不同煎煮方法對(duì)麻杏石甘湯中成分變化研究

饒 毅，張五萍，魏惠珍，高 萌，金浩鑫，王躍生

(1.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西南昌 330006;2.江西省人民醫(yī)院，江西南昌 330006;3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330006;4.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

麻杏石甘湯源自漢代張仲景的《傷寒論》，由麻黃、杏仁、石膏、炙甘草四味藥組成。煎煮方法為:“上四味，以水七升，煮麻黃，減二升，去上沫，納諸藥，煮取二升，去滓?！奔绰辄S先煎。石膏為礦物質(zhì)藥，質(zhì)重、堅(jiān)硬、難以煎出藥味的藥物應(yīng)先煎［1］，《中國藥典》中亦規(guī)定石膏的用法為先煎［2］?！吨袊幍洹?010年版中記載小兒清熱口服液采用麻黃石膏先煎。目前對(duì)麻杏石甘湯先煎的合理性及必要性存在較大爭議［3-7］，因此對(duì)目前存在的3種煎煮方法 (麻黃先煎、石膏先煎、麻黃石膏先煎)的合理性進(jìn)行研究。麻黃堿、偽麻黃堿、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷、鈣及金屬元素為麻杏石甘湯主要藥效成分［9-10］。本實(shí)驗(yàn)通過固定湯劑煎煮時(shí)間，以合煎為參照，湯劑中除Ca外的金屬元素含有量較低，Mg、Zn、Mn、V含有量最高，研究通過測定各藥效成分及這幾種金屬元素的量，從化學(xué)成分的角度考察確定最優(yōu)的煎煮方法，為麻杏石甘湯臨床用煎煮方式提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters2695-2996高效液相色譜儀(PDA檢測器);Agilent 1100高效液相色譜儀(DAD檢測器);Optima-5300DV型等離子體發(fā)射光譜儀 (美國PerkinElmer公司);Millipore-Q純水器 (美國MILLIPORE公司);KDM型調(diào)溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 材料 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸均由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用。生麻黃、生石膏、炙甘草飲片購于北京市雙橋燕京飲片廠，苦杏仁購于江中(武寧)中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院付曉梅教授鑒定。

Ca(鈣)、Mg(鎂)、Zn(鋅)、Mn(錳)、V(釩)標(biāo)準(zhǔn)液，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供，100 μg/mL，臨用時(shí)用1%HNO3(體積分?jǐn)?shù))配制成應(yīng)用液。

甲醇、乙腈為色譜純，高氯酸、硝酸為優(yōu)級(jí)純，氨水、乙醚、磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 湯劑的煎煮方法

2.1.1 麻黃先煎 稱取麻黃24 g，加水1344 mL，開始煎煮，待沸騰后，調(diào)整煎煮火候至文火煎煮30 min后，再加入苦杏仁24 g、甘草24 g、石膏96 g，文火繼續(xù)煎煮40 min，紗布濾過，即得。

2.1.2 石膏先煎 稱取石膏96 g，加水1344 mL，開始煎煮，待沸騰后，調(diào)整煎煮火候至文火煎煮30 min后，再加入麻黃24 g、苦杏仁24 g、甘草24 g，文火繼續(xù)煎煮40 min，紗布濾過，即得。

2.1.3 麻黃石膏先煎 稱取麻黃24 g、石膏96 g，加水1344 mL，開始煎煮，待沸騰后，調(diào)整煎煮火候至文火煎煮30 min后，再加入苦杏仁24 g，甘草24 g，文火繼續(xù)煎煮40 min，紗布濾過，即得。

2.1.4 合煎 稱取麻黃24 g、苦杏仁24 g、甘草24 g、石膏96 g，加水1344 mL，開始煎煮，待沸騰后，調(diào)整煎煮火候至文火煎煮40 min，紗布濾過，即得。

2.2 麻杏石甘湯中麻黃堿、偽麻黃堿測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取麻杏石甘湯10 mL至50 mL量瓶中，加甲醇35 mL，超聲30 min，放冷后，用甲醇定容至刻度，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含0.051 mg麻黃堿、0.0454 mg偽麻黃堿的溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察 對(duì)麻黃堿、偽麻黃堿進(jìn)行了方法學(xué)指標(biāo)考察，結(jié)果麻黃堿回歸方程為y=25330x－1586，r=0.9998，偽麻黃堿回歸方程為y=16525x－532.18，r=0.9999;線性范圍分別為0.0510 ～2.040 μg、0.0454 ～1.8160 μg;精密度試驗(yàn)兩者的RSD分別為0.57%、1.08%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為1.94%、1.24%;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD分別為0.76%、0.74%;平均回收率分別為99.60%、99.03%，RSD分別為1.27%、1.96%。

2.2.4 樣品測定 流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(5∶95)，檢測波長207 nm，柱溫為室溫;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 麻杏石甘湯中麻黃堿、偽麻黃堿測定色譜圖Fig.1 Chromatograms of ephedrine and pseudoephedrine

2.3 麻杏石甘湯中苦杏仁苷測定

2.3.1 供試品的制備 精密量取煎煮液5 mL，加氨水5 mL，渦旋混合1 min，超速離心 (12000 r/min，3 min)后取上清液以乙醚洗滌2次 (每次10 mL)，棄去醚層，將水層置氮?dú)饬飨麓蹈?，殘?jiān)蛹状? mL溶解，超速離心后取上清液，即得。

2.3.2 對(duì)照品的配制 精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量，用甲醇配制為每1 mL含0.0431 mg苦杏仁苷的溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察 對(duì)苦杏仁苷進(jìn)行了方法學(xué)指標(biāo)考察，結(jié)果苦杏仁苷回歸方程為y=28837x－1305，r=0.9999，線性范圍分別為0.0431～1.724 μg;精密度試驗(yàn)RSD為1.06%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD為1.37%;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.83%;平均回收率為98.75%，RSD為2.97%。

