為 12 倍；提取時間為 2 h。

2.9 驗證優(yōu)化條件 用 “2.8” 項下優(yōu)選出的工藝條件， 照 “2.2 ～2.7” 項下樣品制備和測定方法，依法測得各指標(biāo)含量，并將進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理， 求得 Y'值， 所得 Y'值 9.488 非常接近預(yù)測值Y=9.322 0， 結(jié)果見表 3。

表3 驗證實驗各指標(biāo)成分的含量、標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果Tab.3 Values of the sam p les and the corresponding standardized values in confirm atory experiment

3 討論

半仿生法是從生物藥劑學(xué)角度模擬口服給藥時藥物經(jīng)過胃腸道消化吸收的過程，為中藥制劑設(shè)計的一種新的提取工 藝［6-7］， 用選定 pH 值 的 酸 性 水和堿性水依次連續(xù)提取得到含指標(biāo)成分高的 “活性混合物”。本方藥味較少，應(yīng)根據(jù)各成分理化性質(zhì)，設(shè)計適宜生產(chǎn)工藝，去除雜質(zhì)，保留活性成分，方中鉤藤生物堿受熱易破壞，不宜高溫煎煮提取，半仿生溫浸提取既保留了活性部位鉤藤總堿，又保證了其他活性成分的轉(zhuǎn)移率。

在均勻設(shè)計優(yōu)選工藝中，按照各指標(biāo)在提取工藝選擇中的主次地位，給予不同的加權(quán)系數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化后的值加權(quán)后求和，即得綜合評價值。這樣做可以消除各指標(biāo)之間的單位和量綱的不同，提高了組間綜合評判數(shù)據(jù)的相關(guān)性和可比性，更科學(xué)、合理。

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［5］ 阿古拉，張兆旺，孫秀梅.用均勻設(shè)計優(yōu)選慈航軟膠囊方藥的半仿生提取工藝條件［J］.中成藥， 2006， 28(7): 956-958.

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［7］ 張瑞亭，張兆旺， 孫秀梅，等.思維方式的轉(zhuǎn)換與中藥“半仿生提取法” ［J］.中國中藥雜志， 1997， 22(9):542-545.

Optim ization of extraction for decoction of Fufang Tianm a Gouteng Orally Disintegrating Tablets by sem i-bionic extraction

LIQin-qing， GUO Lei*， CHAI Jin-miao， ZHANG Jun-long

(Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China)

uniform design； orally disintegrating tablets； semi-bionic extraction

R944

:A

:1001-1528(2014)02-0291-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.016

2013-05-07

國家自然科學(xué)基金資助項目 (30873236)； 太原市科學(xué)技術(shù)局資助項目 (11014918)

李欽青 (1978—) ， 男， 助教， 醫(yī)學(xué)碩士， 從事中藥藥效物質(zhì)及新藥研究。 Tel:(0351)2272269， E-mail:lqqlqq@126.com

*通信作者: 郭 蕾 (1968—)， 女， 教授， 醫(yī)學(xué)博士， 從事于中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究。 Tel:(0351)2272664， E-mail:glqzl123@163.com