鉤藤總堿的熱穩(wěn)定性研究

劉 衛(wèi),楊雪萍,王中師，,王 盟,張 強(qiáng),郝立勇

(1.解放軍第88醫(yī)院藥劑科，山東 泰安 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271000)

鉤藤總堿的熱穩(wěn)定性研究

劉 衛(wèi)1,楊雪萍1,王中師1，2,王 盟1,張 強(qiáng)1,郝立勇2

(1.解放軍第88醫(yī)院藥劑科，山東 泰安 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271000)

目的考察鉤藤總堿的熱穩(wěn)定性。方法在不同溫度條件下，用高效液相色譜檢查鉤藤總堿中的鉤藤堿和異鉤藤堿。結(jié)果與鉤藤堿相比，異鉤藤堿溶液對熱不穩(wěn)定，60 ℃或90 ℃ 2 h后異鉤藤堿含量明顯降低，而鉤藤堿溶液在60 ℃ 2 h或4 ℃ 6 d的環(huán)境中穩(wěn)定。而且，鉤藤堿和異鉤藤堿成鹽后更加穩(wěn)定。結(jié)論異鉤藤堿的熱不穩(wěn)定性是鉤藤“后下”的原因。

鉤藤堿；異鉤藤堿；鉤藤總堿

天麻鉤藤飲出自《雜病證治新義》，具有平肝潛陽、補(bǔ)益肝腎、清熱活血的作用，是中醫(yī)治療肝陽上亢型高血壓的經(jīng)典方。鉤藤是天麻鉤藤飲中的君藥，在煎藥時要求“后下”，即“候他藥煎就，方入鉤藤”[1]，避免久煎。為此，作者考察了溫度對鉤藤主要有效成分鉤藤總堿的影響，以期為鉤藤總堿的制劑研究提供參考。

1 材料和方法

1.1藥品和儀器 鉤藤，購自廣西。經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系鑒定為鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq) Jacks，按文獻(xiàn)[2]方法用鉤藤提取總堿。鉤藤堿、異鉤藤堿對照品，購自中國藥品生物制品檢定所。高效液相色譜儀，Agilent 1200，Hypersil C1825 cm×4.6 mm色譜柱。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 鉤藤總堿的含量測定:精密稱取鉤藤提取物50 mg加氯仿使溶解，精確加入25 ml 0.01 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)液，在水浴上揮去氯仿，用濾紙過濾，瓶中殘渣用適量蒸餾水洗滌2次，過濾，合并濾液和洗液，加入甲基紅-亞甲藍(lán)混合指示劑2滴，以0.02 mol/L氫氧化鈉溶液滴定，由櫻紅色至黃綠色為終點(diǎn)?？倝A量以鉤藤堿計，每1 ml 0.01 mol/L硫酸溶液相當(dāng)于7.68 mg 鉤藤堿。

鉤藤堿、異鉤藤堿的含量測定:用高效液相色譜法，流動相:甲醇-水(60:40 )含10 mmol/L 三乙胺，HAc調(diào)pH=7.5；流速：1 ml/min；測定波長：254 nm；在所擬色譜條件下，鉤藤堿的理論塔板數(shù)不低于1 500。精密稱取鉤藤堿或異鉤藤堿對照品5 mg，置于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液。分別取對照品溶液1.2、2.0、2.8、3.6、4.4 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下，進(jìn)樣20 μl，進(jìn)行HPLC分析。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A(鉤藤堿)=11.132X-1.232，r=0.999 8

A(異鉤藤堿)=21.243X-2.081，r=0.999 1

根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(線性范圍0.48～1.76 μg)取鉤藤提取物20 mg，用甲醇溶解后濾過，25 ml定容，進(jìn)樣量20 μl。測定鉤藤提取物中鉤藤堿和異鉤藤堿的含量。

2 數(shù)據(jù)處理

所測含量以樣品質(zhì)量占提取物質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)表示。單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett-t檢驗(yàn)，比較不同溫度對提取物各成分含量的影響。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1鉤藤堿和異鉤藤堿的加樣回收率 精密稱取鉤藤提取物約100 mg，甲醇溶解，置100 ml容量瓶中，加入或不加入鉤藤堿或異鉤藤堿對照品溶液20 ml, 稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜加壓濾過，進(jìn)樣，測定鉤藤堿或異鉤藤堿峰面積，去除提取物本底中相應(yīng)的峰面積，計算鉤藤堿或異鉤藤堿含量，連續(xù)測定6次，鉤藤堿和異鉤藤堿的平均回收率分別為(98.2±2.1)%和(96.1±2.5)% (n=6)。