2.3.4 樣品測定 流動(dòng)相為甲醇-水 (20∶80)，檢測波長207nm;柱溫為室溫;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 麻杏石甘湯中苦杏仁苷測定色譜圖Fig.2 Chromatograms of amygdalin

2.4 麻杏石甘湯中甘草苷、甘草酸測定

2.4.1 供試品的制備 同麻黃堿、偽麻黃堿供試品的制備。

2.4.2 對(duì)照品的配制 稱取甘草苷、甘草酸對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含0.02032 mg甘草苷、0.08445 mg甘草酸對(duì)照品溶液 (甘草酸對(duì)照品質(zhì)量濃度=甘草酸銨對(duì)照品質(zhì)量濃度/1.0207)。

2.4.3 方法學(xué)考察 對(duì)甘草苷、甘草酸進(jìn)行了方法學(xué)指標(biāo)考察，結(jié)果甘草苷回歸方程為y=44043x+11448，r=0.9998，甘草酸為 y=137754x+466.33，r=0.9998，線性范圍分別為0.0203 ～0.8128 μg、0.0845～3.37804 μg;精密度試驗(yàn) RSD分別為1.29%、2.01%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為2.54%、2.89%;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD分別為1.09%、0.74%;平均回收率分別為99.29%、100.75%，RSD分別為2.54%、2.86%。

2.4.4 樣品測定 流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，進(jìn)行梯度洗脫 ［0 min，乙腈-0.1%磷酸 (18∶82);10 min，乙腈-0.1%磷酸 (18∶82);40 min，乙腈-0.1%磷酸 (40∶60);60 min，乙腈-0.1%磷酸(40∶60)］;檢測波長237 nm;柱溫為室溫;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL。色譜圖如圖3。

圖3 麻杏石甘湯中甘草苷、甘草酸測定色譜圖Fig.3 Chromatograms of liquiritin and glycyrrhetinic acid

2.5 麻杏石甘湯中金屬元素測定

2.5.1 供試品的制備 精密量取麻杏石甘湯水煎液5 mL，加入硝酸-高氯酸 (4∶1)混合酸10 mL，電熱套加熱蒸發(fā)至無白煙，液體應(yīng)澄清，冷卻后用2%硝酸定容至25 mL。平行制備空白溶液，待測(所使用的玻璃儀器均在10%硝酸浸泡過夜，并用超純水清洗)。

2.5.2 樣品測定 采用ICP-AES，Ca分析波長為317.933 nm;Mg為279.077 nm;Zn為213.857 nm;Mn為257.610 nm;V為290.880 nm。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，化學(xué)工作站自動(dòng)繪制校正曲線，確認(rèn)后進(jìn)行樣品測定。將測定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計(jì)算，求得待測液濃度。

2.5.3 方法學(xué)考察 對(duì)各元素進(jìn)行了方法學(xué)指標(biāo)考察，將Ca、Mg元素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0、0.1、1、10、20、50、100 mg/L;Zn、Mn、V元素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別0、0.1、1、5、10 mg/L。在選定的儀器操作下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，工作站自動(dòng)繪制工作曲線，得到各元素回歸方程Ca y=12936x+3139.4，r=0.9999;Mg y=1784.7x+1417.4，r=0.9995;Zn y=3439.2x+566.29，r=0.9993;Mn y=160223x+15561，r=0.9994;V y=17409x+1762.7，r=0.9994;精密度試驗(yàn)RSD分別為0.78%、1.82%、0.94%、0.95%、0.95%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為1.72%、1.07%、2.73%、3.93%、2.06%;平均回收率分別為94.50%、95.63%、95.83%、94.44%、98.18%，RSD分別為 1.98%、1.02%、3.88%、4.56%、2.94%。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)各組數(shù)據(jù)與合煎進(jìn)行組組間分析比較，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示。

2.7 樣品測定結(jié)果 見表1～2。

表1 不同煎煮方式中各藥效成分的量 (n=3)Tab.1 Active components amount of different herbs decocted first(n=3)

表2 不同煎煮方式中5種元素的量 (n=3)Tab.2 Five trace elements’content of different herbs decoted first(n=3)

3 討論

3.1 麻黃的藥效成分之一偽麻黃堿難溶于水［11］，先煎有利于偽麻黃堿的溶出［6］。通過對(duì)4種煎煮方法的比較得到:麻黃先煎與麻黃石膏先煎，都有利于麻黃堿、偽麻黃堿成分的溶出。前3種煎煮方法與合煎相比，對(duì)甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷的溶出量影響不大。

3.2 ICP-AES［12］具有多元素同時(shí)測定、速度快及線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，是中藥金屬元素通常使用的檢測方法。從表2可見，麻黃石膏先煎中金屬元素量最高，表示麻黃石膏先煎最有利于金屬元素的溶出，可能由于麻黃石膏先煎有利于麻黃堿與Zn2+、Mn2+等金屬離子形成了金屬絡(luò)合物，從而增加了5種元素的溶出量［13］。

3.3 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明麻黃石膏先煎有利于麻黃堿、偽麻黃堿的及金屬元素的溶出。由于各元素來源廣泛，含有量較低，造成研究較為困難，特別是體內(nèi)研究本體干擾大。整體而言，目前對(duì)各元素在中藥中發(fā)揮的作用研究偏少，造成各元素發(fā)揮的具體作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)從化學(xué)成分量的角度分析了麻黃石膏先煎的合理性，為研究麻杏石甘湯中無機(jī)元素與療效之間的內(nèi)在聯(lián)系提供參考，為麻杏石甘湯臨床使用提供參考依據(jù)。

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