3.2鉤藤總堿的一般性質(zhì) 按文獻(xiàn)方法提取得到鉤藤總堿，共3批，所得鉤藤總堿不溶于水，溶于甲醇、氯仿，溶于聚乙二醇400，在給定的色譜條件下，HPLC性質(zhì)見圖1。

精密稱取鉤藤提取物約100 mg，甲醇溶解，置100 ml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜加壓濾過，測定鉤藤總堿、鉤藤堿和異鉤藤堿含量，結(jié)果見表1。

3.3溫度對鉤藤總堿穩(wěn)定性的影響 精密稱取鉤藤提取物適量，置水中制成混懸液，分別在60 ℃和90 ℃水浴中加熱60 min，放冷至室溫，用氯仿萃取，水浴蒸干，甲醇溶解，測定鉤藤總堿、鉤藤堿和異鉤藤堿的含量，結(jié)果見表1。

圖1 鉤藤提取物(A)與對照品(B)色譜圖

1-鉤藤堿；2-異鉤藤堿

3.4鉤藤堿和異鉤藤堿穩(wěn)定性的比較 鉤藤總堿的主要成分鉤藤堿和異鉤藤堿是同分異構(gòu)體，有報道稱在酸化和加熱條件下可相互轉(zhuǎn)化。筆者觀察了貯存時間、溫度和酸堿度對鉤藤堿和異鉤藤堿穩(wěn)定性的影響。

3.4.1貯存時間的影響 分別取鉤藤堿對照品4.4 mg或異鉤藤堿對照品4.2 mg，用50 ml甲醇溶解，流動相甲醇-水改為80:20，含10 mmol/L 三乙胺，HAc調(diào)pH 至 7.5；進(jìn)樣10 μl。冷藏4 ℃ 6 d后再次進(jìn)樣見圖2。結(jié)果表明，鉤藤堿沒有新的雜質(zhì)生成，而異鉤藤堿原有雜質(zhì)含量增加，表明在給定的貯存條件下，鉤藤堿比較穩(wěn)定。

3.4.2溫度的影響 分別取鉤藤堿對照品4.4 mg或異鉤藤堿對照品4.2 mg，用50 ml甲醇溶解，流動相甲醇-水(80:20)，含10 mmol/L 三乙胺，HAc調(diào)pH 至 7.5；進(jìn)樣10 μl。置60 ℃水浴2 h后再次進(jìn)樣，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，鉤藤堿沒有新的雜質(zhì)生成，而異鉤藤堿原有雜質(zhì)含量增加，表明在給定的溫度作用下，鉤藤堿比較穩(wěn)定。

3.4.3酸堿度的影響 取鉤藤堿對照品4.4 mg和異鉤藤堿對照品4.2 mg，混合，用甲醇溶解，分別直接稀釋或用氨水或醋酸調(diào)pH至9.0、7.5或4.0，25ml定容，流動相甲醇-水(80:20)，含10 mmol/L 三乙胺，HAc調(diào)pH 至 7.5；進(jìn)樣10 μl，結(jié)果見圖3。將pH9.0、pH7.5和pH4.0的稀釋液冷藏4 ℃ 6 d后調(diào)pH7.5再次進(jìn)樣，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，pH4.0的稀釋液中鉤藤堿和異鉤藤堿都穩(wěn)定，但pH7.5、pH9.0的稀釋液中雜質(zhì)含量增加。

圖2 溫度對鉤藤堿(A)和異鉤藤堿(B)影響的色譜圖

圖3 酸堿度對鉤藤堿和異鉤藤堿混合物影響的色譜圖

A-pH4.0；B-pH7.5；C-pH9.0；D-pH4.0， 6d后調(diào)pH7.5；E-pH7.5， 6d后；1- 鉤藤堿；2-異鉤藤堿

4 討論

鉤藤的藥理作用包括降壓、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等[3]，在天麻鉤藤飲和羚角鉤藤湯等成方中都作為君藥使用。由于其有效成分性質(zhì)不穩(wěn)定，在使用時有特殊要求，如天麻鉤藤飲要求鉤藤“后下”[1]，鉤藤茶要求即沖即飲等。相關(guān)研究也多有報道，早在上世紀(jì)50年代，有文獻(xiàn)指出[4]鉤藤煎煮20 min其降壓有效成分就有部分破壞，導(dǎo)致其降壓作用減弱。鉤藤中的生物堿是鉤藤降壓的主要有效成分，其作用強(qiáng)度順序是異鉤藤堿>鉤藤堿>鉤藤總堿[5]，可見，異鉤藤堿和鉤藤堿的穩(wěn)定性是決定其降壓作用的主要因素。鉤藤堿和異鉤藤堿占鉤藤總堿的含量分別為28.9%和14.7%[6]，用目前的提取方法[2]得到的主要有效成分(表1)約為實(shí)際含量的一半。鉤藤堿和異鉤藤堿是同分異構(gòu)體，在一定條件下可相互轉(zhuǎn)化，例如，在煎煮過程中酸化可使異鉤藤堿可轉(zhuǎn)化為鉤藤堿[7]，也有報道認(rèn)為煎煮過程中有新的成分產(chǎn)生[8]。這些成分的不穩(wěn)定性可導(dǎo)致鉤藤藥理作用的變化，掌握其變化規(guī)律對指導(dǎo)鉤藤制劑的研究有實(shí)際意義。

溫度對鉤藤總堿穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加熱對鉤藤總堿和鉤藤堿的影響并不顯著，但異鉤藤堿隨溫度升高導(dǎo)致含量明顯降低，說明異鉤藤堿在加熱條件下分解或轉(zhuǎn)化為其他堿性成分。從鉤藤堿與異鉤藤堿穩(wěn)定性的比較實(shí)驗(yàn)中可以看出，在相同的貯存條件下，鉤藤堿相對穩(wěn)定，異鉤藤堿隨貯存時間延長和溫度升高，其高效液相圖譜中有兩個雜質(zhì)峰出現(xiàn)(圖2 B1、B2、B3)，其中一個保留時間的位置與鉤藤堿的位置相同，這與文獻(xiàn)報道一致[7]。這些結(jié)果表明，鉤藤總堿對熱的確不穩(wěn)定，鉤藤堿與異鉤藤堿相比，后者更不穩(wěn)定，提示制劑研究時需考慮將總堿和鉤藤堿作為定量指標(biāo)。值得指出的是，在4 ℃相同貯存條件下，酸性條件下(pH4)鉤藤堿和異鉤藤堿混合物的穩(wěn)定性優(yōu)于堿性環(huán)境(圖3)，提示鉤藤堿和異鉤藤堿成鹽后較穩(wěn)定。

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2010-11-20

[修回日期] 2011-06-28

Studiesonthermalstabilityoftotalalkaloidsinrhynchophylline

LIU Wei1, YANG Xue-ping1, WANG Zhong-shi1，2，WANG Meng1, ZHANG Qiang1, HAO Li-yong2

(1. No.88 Hospital of PLA, Taian 271000，China; 2. Taishan Medical College, Taian 271000，China)

ObjectiveTo investigate the effect of heating on total alkaloids inrhynchphylla.MethodsHPLC was employed to determine rhynchophylline and isorhynchophylline in total alkaloids among various conditions.ResultsComparing with rhynchophylline, isorhynchophylline was unstable to heating. Heated in 60 ℃ and 90 ℃ for 2 hours, isorhynchophylline content decreased more than 38% and 50%, respectively. But rhynchophylline solution was stable in 60 ℃ for 2 hours and 4 ℃ for 6 days. In addition, rhynchophylline and isorhynchophylline were more stable in salt formation.ConclusionIsorhynchophylline was unstable to heating, which was the reason forrhynchophyllato given later.in decoct herbal medicine.

rhynchophylline；isorhynchophylline；rhynchphylla total alkaloids

山東省科技發(fā)展計劃項目(2008GG2NS02006).

劉 衛(wèi)(1967-)，男，主任藥師.Tel: (0538)8839329, E-mail:liutrunk@hotmail.com.

R931.6

A

1006-0111(2011)06-0442-03

1)P<0.05，與常溫比較